鲊辣椒純種發(fā)酵的菌株優(yōu)選

崔小利，王 薇，闞建全,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.農業(yè)部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

鲊辣椒純種發(fā)酵的菌株優(yōu)選

崔小利1,2，王 薇1,2，闞建全1,2,3,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.農業(yè)部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（重慶），重慶 400715）

通過對市售鲊辣椒樣品中微生物的分離、鑒定，確定鲊辣椒發(fā)酵過程中的主發(fā)酵菌；再購買常用的幾種發(fā)酵菌，通過其在最適條件下的產酸性和還原糖利用率等對菌株進行初篩；在初篩的基礎上，再在實際生產中用產酸性、氨基酸態(tài)氮的生成和發(fā)酵成品的感官評分實驗對其進行復篩。結果表明：鲊辣椒自然發(fā)酵過程中的主發(fā)酵菌是乳酸菌，純種發(fā)酵的合適菌種是植物乳桿菌。純種發(fā)酵彌補了傳統(tǒng)自然發(fā)酵穩(wěn)定性差，生產周期長等不足，可為實現(xiàn)鲊辣椒產品的工業(yè)化生產提供參考。

鲊辣椒；純種發(fā)酵；菌株篩選

鲊辣椒是川、鄂、湘、黔等地區(qū)的一種傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品，它以新鮮的紅辣椒和玉米粉為主要原料，經過一個月左右的自然發(fā)酵形成。因其口感微酸微辣、香氣特殊、回味醇厚等特點備受親睞。辣椒營養(yǎng)價值高，不僅能增強食欲，防止動脈粥樣硬化，還具有多種保健功能[1-5]。傳統(tǒng)鲊辣椒以家庭作坊式為主，發(fā)酵采用自然開放式，參與發(fā)酵微生物來源于空氣、水和使用的工具等，是一種多菌種混合發(fā)酵，并受季節(jié)、區(qū)域影響，且發(fā)酵周期較長，菌種、接種量、溫度等的差異都會造成鲊辣椒的品質和風味不同，使得產品的質量不穩(wěn)定，不適合工業(yè)化生產，影響了鲊辣椒的產業(yè)化發(fā)展[6]。眾多研究者提出可以通過純種發(fā)酵解決上述問題[7-9]，純種發(fā)酵能使有益菌快速生長代謝，過程簡單、易控，還會減少一些有害產物的積累[10]。目前，對于鲊辣椒的研究主要圍繞鲊辣椒自然發(fā)酵過程中的各物質的消長變化[11-12]，也有少數(shù)學者研究過混合發(fā)酵工藝[13]，但鲊辣椒的純種發(fā)酵研究還未見報道。因此，本研究擬首先分析自然發(fā)酵鲊辣椒產品中的微生物種類、比例，根據(jù)其發(fā)酵機制，確定各微生物菌群在發(fā)酵過程中所起的作用，選購合適的目的菌種，再對鲊辣椒純種發(fā)酵技術進行初步探索，以期為鲊辣椒的純種發(fā)酵技術提供基礎實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

市售鲊辣椒樣品，采購于貴州省遵義市的超市或農貿市場，散裝稱質量，樣品編號及名稱見表1。樣品采購后均密封后貯存于4 ℃的冰箱中保存。

表1 1 鲊辣椒樣品信息表Table1 Details of commercial Zhalajiao used in this study

1.2 試劑與菌種

玉米粉、食鹽 重慶市北碚區(qū)永輝超市；氫氧化鈉天津市瑞金特化學品有限公司；甲醛、3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉 成都市科龍化工試劑廠；硝酸銀 天津光復科技發(fā)展有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂等 北京奧博星生物技術有限責任公司；所有試劑均為分析純。

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、乳鏈球菌（Streptococcus lacticus）、腸膜明串珠菌（Leuconstoc meseteroides）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）6001、嗜熱乳鏈球菌（S. thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus） 中國科學院菌種保藏中心。

1.3 儀器與設備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；722-P可見分光光度計 上海現(xiàn)科儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；PB-10 Sartorius酸度計 賽多利斯科學儀器有限公司；分析天平 上海精密科學儀器有限公司；HH.B11-600-S恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.4 方法

1.4.1 市售鲊辣椒樣品中微生物的分離和鑒定

采用選擇培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基（分離乳酸菌）、醋酸菌培養(yǎng)基（分離醋酸菌）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（分離酵母菌）、高氏培養(yǎng)基（分離放線菌）、察氏培養(yǎng)基（分離霉菌）對市售的鲊辣椒樣品進行微生物分離、篩選[14]。

參照GB4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》，采用平板法測定各種選擇培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)，進行平板計數(shù)[15]。

1.4.2 乳酸菌發(fā)酵液的制備

根據(jù)樣品中微生物的分離和鑒定結果確定出鲊辣椒的主發(fā)酵菌，然后以購于中國科學院菌種保藏中心的主要工業(yè)發(fā)酵菌種作為待篩選的菌種，并測定其生產性能。

乳酸菌發(fā)酵液的制備[16-17]：取乳酸菌保藏菌種2 環(huán)→斜面活化（48 h）→再取2 環(huán)于液體MRS培養(yǎng)基中再活化（48 h）→接入500 mL液體MRS培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)→乳酸菌發(fā)酵液（冷藏保存?zhèn)溆茫?/p>

1.4.3 待測菌在MRS培養(yǎng)基上的初篩實驗

吸取待測乳酸菌發(fā)酵液5 mL，接種于MRS液體培養(yǎng)基100 mL中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，每隔6 h測定一次MRS 培養(yǎng)基中的pH值[18]、總酸含量[19]、還原糖含量、OD580nm值。

pH值的測定參照GB10468—1989《水果和蔬菜產品pH值的測定方法》，用酸度計測定；總酸的測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用中和滴定法，結果以乳酸計；還原糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法，結果以葡萄糖計。

1.4.4 待測菌在實際生產原料中的復篩實驗

根據(jù)初篩結果選擇4 種乳酸菌，取其發(fā)酵菌液5 mL，接種到原料（m（辣椒）∶m（玉米）=1∶1）中，添加輔料混勻后于30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，每天測一次樣品中的pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮含量[20]。

氨基酸態(tài)氮含量的測定參照GB/T5009.40—2003《醬衛(wèi)生標準的分析方法》，采用甲醛滴定法。

1.4.5 純種發(fā)酵與自然發(fā)酵的對比實驗研究[21]

根據(jù)復篩結果選出的最優(yōu)菌在最適條件下進行純種發(fā)酵所得的鲊辣椒產品與市售鲊辣椒產品進行感官評定，感官評分標準見表2。

表 22 鲊辣椒的感官評定評分標準Table2 Criteria for sensory evaluation of Zhalajiao

感官評定方法[22]：采用100 分制（評分項目為4 項5 個等級，每項占25 分）。請10 位有經驗的食品專家和10 位消費者（非專業(yè)人員）按感官評分標準對鲊辣椒樣品進行評分，取平均分作為最終評分。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

每個實驗重復3 次，并用Origin軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 市售鲊辣椒樣品中微生物的分離和鑒定

表3 3 鲊辣椒樣品中微生物的測定結果Table3 Strains isolated from Zhalajiao

由表3可知，所有樣品中都沒有放線菌檢出；霉菌在部分樣品（A、B、C）中檢出，這可能是鲊辣椒產品在銷售過程中被雜菌污染所致。樣品D購于超市中，可能經過了滅菌處理，沒有待測菌檢出。鲊辣椒自然發(fā)酵中的有效菌是乳酸菌、酵母菌、醋酸菌，3 類菌數(shù)量不同，但差異不大，都在同一數(shù)量級。其中乳酸菌數(shù)量最高的是G樣品為8.1×107CFU/g，最低的是A樣品為6.8×107CFU/g，但A樣品中霉菌含量較高，可能是由于放置時間較長，乳酸菌已經衰減并且感染了霉菌等雜菌。就各種菌的菌落總數(shù)而言，乳酸菌、酵母菌、醋酸菌的比例大約是7∶3∶4，乳酸菌占有比例最大，發(fā)揮著發(fā)酵產酸的主要作用，而醋酸菌和酵母菌在自然發(fā)酵中起促進風味形成的作用。

在下面菌株篩選實驗中，擬選擇乳酸菌作為純種發(fā)酵菌株，而工業(yè)上常用的蔬菜發(fā)酵乳酸菌種主要有：干酪乳桿菌、乳鏈球菌、腸膜明串株菌、短乳桿菌和植物乳桿菌。由于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產酸能力較強，是酸乳重要的發(fā)酵菌種。因此，選擇這7 種乳酸菌作為待選菌種進行篩選，并依次編號記為：L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7。

2.2 待測菌在MRS培養(yǎng)基上的初篩實驗

由圖1、2可知，所有乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中均能產酸，使培養(yǎng)基pH值下降、總酸增加。其中L1、L2、L3的產酸能力較低，L3在48 h時pH值達到5.20，總酸（以乳酸計）是0.48%；L4、L5、L6、L7產酸能力都比較高，48 h時pH值均低于4.5，產總酸大于1.30%。其中L5、 L6產酸量較高，均達到了1.77%，產酸量最高的L7達到了1.84%。因此，依據(jù)產酸能力和發(fā)酵能力，L4、L5、L6、L7可作為工業(yè)發(fā)酵菌種。

圖1 MRS培養(yǎng)基中pH值的變化Fig.1 pH changes in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

圖2 MRS培養(yǎng)基中總酸的變化Fig.2 Changes in total acid content (calculated as lactic acid) in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

圖3 MRS培養(yǎng)基中還原糖含量的變化Fig.3 Changes in reducing sugar content (expressed as glucose) in MRS medium during culture of lactic acid bacteria

由圖3可知，這7 種乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中對還原糖的利用率有較大差異，其中L1、L2、L3在48 h內還原糖（以葡萄糖計）含量降低少，說明這3 種菌還原糖利用率較低。而L4、L5、L6、L7的還原糖利用率相對較高。L5的還原糖含量從最初的7.6%經過48 h后驟減至0.68%，L6的還原糖消減量與L5相當，但L5最先開始快速利用還原糖。與此相比，L4和L7還原糖消減較少。結合圖1和圖2得出，這幾種乳酸菌的產酸能力與還原糖利用率成正比?？紤]到鲊辣椒的發(fā)酵原料（辣椒和玉米）中還原糖含量有限，因此還原糖利用率也是篩選鲊辣椒純種發(fā)酵菌的關鍵因素。

圖4 MRS培養(yǎng)基中乳酸菌OODD58800nnmm值的變化Fig.4 Changes in cell density (expressed as OD580nm) during culture of lactic acid bacteria in MRS medium

由圖4可知，乳酸菌L1、L2、L3生長緩慢，而乳酸菌L4、L5、L6、L7生長速率和繁殖生長力較高，其中L5在12～30 h的OD580nm值由0.117變化到0.468，可認為這段時間乳酸菌L5處于對數(shù)生長期，菌體數(shù)量增加最快，30 h后則進入穩(wěn)定期生長趨于平緩。乳酸菌L4、L6、L7相對L5進入對數(shù)生長期時間較晚，約從24 h后開始，但L6的OD580nm值在48 h時最高為0.532。乳酸菌L4和L7生長速率較緩慢，其最終OD580nm值分別為0.430和0.480。

由圖1～4可知，乳酸菌L1、L2和L3的生長能力、產酸性和發(fā)酵性能均較低，不適合作為純種發(fā)酵的菌種。而L4、L5、L6、L7的產酸力和生長能力均較強，其中L5在生長速率上最快，L6最終繁殖生長量最高；L5、L6和L7產酸能力差異較小；L5、L6和L7的還原糖利用率較大，因此，將乳酸菌L1、L2、L3淘汰，選取乳酸菌L4、L5、L6、L7接種在實際生產原料中再次篩選。

2.3 待測菌在實際生產原料中的復篩實驗

圖5 實際生產原料中pH值的變化Fig.5 pH changes in the raw materials during fermentation with screened strains

圖6 實際生產原料中總酸含量的變化Fig.6 Changes in total acid content (calculated as lactic acid) in the raw materials during fermentation with screened strains

由圖5、6可知，接種乳酸菌的鲊辣椒發(fā)酵組（L4、L5、L6、L7）與自然發(fā)酵組（L0）相比，其pH值下降速率更快、產酸量更多。在發(fā)酵開始時，所有發(fā)酵組的pH值在6.80左右相差不大，發(fā)酵5 d后L0的 pH值降為5.37，而接種乳酸菌的鲊辣椒發(fā)酵組的pH值則降到4.2左右，其中接種了乳酸菌L5的鲊辣椒發(fā)酵組的pH值最低為3.81。接種乳酸菌L4、L5、L6、L7的鲊辣椒在發(fā)酵4 d時總酸含量（以乳酸計）達到0.94%以上，發(fā)酵5 d時總酸含量上升至1.1%左右，此段時間總酸含量增長緩慢，產酸量少，說明純種發(fā)酵已成熟，但L0在5 d時總酸含量很低（0.43%）。因此，從產酸性來看，L5更適合作為鲊辣椒的純種發(fā)酵菌。

圖7 實際生產原料中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.7 Changes in amino acid nitrogen content in the raw materials during fermentation with screened strains

氨基酸態(tài)氮是判定發(fā)酵產品發(fā)酵程度的特性指標，該指標越高，說明產品中的氨基酸含量越高。由圖7可知，L0發(fā)酵5 d時氨基酸態(tài)氮含量為0.12%，接種了乳酸菌L5的氨基酸態(tài)氮含量最高為0.31%，L4、L6、L7則相對低些，分別為0.28%、0.27%和0.28。L5的氨基酸態(tài)氮增長速率一直較快，發(fā)酵到第4天時其含量已達到0.30%。鲊辣椒在發(fā)酵成熟后的貯存過程中氨基酸態(tài)氮會增加，但量較少。因此，L5更適合作為鲊辣椒的發(fā)酵菌。

2.4 純種發(fā)酵鲊辣椒的感官評定

表4 乳酸菌純種發(fā)酵鲊辣椒樣品的感官評分Table4 Sensory evaluation of Zhalajiao fermented with lactic acid bacteria

由表4可知，所有樣品外觀和組織的感官評分相差不大，這是由于所有樣品的原料和前處理是相同的，但樣品在滋味氣味和口感方面評分結果相差較大。自然發(fā)酵組L0最低，原因是在發(fā)酵5 d時，其產酸量和氨基酸態(tài)氮含量還很低，發(fā)酵很不成熟，仍具有玉米生腥味及辣椒的鮮辣刺激味，鲊辣椒特有的風味還未形成，在風味和口感上都還屬于沒發(fā)酵好的產品，故其總分值最低。接種乳酸菌的鲊辣椒組在發(fā)酵5 d時，其總酸含量和氨基酸態(tài)氮含量已較高，在風味上已無玉米的生腥味，且有明顯的酸辣味，與自然發(fā)酵鲊辣椒成品相差不大（LA、LB、LC是3 種自然發(fā)酵完全的鲊辣椒）。其中L5的總分值最高。

3 結 論

市售成品鲊辣椒的微生物分離鑒定表明乳酸菌為鲊辣椒的主要發(fā)酵菌種；選用7 種工業(yè)常用乳酸菌（干酪乳桿菌、乳鏈球菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱乳鏈球菌和保加利亞乳桿菌）作待測菌，通過在MRS培養(yǎng)基初篩和在實際生產鲊辣椒原料上的復篩，確定了植物乳桿菌可作為鲊辣椒純種發(fā)酵的菌株。

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Screening Strains for Use in Pure Culture Fermentation for the Production of Zhalajiao, a Traditional Chinese Fermented Hot Pepper Product

CUI Xiao-li1,2, WANG Wei1,2, KAN Jian-quan1,2,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Key Laboratory of Agro-products Processing and Storage of Chongqing, Chongqing 400715, China; 3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing), Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

The dominant strains involved in the fermentation of a mixture of hot pepper with corn flour to produce Zhalajiao, a traditional Chinese fermented hot pepper product were isolated from commercial Zhalajiao samples and identified as lactic acid bacteria. Primary screening of seven species of lactic acid bacteria was conducted for acid production and reducing sugar utilization under optimal culture conditions, and their abilities to produce acid and amino acid nitrogen as well as sensory evaluation of the final products fermented with each strain were measured for secondary screening. Lactobacillus plantarum was suitable for the pure culture fermentation of Zhalajiao. The disadvantages of the traditional natural fermentation such as poor stability and long production period could be compensated by using the pure culture fermentation. This study may provide useful references for the industrial production of Zhalajiao.

Zhalajiao; pure culture fermentation; strain screening

TS205.5

A

1002-6630（2014）21-0149-05

10.7506/spkx1002-6630-201421029

2013-11-17

國家重大星火計劃重點項目（2011GA811001）

崔小利（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學。E-mail：lily67210@163.com

*通信作者：闞建全（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學、食品生物技術、食品質量與安全。E-mail：ganjq1965@163.com