幾種醇對(duì)Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影響及其工藝條件優(yōu)化

馬嬌娜，楊國(guó)龍*，陳素琴，畢艷蘭，劉 偉

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

幾種醇對(duì)Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影響及其工藝條件優(yōu)化

馬嬌娜，楊國(guó)龍*，陳素琴，畢艷蘭，劉 偉

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

研究脂肪酶Lipozyme RM IM催化大豆卵磷脂（phosphatidylcholine，PC）乙醇解反應(yīng)制備溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）過(guò)程中其他幾種醇對(duì)PC乙醇解的影響，并對(duì)乙醇解條件進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)正丁醇對(duì)PC乙醇解無(wú)明顯影響，叔丁醇對(duì)PC乙醇解有一定的抑制作用，1,2-丙二醇和丙三醇呈現(xiàn)較好的促進(jìn)作用。最后選用丙三醇作為乙醇解的促進(jìn)劑，通過(guò)響應(yīng)面分析法確定了無(wú)溶劑體系中Lipozyme RM IM催化PC醇解的最佳工藝條件為加酶量15%（以PC質(zhì)量計(jì)，m/m）、反應(yīng)溫度28 ℃、加水量8%（水/乙醇溶液，V/V）、丙三醇10% （丙三醇/乙醇溶液，V/V）、底物質(zhì)量濃度1.49 g/mL（PC/乙醇溶液，m/V）、反應(yīng)時(shí)間11h，此條件下 LPC轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.2%。實(shí)驗(yàn)證明，丙三醇對(duì)無(wú)溶劑體系中Lipozyme RM IM催化條件下的PC乙醇解反應(yīng)有很好的促進(jìn)作用。

卵磷脂；Lipozyme RM IM；乙醇解；溶血卵磷脂

由于磷脂親水親油平衡值較低，僅適用于做水/油型乳化劑，限制了其在很多行業(yè)中的應(yīng)用，因此國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都致力于磷脂的改性研究。其中，酶法改性因其有優(yōu)于物理改性和化學(xué)改性的諸多特點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外磷脂改性研究的熱點(diǎn)。溶血磷脂的生產(chǎn)，則是磷脂酶法改性技術(shù)的重要應(yīng)用。溶血磷脂在低pH值、高溫、高離子濃度及不同油水比環(huán)境下的乳化性和穩(wěn)定性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于普通磷脂，且因其在生理功能、表面活性和抗菌能力等方面的獨(dú)特性能，已被廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品和飼料加工等領(lǐng)域[1-2]。

在酶法生產(chǎn)溶血磷脂的研究中，以磷脂酶催化磷脂水解反應(yīng)居多。本實(shí)驗(yàn)采用來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜的脂肪酶作為工具酶催化卵磷脂醇解制備溶血卵磷脂。目前酶促醇解反應(yīng)主要用于甘三酯制備生物柴油的研究[3-8]，而磷脂的醇解反應(yīng)研究較少，因此有必要對(duì)其做深入研究。另有報(bào)道表明，脂肪酶在不同醇中的反應(yīng)活性不同，且不同醇的組合會(huì)對(duì)酯交換反應(yīng)產(chǎn)生協(xié)同作用[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用醇解法對(duì)磷脂進(jìn)行酶法改性，并研究醇的相互作用對(duì)醇解反應(yīng)的影響，以期尋求最優(yōu)反應(yīng)條件，達(dá)到提高溶血磷脂產(chǎn)率的目的，為拓展磷脂的應(yīng)用領(lǐng)域提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆卵磷脂（phosphatidylcholine，PC，純度＞97%） 沈陽(yáng)天峰生物工程技術(shù)有限公司；脂肪酶Lipozyme RM IM 諾維信公司；三氯甲烷、甲醇為色譜純；無(wú)水乙醇、正丁醇、叔丁醇、1,2-丙二醇、丙三醇等試劑均為分析純，使用前經(jīng)分子篩脫水處理。

1.2 儀器與設(shè)備

MK-6S棒狀薄層色譜分析儀 日本三菱公司；BSA224S電子天平（最大稱量220 g，感量0.000 1 g）賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶Lipozyme RM IM催化卵磷脂醇解制備溶血卵磷脂

精確稱取一定量的卵磷脂，加入一定體積的醇溶液充分溶解，在恒溫磁力攪拌器中穩(wěn)定20 min后，加入適量脂肪酶，醇解反應(yīng)開(kāi)始，定時(shí)取樣進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.2 PC及其醇解產(chǎn)物的組成分析

采用棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器分析PC及其醇解產(chǎn)物中PC、溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）、甘油磷脂酰膽堿（glycerylphosphorylcholine，GPC）及其他物質(zhì)的相對(duì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。將PC或醇解產(chǎn)物溶解于三氯甲烷中，配制成質(zhì)量濃度為10～20 mg/mL的溶液，取1 μL溶液點(diǎn)于薄層色譜棒上，在溶劑體系下展開(kāi)后在90 ℃紅外烘箱中干燥5 min，然后進(jìn)行檢測(cè)分析。展開(kāi)液為：CHCl3-CH3OH-H2O（42∶22∶2.5，V/V）。檢測(cè)條件：氫氣流速100mL/min；空氣流速1.5 L/min；掃描速率30 s/棒。

1.3.3 LPC轉(zhuǎn)化率計(jì)算

式中：w為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化分析

在研究其他醇對(duì)PC乙醇解的影響的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，找出促進(jìn)作用較好的醇，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。以LPC轉(zhuǎn)化率作為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面法Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design-Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)溶劑體系下其他醇對(duì)Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影響

卵磷脂在乙醇中具有極好的溶解性，乙醇作為反應(yīng)底物的同時(shí)，也可為卵磷脂的醇解提供反應(yīng)體系。無(wú)溶劑體系中進(jìn)行的酶催化反應(yīng)，產(chǎn)物容易進(jìn)一步精制純化。參考前期研究的結(jié)果[10]，確定無(wú)溶劑體系下酶促卵磷脂乙醇解的反應(yīng)條件為：加酶量15%（m/m）、反應(yīng)溫度30 ℃、底物質(zhì)量濃度2 g/mL（PC/醇溶液，m/V），加水量8%（水/醇溶液，V/V）。在卵磷脂乙醇解最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上，考察無(wú)溶劑體系中其他醇對(duì)卵磷脂乙醇解的影響。X醇（正丁醇、叔丁醇、1,2-丙二醇和丙三醇）與乙醇的比例為X醇的體積分?jǐn)?shù)，即其占醇溶液總體積的百分比。

2.1.1 正丁醇對(duì)PC乙醇解反應(yīng)的影響

圖1 正丁醇對(duì)PC乙醇解中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of n-butanol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

有研究[11-12]使用正丁醇作為油脂醇解底物，進(jìn)行酯交換反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)嘗試考察了正丁醇對(duì)卵磷脂乙醇解反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)添加正丁醇體積分?jǐn)?shù)為10%和20%時(shí)，乙醇解過(guò)程中LPC轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間變化趨勢(shì)與不添加正丁醇的乙醇解一致（圖1），反應(yīng)于16 h達(dá)到平衡，LPC轉(zhuǎn)化率達(dá)到92%，正丁醇對(duì)卵磷脂乙醇解無(wú)影響。Rodrigues等[13]研究無(wú)溶劑體系下幾種脂肪酶催化甘三酯與短碳鏈醇的酯交換反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)：Lipozyme RM IM在甲醇、乙醇等低分子質(zhì)量醇中易失活，而在正丁醇中轉(zhuǎn)化率較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相異可能是由于底物不同所致，卵磷脂的極性比甘三酯大，在乙醇中溶解性很好，從而減弱了乙醇對(duì)脂肪酶的失活效果，同時(shí)也削弱了正丁醇的促進(jìn)作用。且正丁醇與乙醇都為直鏈結(jié)構(gòu)，雖然其碳鏈長(zhǎng)度較乙醇略有增長(zhǎng)，但在最適宜乙醇解條件下其分子動(dòng)能與傳質(zhì)能力并未受到因分子體積增大帶來(lái)的抑制作用，底物分子間的結(jié)合機(jī)率未受到影響，故正丁醇與乙醇間未表現(xiàn)出明顯的相互作用。

2.1.2 叔丁醇對(duì)PC乙醇解反應(yīng)的影響

隨著醇溶液中叔丁醇比例的增加，醇解反應(yīng)速率逐漸降低，對(duì)反應(yīng)呈現(xiàn)抑制作用（圖2）。近年來(lái)，叔丁醇在酶促油脂酯交換制備生物柴油的研究中備受重視[14-15]。由于甲醇、乙醇等短碳鏈醇在油脂中的溶解性不好而易使酶失活[16]，且甘三酯的醇解反應(yīng)產(chǎn)物——甘油對(duì)酶有毒害作用[17]。叔丁醇因其對(duì)甘油的溶解性較好，有助于酶的激活并使固定化脂肪酶穩(wěn)定性增強(qiáng)，還可用作酶的前處理及再利用時(shí)的清洗，而被用作酶促酯交換的反應(yīng)介質(zhì)[18-20]。本研究中叔丁醇對(duì)卵磷脂乙醇解呈現(xiàn)抑制作用，與甘三酯醇解中叔丁醇所表現(xiàn)出的積極作用相反，可能是因?yàn)榈孜锏牟煌?，卵磷脂比甘三酯極性大，對(duì)乙醇的溶解性好，且反應(yīng)過(guò)程中無(wú)甘油產(chǎn)生，叔丁醇對(duì)甘三酯醇解的促進(jìn)作用在此無(wú)法體現(xiàn)。而且，由于叔丁醇的空間結(jié)構(gòu)使得羥基受到位阻的影響，叔丁醇羥基與卵磷脂分子的碰撞機(jī)率減少，底物與酶的結(jié)合也受到影響。叔丁醇對(duì)卵磷脂乙醇解表現(xiàn)出抑制作用。

圖2 叔丁醇對(duì)PC乙醇解中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of t-butanol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

2.1.3 1,2-丙二醇對(duì)PC乙醇解反應(yīng)的影響

圖3 1,2-丙二醇對(duì)PC乙醇解中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of 1,2-propanediol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

向乙醇溶液中添加體積分?jǐn)?shù)為10%和15%的1,2-丙二醇后，醇解反應(yīng)速率逐步增加，達(dá)到反應(yīng)平衡所用時(shí)間縮短，且產(chǎn)品得率有所提升（圖3）。添加20%的丙二醇的醇解反應(yīng)趨勢(shì)與15%時(shí)差別不大，反應(yīng)于12h接近平衡，LPC轉(zhuǎn)化率達(dá)95%。1,2-丙二醇對(duì)卵磷脂乙醇解反應(yīng)表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用，可能是因?yàn)楸甲鳛槎?，與卵磷脂都是極性物質(zhì)，且其極性比乙醇大，對(duì)體系中微量水有很好的溶解性和分散性，可能會(huì)有效調(diào)節(jié)水與酶的接觸[21]。

2.1.4 丙三醇對(duì)PC乙醇解反應(yīng)的影響

圖4 丙三醇對(duì)PC乙醇解中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of glycerol on the conversion of LPC during ethanolysis of PC

向反應(yīng)體系中加入體積分?jǐn)?shù)為5%和10%的丙三醇后，醇解反應(yīng)速率明顯提升，產(chǎn)品得率顯著增加；反應(yīng)于10h達(dá)到平衡，LPC轉(zhuǎn)化率達(dá)96%（圖4）。許多報(bào)道研究[22-26]指出脂肪酶催化甘三酯制備生物柴油時(shí)，甘油在油中難溶，易吸附于固定化酶表面而對(duì)酶的活性及穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)中丙三醇不僅未表現(xiàn)出抑制作用反而有促進(jìn)作用，是因?yàn)楸寄軌蜉^好地分散于卵磷脂、乙醇和溶血卵磷脂組成的混合體系中，丙三醇很難與固定化脂肪酶發(fā)生強(qiáng)的相互作用從而堵塞固定化酶的多孔性通道。丙三醇也可能會(huì)使微量水分保留在脂肪酶周圍，有助于激活并穩(wěn)定固定化脂肪酶[27]。加入20%的丙三醇后，反應(yīng)速率有所提升，但產(chǎn)品最終得率與加入10%丙三醇時(shí)一致，因加入過(guò)多的丙三醇，底物已經(jīng)達(dá)到飽和，且其極性對(duì)酶有不利影響，丙三醇對(duì)反應(yīng)的促進(jìn)作用保持穩(wěn)定?？傊?，無(wú)溶劑體系下丙三醇對(duì)Lipozyme RM IM催化的卵磷脂乙醇解有顯著的促進(jìn)作用。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

通過(guò)對(duì)無(wú)溶劑體系下其他醇對(duì)Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解影響的考察，發(fā)現(xiàn)1,2-丙二醇和丙三醇對(duì)卵磷脂的乙醇解反應(yīng)有促進(jìn)作用。綜合考慮兩者的價(jià)格及所需添加比例，選擇丙三醇體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表1 Lipozyme RM IM催化醇解反應(yīng)試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in the experimental design for Lipozyme RM IM catalyzed ethanolysis of PC

以LPC轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，選取對(duì)其影響較大的3 個(gè)因素變量做三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。固定其他反應(yīng)條件為：加酶量15%（m/m）、加水量為醇溶液總體積的8%、丙三醇占醇溶液總體積10%。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到回歸方程：LPC轉(zhuǎn)化率=95.91-1.76A-0.61B+15.48C+17.49AB-4.48AC+1.68BC-10.63A2-10.93B2-7.99C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

從表3可知，回歸方程極顯著。相關(guān)系數(shù)R2=0.984 2，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有98.42%來(lái)源于所選變量，即反應(yīng)溫度、底物質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間。因此，回歸方程可較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。當(dāng)P值小于0.05時(shí)，表示該因素對(duì)響應(yīng)值變化的影響是顯著的。由方差分析表可知，因素C、AB、AC、B2、C2是顯著的，表明各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值變化的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表3 LPC轉(zhuǎn)化率模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model describing LPC conversion

圖5～7可直觀反應(yīng)各因素間的交互作用對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響。通過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間和底物質(zhì)量濃度的交互作用影響不顯著，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和底物質(zhì)量濃度的交互作用影響顯著。

圖5 反應(yīng)溫度和底物質(zhì)量濃度交互作用對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Interaction between temperature and substrate concentration on LPC conversion

圖6 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Interaction between reaction temperature and time on LPC conversion

圖7 反應(yīng)時(shí)間和底物質(zhì)量濃度交互作用對(duì)LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Interaction between reaction time and substrate concentration on LPC conversion

以LPC轉(zhuǎn)化率最大化為目標(biāo)，運(yùn)用回歸模型分析得到最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度27.92 ℃、底物質(zhì)量濃度1.49 g/mL、反應(yīng)時(shí)間10.99 h。在此條件下LPC轉(zhuǎn)化率理論值為98.6%?？紤]到實(shí)際操作的可能性，將工藝條件確定為：反應(yīng)溫度28 ℃、底物質(zhì)量濃度1.49 g/mL、反應(yīng)時(shí)間11 h。按此條件進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得LPC轉(zhuǎn)化率平均值為98.2%，與理論值相差不大。因此，基于響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)化工藝條件可靠，有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

無(wú)溶劑體系下Lipozyme RM IM催化PC乙醇解的過(guò)程中，正丁醇對(duì)PC乙醇解無(wú)明顯影響，叔丁醇對(duì)PC乙醇解有一定的抑制作用，1,2-丙二醇和丙三醇呈現(xiàn)較好的促進(jìn)作用。最后選用丙三醇與乙醇進(jìn)行協(xié)同作用，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定了無(wú)溶劑體系中Lipozyme RM IM催化PC醇解的最佳工藝條件為加酶量15%（m/m）、反應(yīng)溫度28℃、加水量8%（水/醇溶液，V/V）、丙三醇10%（丙三醇/醇溶液，V/V）、底物質(zhì)量濃度1.49 g/mL（PC/醇溶液，m/V）、反應(yīng)時(shí)間11 h，此條件下LPC轉(zhuǎn)化率為98.2%。實(shí)驗(yàn)證明，利用丙三醇可以使Lipozyme RM IM催化的卵磷脂乙醇解反應(yīng)速率明顯提升，且產(chǎn)品得率得以顯著增加，可為溶血磷脂的生產(chǎn)提供一定參考，但其產(chǎn)生協(xié)同作用的具體機(jī)理還有待深入研究。

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Effect of Other Alcohols on Lipozyme RM IM-Catalyzed Ethanolysis of Phosphatidylcholine and Optimization of the Ethanolysis Process

MA Jiao-na, YANG Guo-long*, CHEN Su-qin, BI Yan-lan, LIU Wei
(School of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

The effects of other alcohols on the Lipozyme RM IM-catalyzed ethanolysis of soy phosphatidylcholine (PC) for the preparation of lysophosphatidylcholine (LPC) were studied and the ethanolysis conditions were optimized. The results showed that n-butanol had no significant synergistic or inhibitory effect on the ethanolysis of PC, while tert-butanol displayed an inhibitory effect, and 1,2-propylene glycol and glycerol exhibited a significant synergistic effect. Glycerol was chosen as the synergistic agent for PC ethanolysis. The optimal conditions for the ethanolysis catalyzed by Lipozyme RM IM in solvent-free system were obtained by response surface methodology as follows: lipase dosage, 15% (based on the mass of PC); temperature, 28 ℃; ratio of water to ethanol solution, 8% (V/V); ratio of glycerol to ethanol solution, 10% (V/V); substrate concentration, 1.49 g/mL (PC/ethanol solution ratio, m/V), and reaction time, 11 h. Under these conditions, the conversion rate of LPC was 98.2%. Glycerol exhibited a significant synergistic effect on the ethanolysis of PC.

phosphatidylcholine; Lipozyme RM IM; ethanolysis; lysophosphatidylcholine

TS201.2

A

1002-6630（2014）22-0092-05

10.7506/spkx1002-6630-201422017

2014-04-08

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目（2011GGJS-079）；河南工業(yè)大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2012YJCX10）

馬嬌娜（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹|(zhì)生物改性。E-mail：13592547284@163.com

*通信作者：楊國(guó)龍（1974—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹|(zhì)化學(xué)與生物技術(shù)。E-mail：ygl88888@haut.edu.cn