響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥花青苷提取工藝及 其抗氧化活性

劉水英，李新生,2,*，黨 婭,2，米 桂，趙 璇，王 昕，韓 豪，楊智勇

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研 究中心，陜西 漢中 723000）

響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥花青苷提取工藝及 其抗氧化活性

劉水英1，李新生1,2,*，黨 婭1,2，米 桂1，趙 璇1，王 昕1，韓 豪1，楊智勇1

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研 究中心，陜西 漢中 723000）

以紫山藥為實(shí)驗(yàn)材料，以酸性乙醇為提取溶劑，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法及Design-Expert 8.0.6分析軟件建立二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化紫山藥花青苷的提取工藝。同時(shí)，對(duì)紫山藥花青苷清除·OH和O2-·的能力進(jìn)行分析研究。結(jié)果表明，5 種單因素對(duì)花青苷得率影響大小的順序?yàn)辂}酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取溫度，紫山藥花青苷最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度80 ℃、提取時(shí)間3.5 h、液料比25∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)18?。在上述最佳條件下，紫山藥花青苷平均得率達(dá)到4.966 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.29%，與數(shù)學(xué)模型理論得率的相對(duì)誤差小于1.0%?？寡趸瘜?shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，紫山藥花青苷對(duì)·OH及O2-·具有較好的清除能力，其抗氧化能力強(qiáng)于VC。

紫山藥；花青苷；響應(yīng)面法；提取工藝；抗氧化活性

紫山藥（Dioscorea alata）是薯蕷科（Dioscoreae）山藥屬（Dioscorea L.）一年生或多年生蔓生植物，也稱(chēng)“紫人參”，又名紫薯蕷、紫蒔藥、紫淮山、紫參薯、腳板薯[1]。其塊根質(zhì)脆有黏性，富含淀粉、黏質(zhì)多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、膽堿、薯蕷皂（去氫表雄酮）、花青苷等多種營(yíng)養(yǎng)和功能成分[2-4]?！侗静菥V目》記載其具有補(bǔ)脾胃、益肺腎、消渴，可治氣虛衰弱、慢性泄瀉、遺精帶下、虛勞咳嗽等病癥，對(duì)虛弱、慢性腸胃炎、糖尿病等也有一定的療效[5]，長(zhǎng)期服用可以抗病、強(qiáng)身，具有藥食兩用的價(jià)值[6-9]。國(guó)外、國(guó)內(nèi)對(duì)紫山藥花青苷研究相對(duì)較少[10-11]，對(duì)紫山藥花青苷清除·OH及O2-·的研究也未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。我國(guó)只在紫山藥引種、品種改良、種植、營(yíng)養(yǎng)成分等方面有少量研究和報(bào)道[12-16]，在清除自由基研究方面，倪勤學(xué)等[17]僅對(duì)紫山藥色素提取液清除DPPH自由基進(jìn)行了研究。因此，本研究在查閱已有文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)紫山藥花青苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)紫山藥花青苷的抗氧化清除·OH及O2-·能力進(jìn)行研究，旨在為我國(guó)紫山藥資源的開(kāi)發(fā)及紫山藥花青苷的進(jìn)一步研究和綜合利用提供一定的理論參考與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫山藥由湖南省長(zhǎng)沙地泰農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司提供，經(jīng)陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定為薯蕷科山藥屬紫山藥新鮮塊根。

牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 美國(guó)Sigma公司；95%乙醇（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；鹽酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、Tris-HAC-EDTA緩沖液、鄰苯三酚等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；VC 上海博湖生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，25 ℃）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、AUW220D型十萬(wàn)分之一電子天平 日本島津儀器公司；KQ-100DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LC-800型低速臺(tái)式離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；愛(ài)特爾DZF-6050型真空干燥箱 深圳市愛(ài)特爾電子科技有限公司；DZF6050型真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司；PHS-3C型精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；摩爾細(xì)胞型1810B超純水儀、萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫山藥提取工藝流程

新鮮的紫山藥洗凈、帶皮切片（厚2～3 mm）、45 ℃恒溫真空干燥、粉碎、過(guò)80目篩，得紫山藥干粉（含水量＜5%）。下一步提取花青苷（考察溫度、時(shí)間、液料比、提取溶劑、超聲頻率等因素的影響），3 500 r/min離心5 min，定容，得紫山藥花青苷提取液，稀釋、定容得待測(cè)液。

1.3.2 最佳提取溶劑選擇和紫山藥花青苷光譜特性

稱(chēng)取5.0 g紫山藥干粉于圓底燒瓶中，以V（5?酸）∶V（70%乙醇）=15∶85[18]的酸性乙醇溶液（蘋(píng)果酸-乙醇溶液、酒石酸-乙醇溶液、鹽酸-乙醇溶液、檸檬酸-乙醇溶液）為提取溶劑。按液料比（提取溶劑的體積與提取溶質(zhì)的質(zhì)量之比）為20∶1（mL/g）各加入50 mL上述提取溶劑、混勻，于45 ℃恒溫水浴中超聲浸提2 h，3 500 r/min離心，再用相應(yīng)的提取溶劑定容于50 mL棕色容量瓶，每種溶劑平行實(shí)驗(yàn)3 次。計(jì)算紫山藥花青苷的平均得率，確定最佳提取溶劑。

對(duì)紫山藥色素提取的稀釋液按波長(zhǎng)間隔為2 nm在190～1 000 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)全掃描。

1.3.3 花青苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品2.03 mg，用酸性乙醇V（5?鹽酸）∶V（70%乙醇）=15∶85超聲溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，即得到質(zhì)量濃度為40.6 μg/mL牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷對(duì)照母液。分別移取對(duì)照母液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 mL于50 mL棕色容量瓶中并用酸性乙醇定容。得到質(zhì)量濃度分別為0、0.406、0.812、1.218、1.624、2.436、4.060 μg/mL的系列花青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在190～1000 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，找出標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)λmax，以λmax每種質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的的吸光度A為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制牽?；ㄋ?3-葡 萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。用線(xiàn)性最小二乘法擬合得到花青苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程。

1.3.4 紫山藥花青苷的測(cè)定及得率的計(jì)算

取紫山藥花青苷提取液2.0 mL定容于10 mL棕色容量瓶中，得到紫山藥花青苷提取稀釋液。在與花青苷標(biāo)準(zhǔn)品牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷相同的條件下，以提取所用的溶劑為空白對(duì)照，測(cè)定出紫山藥花青苷提取稀釋液的吸光度A0，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程得到紫山藥中花青苷的質(zhì)量濃度。紫山藥花青苷得率（ω）計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

式中：ω為紫山藥花青苷的得率/（μg/g）；ρ為紫山藥花青苷的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；n為稀釋倍數(shù)，n=25；V為紫山藥花青苷稀釋液的體積/mL；m為紫山藥干粉質(zhì)量/g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取一定質(zhì)量的紫山藥干粉，依據(jù)1.3.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇V（5?鹽酸）∶V（70%乙醇）=15∶85的酸性乙醇作為提取溶劑，以紫山藥花青苷得率作為評(píng)價(jià)花青苷提取的標(biāo)準(zhǔn)，分別考察提取溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）、提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5?、8?、10?、12?、15?、18?、20?）、超聲頻率（20、40、60、80、100、120 Hz）對(duì)紫山藥花青苷得率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用五因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)一步試驗(yàn)。選擇溫度、時(shí)間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量，依次用X1、X2、X3、X4、X5表示，并以-1、0、1分別代表各自的低、中、高水平，以花青苷得率Y（mg/g）為響應(yīng)值，確定這5 個(gè)自變量對(duì)紫山藥花青苷得率影響的顯著性和提取的最佳工藝條件組合。因素及水平編碼表見(jiàn)表1。

表1 因素及水平編碼表Table 1 Coded levels for factors used in Box-Behnken design

1.3.7 紫山藥花青苷抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

將紫山藥花青苷最佳提取工藝條件下得到的花青苷提取液作為抗氧化活性實(shí)驗(yàn)的樣品。清除·OH能力的測(cè)定[19-20]采用Fenton反應(yīng)法，清除O2-·能力的測(cè)定[21-22]采用鄰苯三酚氧化法。

1.3.7.1 ·OH清除能力

取5.0 mL 10 mmol/L硫酸亞鐵溶液、5.0 mL 10 mmol/L水楊酸-乙醇和5.0 mL提取液于50 mL錐形瓶中，然后加入5.0 mL 9 mmol/L的過(guò)氧化氫，在38 ℃恒溫水浴中反應(yīng)40 min。以超純水為空白參比，對(duì)照品以抗壞血酸代替樣品，平行做3 組實(shí)驗(yàn)。在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度，重復(fù)測(cè)3 次取平均值?！H清除率按公式（2）計(jì)算：

式中：A0、A1分別為空白對(duì)照與樣品的平均吸光度。

1.3.7.2 O2-·清除能力

分別向10 mL石英比色管中加入0.5 mL蒸餾水，4.5 mL pH值為8.2的50 mmol/L Tris-HAC-EDTA緩沖液，混勻后于20 ℃條件下恒溫30 min。再往其中加入10 μL同溫度的45 mmol/L鄰苯三酚溶液，做空白對(duì)照時(shí)則以蒸餾水代替鄰苯三酚，混勻后迅速在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合溶液的吸光度。測(cè)定樣品時(shí)將第一步的蒸餾水換為不同質(zhì)量濃度的樣品溶液以測(cè)定加入樣品后鄰苯三酚的自氧化能力，同時(shí)做樣品溶液的空白對(duì)照，扣除樣品溶液本身的干擾。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑

圖1 不同提取溶劑對(duì)花青苷得率的影響Fig.1 Influence of different extraction solvents on anthocyanins yield

不同提取溶劑對(duì)紫山藥花青苷提取的效果見(jiàn)圖1，可以看出在提取紫山藥花青苷的4 種溶劑中，鹽酸-乙醇作為溶劑時(shí)花青苷的得率最高；酒石酸-乙醇的提取效果次之。因此，選擇鹽酸-乙醇作為紫山藥花青苷提取的最佳溶劑。可能原因是鹽酸-乙醇溶液的極性與紫山藥花青苷的最為接近，且鹽酸為強(qiáng)電解質(zhì)，電離出的H+可與花青苷結(jié)合形成更為穩(wěn)定的烊鹽而利于紫山藥中花青苷的溶出。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

圖2 紫山藥花青苷紫外-可見(jiàn)光掃描圖Fig.2 Ultraviolet-visible spectrum of purple yam anthocyanins

對(duì)紫山藥花青苷提取液在190～1 000 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)全掃描，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)作圖。由圖2可知，紫山藥色素提取液在530 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)特征吸收峰。由于花青苷的光譜學(xué)特性是其在可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)為465～560 nm[23]。說(shuō)明紫山藥花青苷提取液具有花青苷的特征，屬于花青苷類(lèi)物質(zhì)。

2.3 花青苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，以酸性乙醇V（5?鹽酸）∶V（70%乙醇）=15∶85為空白參比，對(duì)牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全掃描，獲得牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷掃描光譜圖。由圖3可見(jiàn)，花青苷測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)λmax（圖3中1對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)）為530 nm。在最大波長(zhǎng)處以花青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液各質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖繪制紫山藥花青苷標(biāo)準(zhǔn)品牽牛花素-3-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程為：Y=0.1678X-0.000 6（R2=0.999 8），式中：X為牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Y為λmax處標(biāo)準(zhǔn)品各質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的吸光度。

圖3 牽牛花素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品紫外-可見(jiàn)光譜掃描圖Fig.3 Ultraviolet-visible spectrum of petunidin-3-glucoside standard

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 提取溫度對(duì)紫山藥花青苷提取的影響

圖4 提取溫度對(duì)提取效果的影響Fig.4 Influence of temperature on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖4可知，當(dāng)其他條件相同時(shí)，在一定的溫度范圍內(nèi)，紫山藥花青苷得率隨著提取溫度的升高而升高。當(dāng)提取溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，紫山藥花青苷的得率達(dá)到最大。溫度再繼續(xù)升高時(shí)花青苷得率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎谧仙剿幓ㄇ嘬盏臒岱€(wěn)定性差。當(dāng)?shù)陀?0 ℃時(shí)，隨著溫度的升高紫山藥花青苷的溶出率逐漸增大，升高溫度有利于紫山藥中花青苷的溶出；但高于80 ℃之后，紫山藥花青苷的分解速率明顯增大導(dǎo)致花青苷得率降低[24-27]。綜合考慮，提取溫度選擇80 ℃最佳。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的最佳提取溫度80 ℃高于曾哲靈[6]、倪勤學(xué)[17]、傅婧[28]等的研究，可能原因是在該提取實(shí)驗(yàn)條件下紫山藥花青苷與提取試劑形成了耐高溫的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)紫山藥花青苷提取的影響

提取時(shí)間是影響花青苷得率的一個(gè)重要因素。由圖5可知，提取時(shí)間在1～3 h內(nèi)，紫山藥花青苷得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)。3 h以后花青苷得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎谧仙剿幓ㄇ嘬盏姆€(wěn)定性差，時(shí)間太長(zhǎng)花青苷部分分解。因此，選擇3 h作為最佳提取時(shí)間。

圖5 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.5 Influence of extraction time on the extraction efficiency of anthocyanins

2.4.3 液料比對(duì)紫山藥花青苷提取的影響

圖6 液料比對(duì)提取效果的影響Fig.6 Influence of liquid/material ratio on the extraction efficiency of anthocyanins

液料比是決定紫山藥中花青苷濃度高低的因素之一，也是實(shí)際生產(chǎn)中必須考慮的重要因素。由圖6可知，在一定范圍內(nèi)，花青苷得率液料比的升高而增加。當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，紫山藥花青苷的得率最大。之后隨著液料比的增大花青苷得率基本趨于不變。20∶1的液料比既有利于紫山藥中花青苷的提取又利于實(shí)際生產(chǎn)中的節(jié)能減排，因此，在5 個(gè)梯度的液料比中20∶1是最佳液料比。

2.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫山藥花青苷提取的影響

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響Fig.7 Influence of ethanol concentration on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖7可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%之間，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大紫山藥花青苷得率逐漸增大，花青苷提取效率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，花青苷得率達(dá)到最高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%并繼續(xù)增加時(shí)花青苷得率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，對(duì)于花青苷這種極性高的黃酮類(lèi)化合物的提取率下降，而對(duì)其他雜質(zhì)的提取率升高。因此，綜合考慮選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%為最佳。

2.4.5 鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)紫山藥花青苷提取的影響

圖8 鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響Fig.8 Influence of hydrochloric acid concentration on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖8可知，在一定范圍內(nèi)，紫山藥中花青苷得率隨著鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增加。鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5?～8?之間時(shí)花青苷得率隨鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化明顯大于鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8?～10?和10?～15?，說(shuō)明在此階段，鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)花青苷得率的影響大于后者。當(dāng)鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15?時(shí)，花青苷得率達(dá)到最大。繼續(xù)增大鹽酸的濃度，花青苷得率呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)?？赡茉蚴亲仙剿幓ㄇ嘬张c鹽酸中的H+形成穩(wěn)定的烊鹽離子而利于紫山藥中花青苷的溶出，同時(shí)當(dāng)鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15?時(shí)，此時(shí)提取溶劑的極性也與紫山藥花青苷的極性最為接近而使得花青苷最大程度的溶出，花青苷得率也達(dá)到最大。因此，紫山藥花青苷的最佳鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15?。

2.4.6 超聲頻率對(duì)紫山藥花青苷提取的影響

圖9 超聲頻率對(duì)提取效果的影響Fig.9 Influence ofultrasonic frequency on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖9可知，當(dāng)超聲頻率在20～80 Hz之間時(shí)，紫山藥花青苷得率隨著超聲頻率的增大而增大。80 Hz時(shí)花青苷得率達(dá)到最大，80 Hz之后花青苷得率基本維持不變。是由于紫山藥中花青苷含量一定的情況下，超聲頻率為80 Hz后花青苷的溶出達(dá)到最大，不再隨超聲頻率的增大增加。因此選擇超聲頻率選擇80 Hz為最佳。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取紫山藥花青苷

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取影響紫山藥花青苷提取效果比較顯著的5 個(gè)因素：X1（提取溫度）、X2（提取時(shí)間）、X3（液料比）、X4（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、X5（鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。利用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)五因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方案，進(jìn)一步進(jìn)行五因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，其中試驗(yàn)序號(hào)1～40為析因試驗(yàn)，41～46為5 個(gè)估計(jì)試驗(yàn)誤差的中心試驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.5.2 響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型建立與顯著性檢驗(yàn)

經(jīng)Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表2中響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性二次多項(xiàng)式回歸擬合，以花青苷得率（Y）為響應(yīng)值，以提取溫度（X1）、提取時(shí)間（X2）、液料比（X3）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4）、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X5）為自變量，建立二次多元回歸方程：

Y=3.94+0.17X1+0.30X2+0.22X3+0.25X4+0.34X5-0.059X1X2+0.10X1X3-0.13X1X4-0.046X1X5-0.060X2X3-0.050X2X4+0.10X2X5+0.049X3X4+0.084X3X5+0.045X4X5-0.54X12-0.047X22-0.13X32-0.054X42+1.833×10-4X52

該方程的回歸分析與方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，回歸方程的各因變量和自變量間的線(xiàn)性關(guān)系明顯，該數(shù)學(xué)模型回歸高度顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)顯著且模型的R2=0.994 6，=0.990 3說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型與試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值間線(xiàn)性關(guān)系顯著，故可以用于該反應(yīng)的理論推測(cè)。

表3 模型和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients

2.5.3 單因素間的交互作用

由F檢驗(yàn)可以判斷自變量對(duì)因變量（紫山藥花青苷得率）的影響順序?yàn)椋篨5（鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞X2（提取時(shí)間）＞X4（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞X3（液料比）＞X1（提取溫度）。其中X1、X2、X3、X4、X5、X1X3、X1X4、X2X5、X12、X32達(dá)到了高度顯著的水平，X1X2、X1X5、X2X3、X2X4、X3X5、X4X5、X22、X42達(dá)到顯著的水平。表明提取溫度和液料比、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的交互作用高度顯著；提取溫度和提取時(shí)間、提取溫度和鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和液料比、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)和鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的交互作用顯著。響應(yīng)面可以反映各單因素（自變量）交互作用對(duì)響應(yīng)值（因變量）影響效果的大小，響應(yīng)面坡度越陡，則表明他們對(duì)響應(yīng)值的影響效果越顯著。各因素的交互作用見(jiàn)圖10、11（僅以X1X3、X1X4為例）。

圖10 提取溫度和液料比對(duì)紫山藥花青苷得率的等高線(xiàn)和響應(yīng)曲面圖Fig.10 Contour and response surface plots for the effect of extraction temperature and material-to-liquid ratio on the yield of purple yam anthocyanins

圖11 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫山藥花青苷得率的等高線(xiàn)和響應(yīng)曲面圖Fig.11 Contour and response surface plots for the effect of extraction temperature and ethanol concentration on the yield of purple yam anthocyanins

2.5.4 提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)線(xiàn)性二次多項(xiàng)式 回歸方程計(jì)算得出紫山藥花青苷最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度80.34 ℃ 、提取時(shí)間3.5 h、液料比24.99∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)18?，此時(shí)，紫山藥花青苷的理論得率為4.986 mg/g，結(jié)合實(shí)際修正后的提取工藝參數(shù)為提取溫度80 ℃、提取時(shí)間3.5 h、液料比25∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)18?。以修正后的提取工藝參數(shù)條件進(jìn)行紫山藥花青苷提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)5 次，得花青苷平均得率為4.966 mg/g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.29%與預(yù)測(cè)值間的相對(duì)誤差為0.40%。

2.6 紫山藥花青苷抗氧化活性

2.6.1 清除·OH效果

圖12 紫山藥花青苷和VC對(duì)·OH的清除效果Fig.12 Scavenging capacity of purple yam anthocyanins and vitamin C on ·OH radical

由圖12可知，紫山藥花青苷對(duì)·OH的清除率明顯強(qiáng)于VC。當(dāng)質(zhì)量濃度在0～0.4 mg/mL之間，隨著質(zhì)量濃度的增大紫山藥花青苷和VC對(duì)·OH的清除率也逐漸增大，且紫山藥花青苷對(duì)·OH的清除率的變化趨勢(shì)與VC的相同，但是明顯高于VC對(duì)·OH的清除率。當(dāng)質(zhì)量濃度在0.4～0.6 mg/mL之間時(shí)紫山藥花青苷對(duì)·OH的清除率雖然任高于VC。總體而言，紫山藥花青苷清除·OH的能力明顯強(qiáng)于VC。

2.6.2 清除O2-·效果

圖13 不同質(zhì)量濃度紫山藥花青苷提取溶液鄰苯三酚體系的中OO2－·的清除作用Fig.13 Scavenging effect of purple yam anthocyanins at various concentrations on O2－· radical

由圖13可知，將不同質(zhì)量濃度的紫山藥花青苷樣品溶液加入到鄰苯三酚體系中，體系的吸光度隨著樣品溶液質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，說(shuō)明紫山藥花青苷提取液對(duì)體系中 的O2-·有顯著的清除作用，且清除O2-·的能力與紫山藥中花青苷的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

3 結(jié) 論

對(duì)紫山藥花青苷的提取采用響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化研究表明，提取溫度、提取時(shí)間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)花青苷得率的影響高度顯著，影響大小的順序?yàn)閄5（鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞X2（提取時(shí)間）＞X4（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞X3（液料比）＞X1（提取溫度）。并且提取溫度和液料比、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和液料比、提取時(shí)間和鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在交互作用。通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件建立出的數(shù)學(xué)模型得出紫山藥花青苷最優(yōu)提取工藝條件為提取溫度80.34 ℃、提取時(shí)間3.5 h、液料比24.99∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)18?。經(jīng)5 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出在修正后的最優(yōu)提取工藝條件下花青苷平均得率達(dá)到4.966 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.29%，與數(shù)學(xué)模型的得率間的相對(duì)誤差小于1.0%。單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)測(cè)得的最佳提取溫度80℃高于現(xiàn)有文獻(xiàn)[6,15,28]報(bào)道的研究，可能原因是在該提取實(shí)驗(yàn)條件下紫山藥花青苷形成了耐高溫的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。具體原因有待對(duì)此結(jié)構(gòu)通過(guò)高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器-電噴霧電離、質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

通過(guò)紫山藥花青苷提取液抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)紫山藥花青苷提取液對(duì)·OH的清除率與花青苷的質(zhì)量濃度有關(guān)，在一定范圍內(nèi)花青苷質(zhì)量濃度越大其清除·OH的能力越強(qiáng)，且明顯強(qiáng)于VC；將不同質(zhì)量濃度的紫山藥花青苷樣品溶液加入到鄰苯三酚體系中，體系的吸光度隨著樣品溶液質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，說(shuō)明紫山藥花青苷 提取液對(duì)體系中的O2-·有顯著的清除作用，且清除O2-·的能力與紫山藥中花青苷的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。綜上所述，紫山藥花青苷提取液有較好的抗氧化活性。對(duì)于紫山藥花青苷提取液中的花青苷類(lèi)組分有待做進(jìn)一步的分離、純化和相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究以確定其抗氧化作用的主要成分及結(jié)構(gòu)和各單組分的活性功能。

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Optimization of Extraction Process for Purple Yam Anthocyanins by Response Surface Methodology and Their Antioxidant Activity

LIU Shui-ying1, LI Xin-sheng1,2,*, DANG Ya1,2, MI Gui1, ZHAO Xuan1, WANG Xin1, HAN Hao1, YANG Zhi-yong1
(1. College of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China; 2. Shaanxi Province Black Organic Food Engineering Technology Research C enter, Shaanxi Key Laboratory of Bio-Resource, Hanzhong 723000, China)

In this paper, the extraction of anthocyanins from purple yam using acidified ethanol was optimized by response surface methodology with Box-Behnken design. A quadratic polynomial model was established with Design-Expert 8.0.6 analysis software. At the same time, the ability of purple yam anthocyanins to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals was studied. Results indicated that the extraction yield of anthocyanins was influenced in decreasing order by the following parameters: hydrochloric acid concentration, extraction time, ethanol concentration, solvent-to-solid ratio, and temperature. Under the optimal conditions: 80 ℃, 3.5 h, a solvent-to-solid ratio of 25:1 (mL/g), and 70% ethanol with 18? hydrochloric acid at a volume ratio of 15:85, experiments led to an average extraction yield of 4.966 mg/g with a relative standard deviation (RSD) of 0. 29%, showing a relative error below 1.0% compared to the expected value. Purple yam anthocyanins had a stronger free radical scavenging activity than vitamin C.

purple yam; anthocyanins; response surface methodology; extraction process; antioxidant

TS207.3

A

1002-6630（2014）22-0084-08

10.7506/spkx1002-6630-201422016

2014-05-28

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目（2014KTCL02-18）；陜西理工學(xué)院科研基金項(xiàng)目（SLGKY14-10）；陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（SLGYCX1419）

劉水英（1987—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)及其在資源生物。E-mail：snutlsy@163.com

*通信作者：李新生（1956—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)樯镔Y源開(kāi)發(fā)及應(yīng)用。E-mail：lxs9@tom.com