響應(yīng)面法優(yōu)化酶解花椒籽蛋白制備降血壓肽工藝

吳紅洋，姜太玲，胡惠茗，楊承志，張志清*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

響應(yīng)面法優(yōu)化酶解花椒籽蛋白制備降血壓肽工藝

吳紅洋，姜太玲，胡惠茗，楊承志，張志清*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解花椒籽蛋白制備降血壓肽的工藝條件。采用不同蛋白酶水解花椒籽蛋白，以酶解物對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制率為指標(biāo)，篩選出制備花椒籽蛋白降血壓肽的最佳蛋白酶。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，考察酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度和pH值對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率的影響。結(jié)果表明：回歸模型能較好地反映各因素水平與響應(yīng)值之間的關(guān)系，并獲得酶解花椒籽蛋白制備降血壓肽的最佳工藝條件為：底物質(zhì)量濃度3 g/100 mL、酶解時(shí)間4.9 h、加酶量10 200 U/g、酶解溫度37.4 ℃、pH 6.9，在此條件下，所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為68.00%。

花椒籽蛋白；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；降血壓肽；響應(yīng)面法

高血壓是人類醫(yī)學(xué)界面臨的一大難題，目前治療高血壓主要是服用化學(xué)合成的藥物，但是高血壓患者長期服用合成藥會產(chǎn)生各種不適的副作用：如咳嗽、味覺功能紊亂、皮疹等。因此，醫(yī)務(wù)人員與患者更青睞于非化學(xué)合成藥物的輔助降壓，其中利用天然蛋白質(zhì)制備的降血壓肽由于安全性高、無毒副作用已成為降血壓研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。降血壓肽又稱為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽（angiotensin converting enzyme inhibitor peptides，ACEIPs），是具有降血壓活性的生物活性肽。它通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的活性從而起到降血壓的效果，對原發(fā)性高血壓患者具有顯著作用，而對高血壓正常者無降壓作用[1]。目前，國內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)大豆、紫菜、牛乳、玉米等天然蛋白水解肽對ACE具有抑制作用[2-7]。

花椒籽中富含蛋白質(zhì)，其脫脂后的花椒籽種仁中蛋白質(zhì)含量高達(dá)60.34%[8]。脫脂花椒仁、花椒餅蛋白質(zhì)中的氨基酸組成較齊全，各種必需氨基酸的含量較高。與大豆相比，除賴氨酸含量較低外，其余氨基酸的含量都高于大豆，是一種較完全的新型蛋白質(zhì)資源。隨著我國花椒出口量的增加，種植面積的快速增長，花椒籽的大量廢棄造成了很大的資源浪費(fèi)。目前，對花椒籽的利用研究主要是從花椒籽中提取花椒籽油[9-11]和優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取工藝[12-13]，而關(guān)于花椒籽蛋白制備降血壓肽的研究還未見報(bào)道。以花椒籽蛋白為原料生產(chǎn)降血壓肽成本低、安全性高，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)為花椒籽的高附加值利用提供了新的途徑。

本實(shí)驗(yàn)選用5 種不同蛋白酶分別對花椒籽蛋白進(jìn)行酶解，以ACE抑制率為分析指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定制備花椒籽蛋白降血壓肽的酶解條件，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其酶解條件，為花椒籽蛋白降血壓肽的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶從豬肺中提取。

胰蛋白酶（酶活力為2.5×105U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力為2.0×105U/g）、中性蛋白酶（酶活力為6.0×104U/g） 北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶（酶活力為1.0×105U/g）、復(fù)合蛋白酶（酶活力為1.2×105U/g） 南京奧多福尼生物科技有限公司；卡托普利 上?；氏箬F力藍(lán)天制藥有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-his-leu，HHL） 美國Sigma公司；馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；NaOH、HCl、NaCl、硼酸、乙酸乙酯、聚乙二醇20000等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3100紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；BR4i冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 榮華儀器制造有限公司；CP225D型電子天平、BP-20pH計(jì) 德國Sartorius公司；Scientz-N型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒籽蛋白酶解制備降血壓肽的工藝流程

花椒籽蛋白→預(yù)處理（90～100 ℃，10 min）→不同條件下酶解→滅酶（90～100℃，10 min）→冷卻→離心（5 000 r/min，10 min）→收集上清液（測定ACE抑制活性）→凍干

1.3.2 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的制備[14]

取一定量的新鮮豬肺，洗凈，加入預(yù)冷的硼酸鹽緩沖液于組織搗碎機(jī)勻漿，漿液在4 ℃冰箱中靜置5 h后離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min）得上清液。將上清液用硫酸銨分級沉淀后進(jìn)行透析，并用聚乙二醇20000濃縮，真空冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

酶活力定義：37 ℃條件下，1 min內(nèi)催化形成1 μmol馬尿素所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。酶活檢測采用Cushman等[15]的方法。

酶比活力：每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力，單位是U/mg。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.3.3 ACE抑制率的測定

參照Cushman等[15]的體外檢測法，并進(jìn)行改進(jìn)。在2 mL離心管中混合40 μL樣品液和80 μL 0.005 mol/L的HHL溶液（由0.3 mol/L NaCl、0.1 mol/L、pH 8.3的硼酸鹽緩沖液配制），然后加入20 μL 0.048 U/mL ACE啟動反應(yīng)，37 ℃恒溫保持60 min，加入0.2 mL l mol/L的HCl終止反應(yīng)，再加入1.5 mL冷凍后的乙酸乙酯，用力振蕩混合，4 000 r/min離心10 min后，吸取1.0 mL的乙酸乙酯層（上層）移入試管中，在80～90 ℃的烘箱中烘干，再加入4 mL 1 mol/L NaCl溶液溶解馬尿酸，溶液在228 nm波長處測定OD值。對照組除不加入抑制劑、空白組除在反應(yīng)前先加入0.2 mL l mol/L的鹽酸以終止反應(yīng)外，其余操作與反應(yīng)管完全相同。ACE抑制率計(jì)算公式如下。

式中：ODA、ODB、ODC分別為對照組、樣品組、空白組體系在228 nm波長處的OD值。

1.3.4 最佳蛋白酶的選擇

選擇胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶5 種蛋白酶分別對花椒籽蛋白進(jìn)行單酶水解。水解條件：底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL，加酶量10 000 U/g，在各蛋白酶最適溫度和pH值條件下，酶解3 h，以ACE抑制率為評價(jià)指標(biāo)，篩選出酶解花椒籽蛋白制備降血壓肽的最佳蛋白酶。

1.3.5 酶解單因素試驗(yàn)

利用篩選出的蛋白酶酶解花椒籽蛋白，在加酶量10 000 U/g，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度37 ℃，pH 7.0時(shí)，考察底物質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 g/100 mL）對ACE抑制率的影響；在加酶量10 000 U/g，酶解溫度37 ℃，pH 7.0，底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL時(shí)，考察酶解時(shí)間（3、4、5、6、7 h）對ACE抑制率的影響；在酶解時(shí)間4 h，酶解溫度37 ℃，pH 7.0時(shí)，底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL時(shí)，考察加酶量（2 000、6 000、10 000、14 000、18 000 U/g）對ACE抑制率的影響；在加酶量10 000 U/g，酶解時(shí)間4 h，pH 7.0時(shí)，底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL時(shí)，考察酶解溫度（30、35、37、40、45 ℃）對ACE抑制率的影響；在加酶量10 000 U/g，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度37 ℃，底物質(zhì)量濃度為1 g/100 mL時(shí)，考察pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）對ACE抑制率的影響。確定最佳單因素水平。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對ACE抑制率影響較大的因素進(jìn)行考察，以酶解液對ACE的抑制率為響應(yīng)指標(biāo)，篩選出最佳酶解工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的制備

2.1.1 自制ACE活性的測定

經(jīng)測定，自制ACE的酶活力為9.58×10-3U，蛋白質(zhì)含量為0.33%，比活力為29.03×10-3U/mg。在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利的抑制下，ACE酶活下降，馬尿酸的生成量由無抑制劑存在條件下的0.46 μmol減少到0.25 μmol，測得卡托普利的抑制率為41.32%。結(jié)果表明自制ACE可用于降血壓肽活性的檢測。

2.1.2 自制ACE與商品ACE的比較

為了解自制ACE與商品ACE的效果差異，將木瓜蛋白酶酶解花椒籽得到的降血壓肽分別對這兩種ACE的活性進(jìn)行抑制，抑制率分別為49.69%和59.13%?；ń纷训鞍捉笛獕弘膶ψ灾艫CE的抑制效果低于對商品ACE的抑制效果，說明自制的ACE與商品ACE存在一定差距，這可能是因?yàn)樽灾艫CE是粗酶液，沒有經(jīng)過進(jìn)一步的純化，含雜質(zhì)較多，影響了反應(yīng)過程中降血壓肽或HHL與ACE結(jié)合位點(diǎn)的反應(yīng)。

2.2 花椒籽蛋白酶解制備降血壓肽最佳蛋白酶的篩選種類最適條件ACE抑制率/%

表1 不同蛋白酶作用下降血壓肽的ACE抑制率Table1 ACE inhibition rates of antihypertensive peptides prepared with different enzymes

由表1可知，5 種蛋白酶的酶解產(chǎn)物對ACE均有抑制效果，其中木瓜蛋白酶的ACE抑制率最高，為49.69%，即降血壓效果最好；其次為中性蛋白酶和胰蛋白酶，分別為37.90%和30.85%；效果最差的是復(fù)合蛋白酶，ACE抑制率僅為10.59%，這可能是因?yàn)閺?fù)合蛋白酶在酶解花椒籽蛋白質(zhì)過程中使具有ACE抑制活性的肽段降解成更小的肽段或氨基酸從而導(dǎo)致ACE抑制活性降低。因此確定木瓜蛋白酶為酶解花椒籽蛋白制備降血壓肽的最佳蛋白酶。

2.3 木瓜蛋白酶酶解花椒籽蛋白制備降血壓肽的單因素試驗(yàn)

2.3.1 底物質(zhì)量濃度對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響

圖1 底物質(zhì)量濃度對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of substrate concentrations on ACE inhibitory activity of Sichuan pepper seed protein hydrolysate

由圖1可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增大，ACE抑制率呈先上升后下降的趨勢。在底物質(zhì)量濃度為4 g/100 mL時(shí)，酶解液的ACE抑制率最大，達(dá)到64.31%；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度繼續(xù)增大，ACE抑制率反而下降，可能是因?yàn)檫^高的底物質(zhì)量濃度易造成水解液黏度增大，影響蛋白酶的擴(kuò)散，對水解反應(yīng)有抑制作用[16]?？紤]到底物質(zhì)量濃度對ACE抑制率的影響總體變化趨勢不大，確定其酶解的底物質(zhì)量濃度為3 g/100 mL。

2.3.2 酶解時(shí)間對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響

圖2 酶解時(shí)間對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on ACE inhibitory activity of Sichuan pepper seed protein hydrolysate

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長，ACE抑制率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶解時(shí)間為5 h時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大，為62.10%，之后反而下降，這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長，導(dǎo)致酶解程度太大，產(chǎn)物中的游離氨基酸相對含量增加，具有ACE抑制率的肽被進(jìn)一步水解，而破壞了其具有ACE抑制活性的肽段結(jié)構(gòu)上的完整特征[17]。

2.3.3 加酶量對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響

圖3 加酶量對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on ACE inhibitory activity of Sichuan pepper seed protein hydrolysate

由圖3可知，隨著加酶量的增加，ACE抑制率呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)加酶量為10 000 U/g時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最高，為56.46%，繼續(xù)增加加酶量，ACE抑制率下降，這可能是因?yàn)樵诿笣舛容^低時(shí)，酶分子所能結(jié)合的底物少，而過量的蛋白酶使一部分具有ACE抑制活性的小肽被降解為活性較小的肽或者氨基酸，從而降低對ACE的抑制性。

2.3.4 酶解溫度對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響

圖4 酶解溫度對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity of Sichuan pepper seed protein hydrolysate

由圖4可知，當(dāng)溫度從30 ℃升高至37 ℃，ACE抑制率隨著溫度的升高而增大，繼續(xù)升高溫度，ACE抑制率呈下降趨勢，在45 ℃時(shí)ACE抑制率很低，僅為9.85%。這可能是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi)溫度上升有利于酶解的進(jìn)一步進(jìn)行，但溫度過高會導(dǎo)致酶變性，使酶活性減弱，從而使酶水解蛋白質(zhì)的反應(yīng)速度下降，ACE抑制率急劇下降。

2.3.5 pH值對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響

圖5 pH值對花椒籽蛋白ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis pH on ACE inhibitory activity of Sichuan pepper seed protein hydrolysate

由圖5可知，隨著pH值的升高，ACE抑制率也逐漸升高，當(dāng)pH值為7.0時(shí)ACE抑制率達(dá)到最高，為56.8%，之后反而下降。這是因?yàn)閜H值過高會使酶失活從而影響酶的作用效果。

通過單因素試驗(yàn)分析可知，酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度和pH值這4 個(gè)因素對ACE抑制率的影響較為顯著。單因素試驗(yàn)確定酶解制備花椒籽蛋白降血壓肽的最適條件為：底物質(zhì)量濃度3 g/100 mL，酶解時(shí)間5 h，加酶量10 000 U/g，酶解溫度37 ℃，pH 7.0，此結(jié)果可為響應(yīng)面試驗(yàn)因素零點(diǎn)設(shè)定提供參考，以此為基礎(chǔ)來選擇最低值和最高值。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化花椒籽蛋白的酶解條件

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇對花椒籽蛋白ACE抑制率影響較大的因素酶解時(shí)間（X1）、加酶量（X2）、酶解溫度（X3）、pH值（X4）為自變量，以ACE抑制率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

采用Design Expert 7.0.0軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)回歸分析，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Behnken experimental design and results

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table3 Analysis of variance for the response surface quadratic model

通過表2響應(yīng)面分析得到ACE抑制率的回歸方程為：Y=66.50-3.22X1+3.45X2-1.40X3-3.54X4+1.23X1X2+

由表3可知，模型F=144.80＞F0.01（14,4）=14.24，P＜0.000 1，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)F=2.98＜F0.05（10,4）= 5.96，P=0.152 4＞0.05，差異不顯著，說明未知因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，實(shí)驗(yàn)誤差主要來源于隨機(jī)誤差。由統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出模型的確定系數(shù)R2=0.993 1，調(diào)整系數(shù)0.986 3，說明該模型能解釋98.63%響應(yīng)值的變化，因而擬合度好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型對ACE抑制率進(jìn)行分析和預(yù)測。對模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：一次項(xiàng)X1、X2、X3、X4，交互項(xiàng)X1X4、X3X4均極顯著，X2X3、X2X4顯著，X1X2、X1X3不顯著，平方項(xiàng)顯著。因此，各個(gè)因素對ACE抑制率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.4.2 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

圖6 各因素之間交互作用對花椒籽蛋白酶解條件影響的響應(yīng)面圖Table6 Response surface plots showing the interactive effects of hydrolysis parameters on ACE inhibitory activity of Sichuan pepper seed protein hydrolysate interactive effects between the factors

由圖6A可知，固定加酶量為10 000 U/g，酶解溫度為37.5 ℃，當(dāng)pH值處于較低和較高水平時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，ACE抑制率先升高后下降，升高和下降幅度都很明顯；當(dāng)酶解時(shí)間處于較低水平時(shí)，ACE抑制率隨著pH值的升高先緩慢升高后下降。酶解時(shí)間和pH值之間交互作用顯著。

由圖6B可知，固定酶解時(shí)間為5 h，pH值為7.0，當(dāng)加酶量處于較低水平時(shí)，隨著酶解溫度的升高，ACE抑制率變化不大，當(dāng)加酶量處于中等水平時(shí)，隨著酶解溫度的升高，ACE抑制率平穩(wěn)升高；當(dāng)酶解溫度處于較低和較高水平時(shí)，隨著加酶量的增加，ACE抑制率先急劇升高后緩慢下降。酶解溫度和加酶量之間的交互作用顯著。

由圖6C可知，固定酶解時(shí)間為5 h，酶解溫度為37.5 ℃，當(dāng)加酶量處于較低水平時(shí)，隨著pH值的升高，ACE抑制率先緩慢升高后急劇下降，當(dāng)加酶量處于較高水平時(shí)，隨著pH值的升高，ACE抑制率先升高后下降，變化幅度不明顯；當(dāng)pH值處于較低水平時(shí)，隨著加酶量的升高，ACE抑制率先升高后緩慢下降，當(dāng)pH值處于中等水平時(shí)，隨著加酶量的升高，ACE抑制率處于較高水平。加酶量和pH值之間的交互作用顯著。

由圖6D可知，固定酶解為5 h，加酶量為10 000 U/g，當(dāng)酶解溫度處于較低水平時(shí)，隨著pH值的增加ACE抑制率先升高后緩慢下降，當(dāng)酶解溫度處于較高水平時(shí)，ACE抑制率隨著pH值的增加先緩慢升高后急劇下降；當(dāng)pH值處于較低水平時(shí)，隨著酶解溫度的升高，ACE抑制率逐漸升高并趨于平穩(wěn)，當(dāng)pH值處于較高水平時(shí)，隨著酶解溫度的升高，ACE抑制率先緩慢升高后逐漸下降。酶解溫度和pH值之間的交互作用顯著。

通過模型優(yōu)化得出花椒籽蛋白的酶解最優(yōu)條件為：酶解時(shí)間4.91 h、加酶量10 262.52 U/g、酶解溫度37.33 ℃、pH 6.92，此條件下ACE抑制率為67.20%。

2.4.3 酶解工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行降血壓肽的制備，考慮到實(shí)際操作的方便，將參數(shù)修正為酶解時(shí)間4.9 h、加酶量10 200 U/g、酶解溫度為37.4 ℃、pH值為6.9，測得ACE抑制率為68.00%，與理論預(yù)測值的相對誤差在1.19%左右。因此，響應(yīng)面法所得的優(yōu)化酶解條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以花椒籽蛋白為原料，篩選出了制備花椒籽蛋白降血壓肽的最佳蛋白酶，并通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了花椒籽蛋白制備降血壓肽的酶解條件，獲得了ACE抑制活性較高的產(chǎn)物，促進(jìn)了花椒籽的再利用和深加工，為花椒籽高附加值的利用提供了新途徑。酶解法制備花椒籽蛋白降血壓肽實(shí)驗(yàn)條件溫和，易于控制，操作方便安全，經(jīng)濟(jì)可行，且不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，可以為花椒籽蛋白降血壓肽應(yīng)用到保健食品領(lǐng)域提供一定的理論依據(jù)。由于酶解產(chǎn)物的水解度和ACE抑制率沒有顯著的線性關(guān)系[18-20]，所以本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行水解度的測定。為了獲得純度更高、ACE抑制效果更好的降血壓肽，還需進(jìn)一步的深入研究，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化；對純化前后的產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸組成分析和測定分子質(zhì)量；研究降血壓肽的理化性質(zhì)；分析具有ACE抑制活性的肽段結(jié)構(gòu)組成和分布等。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨分級法從豬肺中提取ACE，經(jīng)初步純化濃縮后ACE的酶活力為9.58×10-3U，蛋白質(zhì)含量0.33%，酶比活力為29.03×10-3U/mg，與商品ACE相比存在一定差距，但可用于本實(shí)驗(yàn)中ACE抑制率的測定。通過比較不同蛋白酶水解花椒籽蛋白的效果，篩選出制備花椒籽蛋白降血壓肽的最佳蛋白酶為木瓜蛋白酶。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理得到了ACE抑制率與酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度和pH值的回歸模型，經(jīng)過驗(yàn)證此模型是合理有效的，可以較好地預(yù)測ACE抑制率。根據(jù)回歸方程得到了酶解花椒籽蛋白制備降血壓肽的最佳工藝條件為：底物質(zhì)量濃度3 g/100 mL、酶解時(shí)間4.91 h、加酶量10 262.52 U/g、酶解溫度37.33 ℃、pH 6.92，所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為67.20%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將酶解工藝參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)修正為底物質(zhì)量濃度3 g/100 mL、酶解時(shí)間4.9 h、加酶量10 200 U/g、酶解溫度37.4 ℃、pH 6.9，所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為68.00%。因此，利用響應(yīng)面分析法對花椒籽蛋白降血壓肽的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效減少操作的盲目性，從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

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Response Surface Methodology for Optimization of Hydrolysis Conditions for Preparing Antihypertensive Peptides Sichuan Pepper (Zanthoxylum bungeanum) Seed Protein

WU Hong-yang, JIANG Tai-ling, HU Hui-ming, YANG Cheng-zhi, ZHANG Zhi-qing*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Response surface methodology was used to optimize the hydrolysis conditions of Sichuan pepper (Zanthoxylum bungeanum) seed protein to prepare antihypertensive peptides. Papain was found to be the best enzyme for the enzymatic preparation of antihypertensive peptides with angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity. The ACE inhibitory activity of enzymatic hydrolysates of Sichuan pepper seed protein was investigated as a function of hydrolysis time, enzyme dosage, temperature and pH. The results indicated that the obtained regression model represented the functional relationship well, and the optimal hydrolysis conditions were found as follows: substrate concentration, 3 g/100 mL; hydrolysis time, 4.9 h; enzyme dosage, 10 200 U/g; hydrolysis temperature, 37.4 ℃; and pH, 6.9, resulting in an ACE inhibitory rate of 68.00%.

Sichuan pepper seed protein; angiotensin converting enzyme; antihypertensive peptides; response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630（2014）21-0180-06

10.7506/spkx1002-6630-201421035

2013-12-11

吳紅洋（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称?。E-mail：751224021@qq.com

*通信作者：張志清（1976—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油副產(chǎn)物開發(fā)利用。E-mail：zqzhang721@163.com