酒石酸對(duì)雙孢蘑菇多酚氧化酶活性及熱敏性的影響

周 磊，劉 偉*，劉軍平，鄒立強(qiáng)，方志超

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

酒石酸對(duì)雙孢蘑菇多酚氧化酶活性及熱敏性的影響

周 磊，劉 偉*，劉軍平，鄒立強(qiáng)，方志超

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

以雙孢蘑菇多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）為原料，研究不同濃度的酒石酸處理對(duì)PPO相對(duì)酶活力、熱穩(wěn)定性及熱敏性的影響。結(jié)果表明：隨著酒石酸濃度的增加，多酚氧化酶的相對(duì)酶活力逐漸降低，當(dāng)酒石酸濃度達(dá)到40 mmol/L時(shí)，PPO的相對(duì)酶活力僅為1.41%；隨著酒石酸濃度的增加，PPO熱穩(wěn)定性變差，酒石酸結(jié)合熱處理對(duì)PPO起到更好的失活效果；失活速率常數(shù)（k）值隨酒石酸濃度升高而變大，在50 ℃下，酒石酸濃度為0、10、15、20 mmol/L時(shí)k值分別為1.43×10-2、2.43×10-2、6.78×10-2、57.61×10-2min-1；酶失活活化能（Ea）隨酒石酸濃度升高而變小，當(dāng)酒石酸濃度為0、10、15、20 mmol/L時(shí)Ea分別為191.57、180.05、140.64、67.93 kJ/mol，表明PPO經(jīng)酒石酸處理后熱敏性變低。

多酚氧化酶；酒石酸；相對(duì)酶活力；熱穩(wěn)定性；熱敏性

多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）是自然界分布極廣的一種氧化還原酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中，在植物細(xì)胞組織中，PPO存在的位置因原料的種類、品種及成熟度的不同而有差異[1-2]。多酚氧化酶的酶促反應(yīng)是果蔬貯運(yùn)加工 過程中引起褐變和品質(zhì)劣變的主因之一，褐變反應(yīng)對(duì)果蔬的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)都有很大的影響。PPO的改性一直是研究的熱點(diǎn)，應(yīng)用手段主要有：加熱法[3-4]，物理方法如超靜高壓[5]、脈沖電場(chǎng)[6]、動(dòng)態(tài)高壓微射流[7-8]；多種處理手段相結(jié)合的方法，如超聲結(jié)合水楊酸[9]、高壓結(jié)合溫度[10]、加熱法結(jié)合抗壞血酸[11]；以及化學(xué)方法如亞硫酸鹽[12-13]、有機(jī)酸[12-17]。

目前，在有機(jī)酸對(duì)PPO的活性影響方面有比較多的報(bào)道，Zhao Zhengang等[12]發(fā)現(xiàn)甘蔗多酚氧化酶能被1mmol/L的抗壞血酸強(qiáng)烈抑制；Palma-Orozco等[13]報(bào)道抗壞血酸是曼密蘋果PPO的有效抑制劑；?zel等[14]發(fā)現(xiàn)苯甲酸可以抑制紅柄牛肝菌PPO；Kumar等[15]報(bào)道抗壞血酸可有效抑制荔枝PPO活性；Altunkaya等[16]發(fā)現(xiàn)半胱氨酸可有效抑制萵苣PPO活性。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檸檬酸對(duì)香菇PPO具有抑制作用，經(jīng)60 mmol/L的檸檬酸處理后的PPO相對(duì)酶活力為4.3%[17]。酒石酸是一種羧酸，存在于多種植物中，可作為食品中添加的抗氧化劑，最大的用途是作為飲料添加劑。Todaro等[18]報(bào)道酒石酸能有效抑制茄子多酚氧化酶的活性；于新等[19]研究發(fā)現(xiàn)酒石 酸可有效抑制草菇PPO和過氧化物酶的活性。然而，有關(guān)酒石酸對(duì)PPO熱穩(wěn)定性和熱敏性方面的研究還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)主要以雙孢蘑菇PPO為原料，采用不同濃度的酒石酸處理，測(cè)定PPO的相對(duì)酶活力，并對(duì)酒石酸處理過的PPO進(jìn)行熱處理，測(cè)定經(jīng)不同濃度的酒石酸處理后的PPO在不同溫度下的熱穩(wěn)定性，失活速率常數(shù)及酶失活活化能的變化，為研究蘑菇PPO的酶學(xué)性質(zhì)及抑制PPO的酶活力提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇PPO（700 U/mg） 美國(guó)Worthington Biochemical公司；酒石酸 阿拉丁試劑上海有限公司；鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀 器與設(shè)備

PC-1600紫外光譜儀 上海美譜達(dá)公司；超純水系統(tǒng) 法國(guó)Millipore公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省榮華有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒石酸對(duì)PPO溶液的處理

準(zhǔn)確稱取2.00 mg PPO溶解于10 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）配制成PPO溶 液，稱取不同質(zhì)量的酒石酸分別溶解于10 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）中，配制成濃度為10、20、30、40、50、60、80 mmol/L的酒石酸溶液。采用不同濃度的酒石酸溶液處理PPO溶液，酒石酸最終濃度分別為5、10、15、20、25、30、40 mmol/L，PPO的最終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。

1.3.2 PPO酶活力的測(cè)定

PPO酶活力的測(cè)定參照Liu Wei等[8]的方法，反應(yīng)底物溶液包括0.2 mL 2 mmol/L的鄰苯二酚溶液與2.7 mL 50 mmol/L pH 6.8的磷酸緩沖溶液，該底物溶液預(yù)先在37℃的 水浴鍋內(nèi)恒溫15 min，然后將反應(yīng)底物分別與0.1 mL 0～40 mmol/L酒石酸處理后的PPO酶液（0.1 mg/mL）迅速混合，立即于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，5 min后再次測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品酶活力平行測(cè)定3次。單位時(shí)間內(nèi)，1 mL酶液吸光度變化0.001定義為1 個(gè)酶活力單位，單位為U/min。相對(duì)酶活力的定義：相對(duì)酶活力/%=（處理樣品酶活力/未處理樣品酶活力）×100。

1.3.3 PPO熱穩(wěn)定性分析

經(jīng)酒石酸處理后的P P O熱穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)參照Rapeanu等[20]和Gouzi等[21]的方法，作了部分修改：酒石酸處理后的PPO熱處理在45～60 ℃下進(jìn)行。將2 mL經(jīng)酒石酸處理后的PPO加入到在固定溫度（45、50、55、60 ℃）下預(yù)熱后的試管中，加熱固定時(shí)間后取出，在冰水浴中冷卻至常溫。然后利用上述PPO酶活力測(cè)定方法，測(cè)得處理后的樣品相對(duì)酶活力（At），未經(jīng)處理的樣品則為原酶活力（A0）。每個(gè)樣品酶活力平行測(cè)定3 次。

1.3.4 熱失活曲線及熱敏性分析

酶的熱失活動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析用一級(jí)方程來(lái)描述：

式中：At為處理t時(shí)間（min）后的相對(duì)酶活力/%；k為失活速率常數(shù)/min-1。

上述的一級(jí)反應(yīng)方程式可轉(zhuǎn)變成式（2）：

式中：A0是原酶活力/（U/min）；At是處理t時(shí)間（min）后的相對(duì)酶活力/%；k是失活速率常數(shù)/min-1。

根據(jù)上述公式作圖并計(jì)算出各處理的PPO在不同溫度熱處理下的失活速率常數(shù)（k）。

根據(jù)阿列紐斯定律，可得公式（3）：

式中：k0是阿列紐斯常數(shù)/min-1；k是失活速率常數(shù)/min-1；Ea是酶失活活化能（k J/m o l）；R是氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T為絕對(duì)常數(shù)/K。

根據(jù)上述公式可通過熱失活曲線的斜率計(jì)算出Ea。1.3.5 數(shù)據(jù)分析及處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，取平均值。采用SAS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度酒石酸處理對(duì)PPO相對(duì)酶活力的影響

由 圖1可知，隨著酒石酸濃度增加，PPO的相對(duì)活力逐漸下降，抑制作用越來(lái)越強(qiáng)。當(dāng)酒石酸濃度低于15 mmol/L時(shí)PPO的酶活力變化不大，相對(duì)活力保留在85%以上；當(dāng)酒石酸濃度分別為20、25、30 mmol/L時(shí)，PPO酶活力顯著被抑制，其相對(duì)酶活力分別為63.4%、27.3%、9.15%；當(dāng)酒石酸濃度為40 mmol/L時(shí)，PPO完全失活，其相對(duì)活性僅為1.41%。

圖1 不同濃度的酒石酸對(duì)PPO相對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effect of tartaric acid on relative activity of PPO

研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度的檸檬酸處理后蘑菇PPO其相對(duì)酶活力也發(fā)生了改變[17]，當(dāng)檸檬酸濃度分別為15、30 mmol/L時(shí)PPO相對(duì)酶活力分別為63.0%和24.2%，當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)到60 mmol/L時(shí)PPO才基本失活（相對(duì)酶活力為4.3%），因此，在低濃度范圍（≤15 mmol/L）內(nèi)，檸檬酸對(duì)PPO的抑制作用強(qiáng)于酒石酸；但在較高濃度范圍（≥30 mmol/L）時(shí)酒石酸對(duì)PPO的抑制作用更強(qiáng)。但Todaro等[18]研究了不同有機(jī)酸對(duì)茄子PPO的抑制情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檸檬酸濃度超過0.4 mol/L時(shí)多酚氧化酶活性受到強(qiáng)烈抑制，酒石酸和乙酸對(duì)茄子PPO雖然也有抑制作用，但效果不明顯。于新等[19]發(fā)現(xiàn)100 mg/L的檸檬酸、酒石酸、蘋果酸可有效抑制草菇PPO和過氧化物酶的活性。這表明有機(jī)酸對(duì)PPO活性的影響與PPO的來(lái)源以及有機(jī)酸的種類和濃度有關(guān)。

2.2 酒石酸對(duì)PPO熱穩(wěn)定性的影響

圖2 不同濃度的酒石酸處理后PPO的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermostability of PPO treated with tartaric acid at various concentrations

低濃度的酒石酸對(duì)PPO抑制作用不明顯，高濃度的能顯著抑制PPO活性，故選取中等濃度（10、15、20 mmol/L）的酒石酸處理后的PPO來(lái)做熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。由圖2可知，經(jīng)20 mmol/L酒石酸處理后的PPO在4 個(gè)溫度條件（45、50、55、60 ℃）下均于10 min內(nèi)基本失活；15 mmol/L酒石酸處理后的PPO在45、50、55、60 ℃時(shí)處理30 min后則基本失活；與未經(jīng)酒石酸處理的PPO相比，經(jīng)10 mmol/L酒石酸處理的PPO其熱穩(wěn)定性變化不大，在45、50℃處理30 min后相對(duì)酶活力基本保持在50%以上；而未經(jīng)酒石酸處理的PPO其活性保持較好，特別是在50℃以下。經(jīng)不同濃度酒石酸處理后的PPO在50℃下加熱10 min后，其相對(duì)酶活力分別為79.6%（0 mmol/L）、73.9%（10 mmol/L）、35.9%（15 mmol/L）、0.7%（20 mmol/L）。由此可見，PPO的熱穩(wěn)定性隨著酒石酸濃度的增加而變差，這與其他研究[17,22]發(fā)現(xiàn)PPO的熱穩(wěn)定性隨著酸度的增加而降低一致。

當(dāng)酒石 酸濃度在15 mmol/L以下時(shí)PPO不經(jīng)熱處理其酶活力均在85%以上，即使是濃度為20 mmol/L的酒石酸處理后其相對(duì)酶活力也有63.4%；然而經(jīng)0、10、15、20 mmol/L的酒石酸處理后的PPO，僅在50℃熱處理10 min后，其相對(duì)酶活力分別降至79.6%、73.9%、35.9%和0.7%。由此可見，中低濃度（15、20 m mol/L）的酒石酸結(jié)合一定溫度的熱處理在短時(shí)間內(nèi)就能對(duì)PPO起到很好的失活效果。Chow等[11]研究發(fā)現(xiàn)加熱法和抗壞血酸處理聯(lián)用對(duì)蘋果PPO會(huì)起到更好的失活效果。

2.3 酒石酸對(duì)PPO熱失活曲線及熱敏性的影響

根據(jù)圖3計(jì)算出各曲線的斜率并得出失活速率常數(shù)（k），如表1所示。在一定的酒石酸濃度下，隨著溫度的升高k值明顯升高，如酒石酸濃度為15 mmol/L時(shí)，45、50、55、60 ℃下的k值分別為3.65×10-2、6.78×10-2、13.91×10-2、42.47×10-2min-1，這和Gouzi等[21]報(bào)道的k值隨溫度升高而升高一致。在一定的溫度下，k值隨著酒石酸濃度的增加也明顯升高，如在50℃下，酒石酸濃度為0、10、15、20 mmol/L時(shí)k值分別為1.43×10-2、2.43×10-2、6.78×10-2、57.61×10-2min-1，這與Kanade等[22]報(bào)道的k值隨酸度升高而升高的結(jié)果一致。這也說(shuō)明了酒石酸濃度越高PPO的熱穩(wěn)定性越差。由此可見，在一定的酒石酸濃度和溫度范圍內(nèi)，PPO的失活速率常數(shù)（k）值與酒石酸處理濃度和溫度都呈正相關(guān)性。

圖3 酒石酸處理后的PPO在45～60 ℃下的熱失活曲線Fig.3 Thermal inactivation curves of tartaric acid-treated PPO in the temperature range of 45-60 ℃

由阿列紐斯定律可計(jì)算出各濃度的酒石酸處理后的PPO的Ea，0、10、15、20 mmol/L對(duì)應(yīng)的酶失活活化能分別為191.57、180.05、140.64、67.93 kJ/mol，隨著酒石酸處理濃度的升高，酶失活活化能Ea越來(lái)越小。Ea表示PPO失活速率k隨溫度變化的大?。篍a越小，失活速率k隨溫度的變化就越小。故PPO熱敏性隨著酒石酸濃度的升高而降低，這與其他研究[17,23]報(bào)道一致：經(jīng)過酸處理后，PPO的Ea隨著酸度的增加而減小，熱敏性降低。

表1 各濃度酒石酸處理后PPO的k值Table 1 Inactivation rate constants of tartaric acid-treated PPO ×10-2min-1

3 結(jié) 論

隨著酒石酸濃度的增加，PPO的相對(duì)酶活力逐漸降低，當(dāng)酒石酸濃度達(dá)到40 mmol/L時(shí)，PPO基本完全失活，相對(duì)酶活力僅為原酶活力的1.41%，酒石酸能較好地抑制蘑菇PPO的活性；隨著酒石酸濃度的增加，PPO的熱穩(wěn)定性逐漸變差，中低濃度（15、20 mmol/L）的酒石酸結(jié)合一定溫度的熱處理在短時(shí)間內(nèi)就能對(duì)PPO起到很好的失活效果；隨著酒石酸濃度的增加，失活速率常數(shù)（k）值變大，酶失活活化能（Ea）變小，PPO熱敏性變低。

[1] GARCíA S C, BUZALEH A M. Polyphenoloxidase: an enzyme widespread in fruits[J]. Biochemical Education, 1994, 22(3): 152-153.

[2] DICKO M H, HILHORST R, GRUPPEN H, et al. Comparison of content in phenolic compounds, polyphenol oxidase, and peroxidase in grains of fifty sorghum varieties from Burkina Faso[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(13): 3780-3788.

[3] NDIAYE C, XU Shiying, WANG Zhang. Steam blanching effect on polyphenoloxidase, peroxidase and colour of mango (Mangifera indica L.) slices[J]. Food Chemistry, 2009, 113(1): 92-95.

[4] SCHWEIGGERT U, SCHIEBER A, CARLE R. Inactivation of peroxidase, polyphenoloxidase, and lipoxygenase in paprika and chili powder after immediate thermal treatment of the plant material[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2005, 6(4): 403-411.

[5] YI Jianyong, JIANG Bin, ZHANG Zhong, et al. Effect of ultrahigh hydrostatic pressure on the activity and structure of mushroom (Agaricus bisporus) polyphenoloxidase[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(2): 593-599.

[6] ZHONG Kui, WU Jihong, WANG Zhengfu, et al. Inactivation kinetics and secondary stru ctural change of PEF-treated POD and PPO[J]. Food Chemistry, 2007, 100(1): 115-123.

[7] LIU Wei, LIU Jianhua, XIE Mingyong, et al. Characterization and high-pressure microfluidization-induced activation of polyphenoloxidase from Chinese pear (Pyrus pyrifolia Nakai)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(12): 5376-5380.

[8] LIU Wei, LIU Jianhua, LIU Chengmei, et al. Activation and conformational changes of mushroom polyphenoloxidase by high pressure microfluidization treatment[J]. Innovative Food Science andEmerging Technologies, 2009, 10(2): 142-147.

[9] YANG Zhenfeng, CAO Shifeng, CAI Yuting, et al. Combination of salicylic acid and ultrasound to control postharvest blue mold caused by Penicillium expansum in peach fruit[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2011, 12(3): 310-314.

[10] TEREFE N S, YANG Y H, KNOERZER K, et al. High pressure and thermal inactivation kinetics of polyphenol oxidase and peroxidase in str awberry puree[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2010, 11(1): 52-60.

[11] CHOW Y N, LOUARME L, BONAZZI C, et al. Apple polyphenoloxidase inactivation during heating in the presence of ascorbic acid and chlorogenic acid[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 761-767.

[12] ZHAO Zhengang, ZHU Licai, YU Shujuan, et al. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from sugarcane (Saccharum off i cinarum L.)[J]. Zuckerindustrie, 2011, 136(5): 296-301.

[13] PALMA-OROZCO G, ORTIZ-MORENO A, DORANTESáLVAREZ L, et al. Purification and partial biochemical characterization of polyphenol oxidase from mamey (Pouteria sapota)[J]. Phytochemistry, 2011, 72(1): 82-88.

[14] ?ZEL A, COLAK A, ARSLAN O, et al. Puri cation and characterisation of a polyphenol oxidase from Boletus erythropus and investigation of its catalytic ef ciency in selected organic solvents[J]. Food Chemistry, 2010, 119(3): 1044-1049.

[15] KUMAR S, MISHRA B B, SAXENA S, et al. Inhibition of pericarp browning and shelf life extension of litchi by combination dip treatment and radiation processing[J]. Food Chemistry, 2012, 131(4): 1223-12 32.

[16] ALTUNKAYA A, G?KMEN V. Effect of various inhibitors on enzymatic browning, antioxidant activity and total phenol content of fresh lettuce (Lactuca sativa)[J]. Food Chemistry, 2 008, 107(3): 1173-1179.

[17] LIU Wei, ZOU Liqiang, LIU Junping, et al. The effect of citric acid on the activity, thermodynamics and conformation of mushroom polyphenoloxidase[J]. Food Chemistry, 2013, 140(1/2): 289-295.

[18] TODARO A, CAVALLARO R, ARGENTO S, et al. Study and characterization of polyphenol oxidase from eggplant (Solanum melongena L.)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(20): 11244-11248.

[19] 于新, 馮彤, 李遠(yuǎn)志, 等. 食品添加劑對(duì)草菇PPO和POD活性的影響[J].食品工業(yè)科技, 2002, 23(5): 10-13.

[20] RAPEANU G, LOEY A V, SMOUT C, et al. Biochemical characterization and process stability of polyphenoloxidase extracted from Victoria grape (Vitis vinifera ssp. Sativa)[J]. Food Chemistry, 2006, 94(2): 253-261.

[21] GOUZI H, DEPAGNE C, CORADIN T. Kinetics and thermodyna mics of the thermal inactivation of polyphenol oxidase in an aqueous extract from Agaricus bisporus[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(1): 500-506.

[22] KANADE S R, PAUL B, RAO A G A, et al. The conformational state of polyphenol oxidase from field bean (Dolichlos lablab) upon SDS and acid-pH activation[J]. Biochemical Journal, 2006, 395(3): 551-562.

[23] WEEMAES C A, LUDIKHUYZE L R, van DEN BROECK I, et al. Effect of pH on pressure and thermal inactivation of avocado polyphenol oxidase: a kinetic study[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(7): 2785-2792.

Effect of Tartaric Acid on Activity and Thermosensitivity of Polyphenol Oxidase from the Edible Mushroom Agaricus bisporus

ZHOU Lei, LIU Wei*, LIU Jun-ping, ZOU Li-qiang, FANG Zhi-chao
(State Key Laborator y of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

The effect of tartaric acid treatment at various concentrations on relative activity, thermostability and thermosensitivity of polyphenol oxidase (PPO) from the edible mushroom Agaricus bisporus was studied. The results showed that the relative activity of PPO decreased gradually with increasing tartaric acid concentration and was only 1.41% of its original activity when the tartaric acid concentration was up to 40 mmol/L. In addition, the thermostability of PPO decreased, and the inactivat ing effect of tartar ic acid combined with heat was enhanced. Inactivation rate constant (k) of PPO increased with increasing tartaric acid concentration, and the k values were 1.43 × 10-2, 2.43 × 10-2, 6.78 × 10-2, 57.61 ×10-2min-1, respectively when the tartaric acid concentrations were 0, 10, 15 and 20 mmol/L at 50 ℃, while the activation energy (Ea) showed the opposite trend, which was calculated to be 191.57, 180.05, 140.64 and 67.93 kJ/mol, respectively, when the tartaric acid con centrations were 0, 10, 15 and 20 mmol/L, suggesting weakened thermosensitivity of PPO.

polyphenol oxidase; tartaric acid; relative activity; thermostability; thermosensitivity

Q554.1

A

1002-6630（2014）15-0178-05

10.7506/spkx1002-6630-201415036

2013-07-30

江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)對(duì)象計(jì)劃項(xiàng)目（20112BCB23003）

周磊（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。E-mail：ncuskzhoulei@163.com

*通信作者：劉偉（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称犯咝录夹g(shù)與資源綜合利用。E-mail：liuwei@ncu.edu.cn