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    微波消解-電導(dǎo)率法快速測(cè)定花葉滇苦菜中粗蛋白

    2014-03-08 06:33:27高向陽(yáng)高遒竹王長(zhǎng)青劉要衛(wèi)
    食品科學(xué) 2014年22期
    關(guān)鍵詞:苦菜花葉甲醛

    高向陽(yáng),高遒竹,王長(zhǎng)青,劉要衛(wèi)

    (1.鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,河南 鄭州 450064;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

    微波消解-電導(dǎo)率法快速測(cè)定花葉滇苦菜中粗蛋白

    高向陽(yáng)1,3,高遒竹2,王長(zhǎng)青3,劉要衛(wèi)1

    (1.鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,河南 鄭州 450064;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

    建立一種快速、簡(jiǎn)便測(cè)定食品中蛋白質(zhì)的方法,以鄭州地區(qū)花葉滇苦菜為樣品,以硝酸-過(guò)氧化氫混酸為消解劑,利用微波技術(shù)進(jìn)行快速消解,將蛋白質(zhì)中的氮轉(zhuǎn)化為NH4+。根據(jù)單因素試驗(yàn)確定中性甲醛的用量后,用中性甲醛將弱酸根NH4+轉(zhuǎn)化為強(qiáng)酸H+,以NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行電導(dǎo)滴定。結(jié)果表明,花葉滇苦菜干基樣品中粗蛋白的平均含量為20.16%,平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%(n=6)。與標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比測(cè)定,經(jīng)F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)表明這2 種測(cè)定方法無(wú)顯著性差異,置信度為95%,結(jié)果令人滿意。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、節(jié)省試劑、污染小、不需要指示劑等優(yōu)點(diǎn)。

    花葉滇苦菜;微波消解;電導(dǎo)率;粗蛋白

    花葉滇苦菜(Sonchus asper (L.) Hill.),又稱續(xù)斷菊,菊科植物,苦苣菜屬,1 a或2 a生草本。分布于國(guó)內(nèi)外各地,生于田野、果園、荒山、草地及河灘[1],野生資源十分豐富,是人們喜愛(ài)采集的常見(jiàn)野菜。研究[2]表明,花葉滇苦菜中必需氨基酸含量分布合理,適宜人體吸收利用。

    蛋白質(zhì)是重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo),是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),分析蛋白質(zhì)及氨基酸含量是開(kāi)發(fā)食品資源,進(jìn)行食品質(zhì)量管理和改善食品生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)。目前,測(cè)定食品中粗蛋白的方法有國(guó)家頒布的標(biāo)準(zhǔn)法即凱氏定氮法[3]、高效液相色譜法[4]、恒pH滴定法[5]、自動(dòng)凱氏定氮儀法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7]、甲醛法[8]、近紅外光譜法[9]、濃度直讀法[10]等。凱氏定氮法樣品消化過(guò)程繁瑣,測(cè)定條件不易掌握,試劑消耗量大,排放的廢氣污染環(huán)境,危害人體健康。高效液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、近紅外光譜法和濃度直讀法或儀器價(jià)格昂貴、分析成本較高,或需要具有特殊功能的專用儀器,普及推廣受限。

    微波消解樣品技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、消化速度快、試劑用量少、污染小、工作效率高等優(yōu)勢(shì),已被廣泛用于食品分析[10-19]。電導(dǎo)率滴定法具有儀器便攜、操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、成本低廉、無(wú)需添加指示劑、易于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等突出優(yōu)點(diǎn)已得到應(yīng)用[20-21]。本實(shí)驗(yàn)將微波密閉壓力消解技術(shù)與電導(dǎo)滴定法聯(lián)用,使兩者的優(yōu)點(diǎn)得到充分發(fā)揮,樣品在微波密閉罐中程序壓力消解,將蛋白質(zhì)中的氮轉(zhuǎn)化為NH4+,除去多余酸,并用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 5.40后,加入中性甲醛將NH4+轉(zhuǎn)化為等物質(zhì)的量的H+,以NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行電導(dǎo)滴定,以電導(dǎo)率為縱坐標(biāo),以消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為橫坐標(biāo)作圖確定滴定終點(diǎn)。研究表明,該法用于鄭州地區(qū)野生花葉滇苦菜中粗蛋白的分析,樣品經(jīng)與國(guó)標(biāo)方法對(duì)照測(cè)定無(wú)顯著性差異,測(cè)定結(jié)果令人滿意,為該食品新資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)參考,有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    花葉滇苦菜于2014年3月20日采集于鄭州市郊區(qū),經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)朱長(zhǎng)山教授鑒定確認(rèn)。

    中性甲醛溶液:取質(zhì)量濃度37~40 g/100 mL的甲醛試劑(AR)一瓶約500 mL,加酚酞指示劑3~4 滴,用NaOH溶液滴至淺粉色,30 s不褪色為止,用前臨時(shí)處理。

    0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液:先粗配0.05 mol/L NaOH溶液250 mL,用干燥至恒質(zhì)量的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定和計(jì)算,其濃度為0.050 43 mol/L。

    0.100 0 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:量取濃鹽酸9 mL定容至1 L;用恒質(zhì)量的Na2CO3;以溴甲酚綠-甲基紅為指示劑,按經(jīng)典方法[22]進(jìn)行標(biāo)定,平行測(cè)定3 次,平均濃度0.106 3 mol/L。

    氫氧化鈉、硫酸銅(均為分析純) 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲酸氫鉀(基準(zhǔn)試劑) 上海試劑三廠;16 mol/L濃硝酸、18 mol/L濃硫酸(均為優(yōu)級(jí)純)、鹽酸(分析純) 洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司;30 g/100 mL雙氧水(優(yōu)級(jí)純) 汕頭市西隴化工有限公司;甲醛 廣東光華科技股份有限公司;硼酸、硫酸鉀(均為分析純) 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;所用水為超純水(電阻率18.25 MΩ?cm)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ETHOS A型微波消解/萃取系統(tǒng) 意大利Milestone微波實(shí)驗(yàn)儀器研制公司;DDS-11A型數(shù)顯電導(dǎo)率儀中國(guó)杭州雷磁分析儀器廠;雷磁PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;MS034S101電子分析精密天平(精確到0.1 mg) 瑞士Mettler Toledo公司;GZX-9140 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Molgene1820C超純水機(jī) 重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司;Velp Scientifica系列自動(dòng)凱氏定氮儀意大利Velp公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品預(yù)處理

    采集花葉滇苦菜后,用普通蒸餾水和超純水分別清洗3 次,除去灰塵和雜質(zhì),在55 ℃條件下恒溫干燥24 h以上,用粉碎機(jī)粉碎后,全部過(guò)35 目不銹鋼篩,然后置于真空袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 樣品水分測(cè)定

    按照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定方法》[23]測(cè)定水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    1.3.3 粗蛋白的測(cè)定

    準(zhǔn)確稱取0.40 g(精確到0.000 1 g)左右,按1.3.1節(jié)樣品于聚四乙烯溶樣罐中,加7.00 mL濃硝酸,1.00 mL雙氧水,輕搖,密閉罐蓋,置于微波爐中。按表1設(shè)定的程序消解完全后,于電熱板上加熱揮發(fā)至約1 mL左右,將消解液移至小燒杯,用超純水多次洗滌溶樣罐,洗滌液轉(zhuǎn)入燒杯,定量移入100 mL容量瓶,用超純水定容,混勻,待測(cè)。

    表1 微波壓力消解參數(shù)設(shè)定的程序Table 1 Parameter settings for microwave-pressurized digestion

    用移液管移取10.00 mL消解定溶液于50 mL小燒杯中,加水10.00 mL,在pH計(jì)的監(jiān)測(cè)下,用1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L NaOH逐滴滴加,調(diào)pH值至5.40后,加入2.00 mL中性甲醛溶液,輕輕混勻。測(cè)定其電導(dǎo)率并記錄后,用0.050 43 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,記錄滴定體積與其對(duì)應(yīng)的電導(dǎo)率值,每次滴定體積控制在0.10~0.50 mL之間。以測(cè)得的電導(dǎo)率值為縱坐標(biāo),以NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的滴定體積為橫坐標(biāo)作圖繪制滴定曲線,根據(jù)滴定曲線確定滴定終點(diǎn)體積V終,同時(shí)進(jìn)行平行測(cè)定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品水分測(cè)定及精密度

    取1.3.1節(jié)預(yù)處理后的樣品5 g左右(稱準(zhǔn)至0.000 1 g)于扁型玻璃稱量瓶中,按照1.3.2節(jié)[23]測(cè)定花葉滇苦菜中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),平行測(cè)定3 次,按公式(1)計(jì)算干基樣品的水分,結(jié)果如表2所示。

    式中:ω0為樣品中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%;m1為稱量瓶和試樣干燥前的質(zhì)量/g;m2為稱量瓶和試樣干燥后的質(zhì)量/g;m3為稱量瓶的質(zhì)量/g。

    表2 花葉滇苦菜水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的平均值(n=3,干基)Table 2 Average water content in Sonchus asper (n= 3, dry basis) %

    由表2可知,花葉滇苦菜干基樣品中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.28%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations,RSD)為0.43%。

    2.2 消解體系和料液比的選擇

    實(shí)驗(yàn)采用硝酸和雙氧水混酸消解體系,按照ETHOS A型微波消解/萃取系統(tǒng)針對(duì)蔬菜所推薦的消解程序:樣品0.4~0.5 g,硝酸與H2O2的體積分別為7 mL和1 mL,按照表1所設(shè)定的消解程序消解30 min,溶液澄清透明,消解效果較理想。

    2.3 消解液中過(guò)量酸的影響

    消解過(guò)程中添加過(guò)量氧化性混合酸,加入甲醛后可以發(fā)生氧化還原反應(yīng)而額外消耗甲醛,且在調(diào)節(jié)pH 5.40時(shí)會(huì)過(guò)多消耗NaOH溶液,影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟和終點(diǎn)的確定。因此需要趕酸,使用帶有溫度控制的電熱板在通風(fēng)廚中進(jìn)行趕酸,電熱板的最高溫度設(shè)置為180 ℃,至消解罐中液體剩余約1 mL時(shí)停止,再定容至100 mL備用。

    2.4 滴定時(shí)溶液pH值的確定

    由于樣品中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的等物質(zhì)的量的NH4+是較弱共軛酸(Ka=5.6×10-10),不能直接被NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確滴定。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算,除去樣品中過(guò)量的硝酸時(shí),用NaOH溶液將消解液滴至pH 5.10~5.40,溶液中的NH4+不與NaOH反應(yīng),此時(shí)可用中性甲醛將NH4+轉(zhuǎn)換為等物質(zhì)的量的H+后滴定,轉(zhuǎn)換反應(yīng)為:

    因此,控制消解液pH 5.40進(jìn)行電導(dǎo)法測(cè)定。

    2.5 甲醛用量的確定

    按1.3.3節(jié)操作步驟向10.00 mL定溶液中,分別加入1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL甲醛溶液測(cè)定粗蛋白,同時(shí)進(jìn)行3 次平行測(cè)定,取平均值。實(shí)驗(yàn)表明:加入甲醛大于2.00 mL時(shí),粗蛋白的測(cè)定結(jié)果最大且穩(wěn)定,考慮到節(jié)省試劑,確定加入甲醛的體積為2.00 mL。

    2.6 溫度的影響

    溫度對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定有較大影響[24],用溫度計(jì)測(cè)量被測(cè)液體的溫度后,將儀器上的溫度補(bǔ)償旋鈕到該溫度,其影響即可得到補(bǔ)償和校正。

    2.7 滴定終點(diǎn)的確定

    滴定終點(diǎn)前,由于溶液中的H+離子具有較高的無(wú)限稀釋摩爾電導(dǎo)率[24],導(dǎo)電能力較強(qiáng),滴加NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液后,快速與OH-定量反應(yīng),生成導(dǎo)電性弱的H2O,溶液電導(dǎo)率隨NaOH溶液的加入量增加而線性降低,達(dá)終點(diǎn)時(shí),溶液的電導(dǎo)率最低。終點(diǎn)后,由于過(guò)量的OH-具有較強(qiáng)導(dǎo)電性,溶液的導(dǎo)電率隨NaOH的加入量增加而線性增加,因此,圖1中2條直線延長(zhǎng)線的交點(diǎn)即為滴定終點(diǎn)。

    圖1 電導(dǎo)滴定曲線Fig.1 Conductivity titration curve

    由圖1可知,滴定曲線由2條直線組成,每條直線只需進(jìn)行5~7 個(gè)點(diǎn)的測(cè)定,即可以準(zhǔn)確進(jìn)行繪制。2條直線延長(zhǎng)線交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,即為滴定終點(diǎn)V終?;ㄈ~滇苦菜干基樣品中粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式(2)計(jì)算:

    式中:ω為干基樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%;V終為滴定終點(diǎn)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL;c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的物質(zhì)的量濃度/(mol/L);0.014 01為1 mmol NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于氮的質(zhì)量/(g/mmol);6.25為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù);m為稱取樣品的質(zhì)量/g;ω0為樣品中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%。

    2.8 對(duì)照測(cè)定結(jié)果及精密度

    利用該法按照1.3.3節(jié)操作步驟和國(guó)標(biāo)法[3]各進(jìn)行6 次平行測(cè)定,用格魯布斯檢驗(yàn)法檢驗(yàn)無(wú)可疑值后,按公式(1)計(jì)算干基樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如表3所示。

    表3 對(duì)照測(cè)定結(jié)果Table 3 Comparison of the analytical results obtained using the conductivity titration method and the Chinese national standard %

    由表3可知,國(guó)標(biāo)法測(cè)得粗蛋白均值為21.12%,RSD為2.4%,微波消解-電導(dǎo)滴定法測(cè)得的粗蛋白含量均值為20.16%,RSD為2.5%,經(jīng)過(guò)F值和t值檢驗(yàn)表明,2 種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異,結(jié)論的置信度為95%[25]。

    3 結(jié) 論

    微波消解法樣品與試劑的反應(yīng)是在密閉的容器內(nèi)進(jìn)行的,試劑用量少,消化速度快且消化徹底;對(duì)環(huán)境和分析人員的危害大大減??;按表1程序設(shè)置后可自動(dòng)完成全部操作,簡(jiǎn)單方便,減輕了分析人員的勞動(dòng)強(qiáng)度,提高了工作效率。

    電導(dǎo)法測(cè)定花葉滇苦菜中的粗蛋白無(wú)需對(duì)試液進(jìn)行蒸餾和使用硼酸吸收液,不需要指示劑和催化劑,試液處理后可直接滴定,所用儀器便宜、操作簡(jiǎn)便、消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑少,成本低廉,分析速度快。對(duì)花葉滇苦菜樣品進(jìn)行6 次平行測(cè)定,粗蛋白含量均值為20.16%,RSD為2.5%。與國(guó)標(biāo)法對(duì)照測(cè)定,經(jīng)過(guò)F值檢驗(yàn)和t值檢驗(yàn)表明,2 種方法間無(wú)顯著性差異,結(jié)論的置信度為95%,為花葉滇苦菜等樣品中粗蛋白的快速測(cè)定提供一種新的分析方法,為該自然資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)參考,有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

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    Rapid Determination of Crude Protein in Sonchus asper by Microwave Digestion-Conductivity Titration

    GAO Xiang-yang1,3, GAO Qiu-zhu2, WANG Chang-qing3, LIU Yao-wei1
    (1. School of Food Science and Engineering, University for Science and Technology of Zhengzhou, Zhengzhou 450064, China; 2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 3. College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

    A rapid and simple method to determine crude protein content in Sonchus asper was established in this study. Samples were digested with nitric acid-hydrogen peroxide by microwave digestion technique to convert crude protein to NH4+. The NH4+generated in the digestion was further converted to H+ions by neutral formalin for conductivity titration with standard NaOH solution. The results indicated that the average content of protein in wild Sonchus asper from Zhengzhou was determined to be 20.16% with relative standard deviation (RSD) of 2.5% (n = 6). Compared with the classic method, the conductivity titration method did not exhibit significant difference as analyzed by F-test and t-test at 95% confidence level. This method has the advantages of convenient operation, high sensitivity, quick determination, accurate results and no requirements for indicators.

    Sonchus asper; microwave digestion; conductivity; crude protein

    O657.11

    A

    1002-6630(2014)22-0194-04

    10.7506/spkx1002-6630-201422037

    2014-06-04

    河南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(10466-X-082301)

    高向陽(yáng)(1949—),男,教授,學(xué)士,主要從事食品安全監(jiān)測(cè)、食品新資源開(kāi)發(fā)研究。E-mail:ndgaoxy@163.com

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