參歸益智方對阿爾茨海默病大鼠海馬組織VEGF、p－p38MAPK表達的影響

張會凱，劉亞敏，冀 緒，張 江，李瑞杰

（1.河北省新樂市中醫(yī)醫(yī)院中風(fēng)病二科，河北石家莊 050700；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，天津 300162）

參歸益智方對阿爾茨海默病大鼠海馬組織VEGF、p－p38MAPK表達的影響

張會凱1，劉亞敏2，冀 緒1，張 江1，李瑞杰1

（1.河北省新樂市中醫(yī)醫(yī)院中風(fēng)病二科，河北石家莊 050700；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，天津 300162）

目的 觀察參歸益智方對阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）大鼠行為學(xué)障礙的改善作用并探究其作用機制。方法 將40只SD大鼠隨機分為空白組，模型組，參歸益智方低、高劑量組，每組10只。采用β淀粉樣蛋白1－42雙側(cè)注射大鼠海馬區(qū)誘導(dǎo)AD模型，通過Morris水迷宮檢測AD大鼠行為學(xué)改變，采用Western blotting檢測大鼠海馬組織血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen－activated protein kinase，p38MAPK）及磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylation of p38mitogen－activated protein kinase，p－p38MAPK）的表達水平。結(jié)果 給藥4周末，參歸益智方能夠劑量依賴地降低AD大鼠Morris水迷宮試驗的逃避潛伏期（P＜0.05），顯著提高穿越平臺次數(shù)（P＜0.05），劑量依賴地提高AD大鼠海馬VEGF表達水平，顯著降低AD大鼠海馬p－p38MAPK表達水平。結(jié)論 參歸益智方改善AD大鼠行為學(xué)障礙的作用與其提高海馬區(qū)VEGF表達，降低p－p38MAPK表達有關(guān)。

參歸益智方；阿爾茨海默?。谎軆?nèi)皮生長因子；絲裂原活化蛋白激酶；β淀粉樣蛋白

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是臨床上老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進行性認(rèn)知功能障礙、記憶力減退及行為異常等為主要特征，嚴(yán)重威脅著老年人的健康。早在25年前就有國外研究者認(rèn)為血管內(nèi)皮功能障礙參與了AD的發(fā)生和發(fā)展［1］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的特異性有絲分裂原，可以促進動脈、靜脈以及淋巴管來源的內(nèi)皮細(xì)胞的生長［2］。因此，對AD患者血管危險因素進行干預(yù)可能是AD預(yù)防及治療的一條新途徑。本研究通過觀察參歸益智方對AD模型大鼠行為學(xué)改變及海馬組織VEGF、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen－activated protein kinase，p38 MAPK）蛋白表達的影響，探討其對AD的治療作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物 采用SPF級雄性SD大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供（合格證號915013），體質(zhì)量為（250±50）g，月齡4個月。

1.2 主要藥物和試劑 參歸益智方：每劑含生藥232g，加水浸泡30min，文火煎煮2次，煎液合并，過80目篩過濾，95℃水浴濃縮成2.5g／ml的混懸液，高壓滅菌，4℃冰箱密閉保存?zhèn)溆?，用前搖勻。β淀粉樣蛋白1－42（amyloidβ－protein 1－42，Aβ1－42）及β－actin單克隆抗體：美國Sigma公司，批號AAP519Q；VEGF、p38MAPK及磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylation of p38mitogenactivated protein kinase，p－p38MAPK）單克隆抗體：美國Cell Signaling公司，批號分別為E12501、126470、125503。

1.3 主要儀器 XR－XM101型Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；NARISHIGESN－3型立體

定位儀：日本生產(chǎn)；Gel Doc XR型Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)：北京德潤科儀科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 動物模型復(fù)制及分組［3］將大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組，模型組，參歸益智方低、高劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠進行模型復(fù)制。Aβ1－42用0.9％無菌生理鹽水稀釋成1μg／μl的溶液，37℃恒溫箱中孵育1周老化，10％水合氯醛（4ml／kg）腹腔注射麻醉后，參照包新民《大鼠腦立體定位圖譜》［3］定位，采用大鼠腦立體定位儀定位，前囟后3mm，正中矢狀縫左右旁開2mm，硬腦膜下3.5mm，即大鼠大腦海馬區(qū)，雙側(cè)注射Aβ1－42各5μl，每側(cè)注射時間不少于5min，留針5min，緩慢撤針，以防藥物通過針孔溢出，石蠟封口，無菌縫合。

2.2 給藥方法 將參歸益智方按文獻［4］折算成大鼠的等效劑量，高劑量按25g／kg、低劑量按12.5 g／kg灌胃給藥；空白組和模型組僅給予等容積生理鹽水。模型復(fù)制2周后，對4組大鼠均分別灌胃給予相應(yīng)藥物或生理鹽水，每日2次，共4周。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 行為學(xué)檢測：Morris水迷宮［5］是一個直徑為200cm、深60cm的圓形水箱，平均分成4個象限，水面下2cm處有1個直徑為9cm的平臺，位于其中1個象限的中心，實驗分為定位航行和空間探索實驗。模型復(fù)制1周后及藥物干預(yù)4周后分別進行水迷宮實驗，前5d進行定位航行實驗，所有大鼠實驗前均不進行水迷宮訓(xùn)練，以排除人為干擾等因素。將大鼠面向池壁分4個象限放入水中，記錄大鼠從入水至爬上平臺的時間，即逃避潛伏期。如果在120s內(nèi)未能發(fā)現(xiàn)平臺，將其引至平臺停留10s，這個象限記為120s，上午和下午各進行1次，每日2次，4個象限的平均值記為大鼠當(dāng)日的結(jié)果。第6天撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入水中，記錄60s內(nèi)游過原平臺的次數(shù)，上午和下午各進行1次，取2次的平均值作為該只大鼠游過平臺的次數(shù)。

2.3.2 p－p38MAPK的表達：實驗結(jié)束后，采用10％水合氯醛腹腔注射將各組大鼠麻醉，斷頭，低溫分離海馬組織，超聲勻漿器破碎海馬組織，低溫（4℃）10 000r／min離心10min，取上清，即為海馬的蛋白提取物。采用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度；以β－actin作為內(nèi)參照，采用Western Blotting法測定VEGF、p38MAPK、p－p38 MAPK的表達水平。清洗玻璃板、烤干、灌膠，取60 μg目的蛋白，100℃加熱10min，經(jīng)10％SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5％脫脂牛奶封閉1h后，加入VEGF、p38MAPK、p－p38MAPK抗體（1∶500），4℃水平搖床過夜。第2天TPBS液洗滌4次，每次5min，加入二抗羊抗兔稀釋液（1∶1 000）室溫下避光搖床上孵育2h，常規(guī)洗膜后采用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)掃膜、分析，得出β－actin、VEGF、p38MAPK和p－p38MAPK的灰度值，分別以VEGF、p38MAPK與相應(yīng)β－actin灰度值比值表示VEGF、p38MAPK蛋白的表達水平；p－p38MAPK與p38MAPK灰度值比值表示p－p38蛋白的表達水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進行統(tǒng)計學(xué)描述。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用SNK－q檢驗（方差齊）或Dunnett's T3（方差不齊）進行檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)檢測結(jié)果 模型復(fù)制1周末，模型組，參歸益智方高劑量組和低劑量組較空白組逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。給藥4周末，參歸益智方高劑量組和低劑量組較模型組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)顯著增多（P＜0.05）；參歸益智方高劑量組較低劑量組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)顯著增多（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗結(jié)果比較（±s）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與參歸益智方低劑量組比較，△P＜0.05。

組 別n逃避潛伏期／s周末空 白10 44.08±2.88 46.42±4.92 6.05±1.34 6.05±1.14模型復(fù)制1周末給藥4周末穿越平臺次數(shù)模型復(fù)制1周末給藥4模 型10 78.56±4.55＊77.29±6.69 3.95±1.07＊3.65±0.62參歸益智方（低）10 75.56±5.49＊63.64±4.35＃4.05±0.98＊4.45±0.86＃參歸益智方（高）10 77.48±6.97＊53.98±4.46?！?.15±0.91＊5.25±0.52?！?/p>

3.2 大鼠海馬組織VEGF、p38MAPK、p－p38MAPK蛋白表達水平比較 與空白組比較，模型組VEGF表達水平顯著降低（P＜0.05），p－p38MAPK表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，參歸益智方高劑量組和低劑量組VEGF表達水平顯著升高（P＜0.05），p－p38MAPK表達水平顯著降低（P＜0.05）；參歸益智方高劑量組與低劑量組VEGF、p－p38MAPK表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。4組p38MAPK表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠海馬VEGF、p38MAPK及p－p38MAPK表達水平比較（Western blotting法）

表2 各組大鼠海馬中VEGF、p38MAPK、p－p38MAPK表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠海馬中VEGF、p38MAPK、p－p38MAPK表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與參歸益智方低劑量組比較，△P＜0.05。

組 別n VEGF p38MAPK p－p38MAPK空 白10 0.79±0.04 0.72±0.13 0.18±0.04模 型10 0.33±0.03＊0.73±0.11 0.55±0.06＊參歸益智方（低）10 0.45±0.04＃0.76±0.14 0.38±0.05＃參歸益智方（高）10 0.62±0.10?！?.81±0.12 0.24±0.04?！?/p>

4 討論

明代張景岳第一次提出了“癡呆”，“癡呆者，凡平素?zé)o痰，而或以郁結(jié)，或以不遂，或以思慮，或以疑惑，或以驚恐而漸癡呆，言辭顛倒，舉動不經(jīng)……其證則千奇萬怪，無所不知?！保ā毒霸廊珪るs癥謨》）歷代很多醫(yī)家認(rèn)為腎虧、腎精不足是老年癡呆的發(fā)病根本。腎乃先天之本，藏精主骨生髓通于腦，腎所藏之精氣為人體生命之本，在人的生長壯老已的過程中起著主導(dǎo)作用，多數(shù)醫(yī)家從腎精不足來進行治療，以補腎填精、健腦益智來延緩衰老和治療老年癡呆［6］。參歸益智方由人參、當(dāng)歸、何首烏、黃芪、丹參、川芎、赤芍、水蛭、熟地黃、菟絲子、半夏、茯苓、炙甘草組成，其中人參甘微苦溫，入心脾肺經(jīng)，大補元氣、安神益智，有“百草藥王”的美稱；當(dāng)歸甘補辛行，溫通質(zhì)潤，甘溫微澀，專能補血，入心肝脾經(jīng)，為“血家之圣藥”；何首烏入肝腎二經(jīng)，甘溫微澀，補益精血，收斂精氣，為須發(fā)早白、早衰要藥。三藥配伍，共為君藥，奏補益氣血、填精益髓、健腦益智之功。黃芪補氣，丹參活血調(diào)經(jīng)、清心安神，川芎活血行氣，為“血中氣藥”，赤芍涼血活血，水蛭破血消癥，共為臣藥，益氣活血。佐以熟地黃滋補肝腎、填精益髓，菟絲子平補肝脾腎，茯苓健脾安神，半夏燥濕化痰，甘草調(diào)和藥性。諸藥合用具有補腎健腦、益氣活血、化痰開竅的功效。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Aβ是老年斑的主要成分，對AD的病理和發(fā)展起決定性作用，Aβ持續(xù)激活炎性修復(fù)機制，將正常情況下的急性反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝仔該p傷，激活大量炎性因子，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死［7］。模型復(fù)制1周末，模型組、低劑量組和高劑量組比空白組逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少，出現(xiàn)了AD的行為學(xué)改變，提示側(cè)腦室注射Aβ1－42可成功復(fù)制AD模型。

目前，腦血管病已成為AD的危險因素之一。研究發(fā)現(xiàn)AD患者出現(xiàn)癡呆癥狀前就已經(jīng)出現(xiàn)了腦血管病變，長期的腦供血不足使腦組織缺乏葡萄糖和氧氣，高爾基體受損，ATP合成減少，異常APP翻譯加工，生成大量的具有神經(jīng)毒性的Aβ，促進和加速老年斑的形成［8］。p38MAPK通路能被各種細(xì)胞外刺激、炎性因子等啟動，被磷酸活化后移位入核，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)Caspase－3活化，上調(diào)腫瘤壞死因子－α的表達，促使細(xì)胞凋亡［9］。本研究中，VEGF在藥物干預(yù)組中表達明顯升高，并且隨著劑量增加，升高更為明顯，說明參歸益智方能夠提高VEGF的表達。血管內(nèi)皮功能得到不同程度恢復(fù)，可促進腦部血液循環(huán)，加速對Aβ的吸收和分解，減少Aβ的沉積［10］。VEGF的持續(xù)表達能促進缺血區(qū)血管的生成，在體外培養(yǎng)細(xì)胞的實驗中，加入VEGF可以使去血清培養(yǎng)的腦神經(jīng)細(xì)胞存活的數(shù)目增多［11］。AD轉(zhuǎn)基因小鼠連續(xù)3d腹腔注射VEGF，海馬組織Aβ沉積明顯減少，學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯改善［12］。4組p38 MAPK表達無明顯差異，p－p38MAPK在模型組表達水平最高，在低劑量組表達水平顯著下降，在高劑量組表達水平較低劑量組顯著降低，表明Aβ的沉積可以誘導(dǎo)大腦海馬炎性反應(yīng)，使炎性細(xì)胞因子及p－p38MAPK過度表達。p38MAPK信號通路的激活與AD病理過程中的炎性機制是密切相關(guān)的，參歸益智方能夠抑制p－p38MAPK信號分子的表達，減少炎性因子的釋放，抑制細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，參歸益智方能劑量依賴性地改善AD大鼠的行為學(xué)障礙，其機制與上調(diào)海馬

VEGF表達水平，抑制海馬p－p38MAPK表達水平具有一定相關(guān)性。

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Effects of Shengui Yizhi Prescription on Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Phosphorylated p38 Mitogen－Activated Protein Kinase in Hippocampus of Rats with Alzheimer's Disease

ZHANG Hui－kai1，LIU Ya－min2，JI Xu1，ZHANG Jiang1，LI Rui－jie1
（1.Second Department of Stroke，Xinle Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hebei Shijiazhuang 050700，China；2.Department of Pathology，Affiliated Hospital of Armed Police Logistics College，Tianjin 300162，China）

Objective To observe the efficacy of Shengui Yizhi Prescription in the treatment of behavioral disturbance among rats with Alzheimer's disease（AD）and to investigate its action mechanism.Methods Forty Sprague－Dawley rats were randomly and equally divided into blank group，model group，and low－，and highdose Shengui Yizhi Prescription groups.Beta－amyloid（1－42）was injected into the bilateral hippocampus of rats to induce an AD model.The learning and memory ability was evaluated by Morris water maze（MWM）test.The expression of vascular endothelial growth factor（VEGF），p38mitogen－activated protein kinase（p38MAPK），and phosphorylated p38MAPK（p－p38MAPK）was measured by Western blotting.Results At the end of 4－week treatment，Shengui Yizhi Prescription reduced escape latency（P＜0.05）and significantly increased the number of platform crossings（P＜0.05）in a dose－dependent manner，as shown by the MWM test；in addition，it increased the expression of VEGF in the hippocampus and significantly reduced the expression of p－p38MAPK in the hippocampus in a dose－dependent manner.Conclusion Shengui Yizhi Prescription can reduce behavioral disturbance in AD rats，possibly by increasing VEGF expression and reducing p－p38MAPK in the hippocampus.

Shengui Yizhi Prescription；Alzheimer's disease；vascular endothelial growth factor；mitogenactivated protein kinase；beta－amyloid

R743

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.024

2014－12－31）

張會凱（1977－），男，碩士，主治醫(yī)師