以尿鈣排泄量為效應(yīng)指標(biāo)評價(jià)枸櫞酸氫鉀鈉顆粒人體生物等效性

張 華，劉 沙，李 榮，王本杰，郭瑞臣

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012；2.山東萬杰醫(yī)學(xué)院藥學(xué)教研室，山東淄博255213；3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床藥理研究所，山東濟(jì)南250012）

以尿鈣排泄量為效應(yīng)指標(biāo)評價(jià)枸櫞酸氫鉀鈉顆粒人體生物等效性

張 華1，2，3，劉 沙3，李 榮3，王本杰3，郭瑞臣3

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012；2.山東萬杰醫(yī)學(xué)院藥學(xué)教研室，山東淄博255213；3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院臨床藥理研究所，山東濟(jì)南250012）

目的以24 h尿液鈣離子累計(jì)排泄量為指標(biāo)，比較國產(chǎn)和進(jìn)口枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的生物等效性。方法36名男性健康志愿者按自身交叉設(shè)計(jì)，隨機(jī)口服枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的受試制劑（國產(chǎn)）或參比制劑（進(jìn)口）5.0 g，（洗脫期7 d）。分別收集給藥前（空白）和給藥后0～2、2～4、4～6、6～8、8～10，10～12、12～24 h的尿液，記錄尿量，采用原子吸收分光光度法測定尿液鈣離子濃度，計(jì)算給藥前、后24 h尿液鈣累積排泄量。結(jié)果受試制劑給藥前、后24 h尿鈣累積排泄量為（128.47±76.45）mg和（163.53±81.28）mg；參比制劑給藥前、后24 h尿鈣累積排泄量為（128.34±59.55）mg和（179.65±103.96）mg。給予受試制劑和參比制劑后24 h尿鈣排泄量分別比用藥前增加（35.06±61.26）mg和（51.31±73.18）mg，兩制劑間沒有顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論國產(chǎn)和進(jìn)口枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑具有生物等效性，尿液鈣離子累計(jì)排泄量可用于國產(chǎn)和進(jìn)口枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑生物等效性評價(jià)。

枸櫞酸氫鉀鈉顆粒；參比制劑；受試制劑；鈣；生物等效性；原子吸收分光光度法

泌尿系統(tǒng)結(jié)石是影響人類健康的一種嚴(yán)重疾病，低枸櫞酸癥和高鈣是引起結(jié)石的主要原因，口服枸櫞酸氫鉀鈉可降低尿液鈣離子濃度，增加尿液pH值和枸櫞酸根濃度［1］。通過增加尿酸和胱氨酸結(jié)石的可溶性，溶解尿酸結(jié)石，防止新的結(jié)石的形成［2］。臨床主要用于胱氨酸結(jié)石和胱氨酸尿的維持治療。本試驗(yàn)采用簡便、靈敏的火焰原子吸收分光光度計(jì)法測定尿液鈣濃度［3］，以尿鈣累積排泄量為指標(biāo)，評價(jià)國產(chǎn)枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑（受試制劑）與進(jìn)口枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑（參比制劑）的生物等效性［4］，為其新藥注冊和臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品、試劑和儀器 枸櫞酸氫鉀鈉顆粒受試制劑［A，規(guī)格：2.43 g／2.5 g（以K6Na6H3（C6H5O7）5計(jì)），2.5 g／袋，批號：1007901，山東京衛(wèi)制藥有限公司］；枸櫞酸氫鉀鈉顆粒參比制劑［R，規(guī)格：97.1 g／100 g，100 g／聽，批號：0918638，德國馬博士大藥廠生產(chǎn)（商品名友來特）］。娃哈哈飲用純凈水（批號：20110713，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn)）；鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000μg·mL－1，批號：GSB07－1263－2000，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；硝酸（優(yōu)級純65%～68%，批號：20060807，上海試劑四廠）；氧化鑭（高純試劑，批號：F200090219，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。Solaar M－6原子吸收分光光度計(jì)（英國Thermo Elemental公司，）；WM－2H型無油氣體壓縮機(jī)（天津市醫(yī)療器械二廠）；Sartorius BS224S電子天平（量程220 g，精度0.1 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 受試者選擇 健康男性志愿者36名，年齡（24.9±1.06）歲，體重（67.1±6.12）kg，統(tǒng)一進(jìn)行查體及實(shí)驗(yàn)室檢查。所有志愿者無心、肝、腎、消化道、精神神經(jīng)系統(tǒng)異常，非過敏性體質(zhì)，無藥物過敏史，試驗(yàn)前2周內(nèi)無用藥史，3個(gè)月內(nèi)未用過已知對某臟器有損害的藥物，所有受試者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)枸櫞酸氫鉀鈉顆粒臨床試驗(yàn)批件要求和國家新藥審評中心《化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》，設(shè)計(jì)枸櫞酸氫鉀鈉顆粒人體生物等效性研究方案，試驗(yàn)方案經(jīng)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院國家藥品臨床研究機(jī)構(gòu)倫理委員會批準(zhǔn)。試驗(yàn)于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院國家藥品臨床研究機(jī)構(gòu)Ⅰ期臨床試驗(yàn)病房內(nèi)進(jìn)行，具有相應(yīng)娛樂設(shè)施和休息場所。試驗(yàn)過程有相應(yīng)的醫(yī)療保護(hù)和搶救措施，主要研究者具備相應(yīng)研究資質(zhì)和豐富經(jīng)驗(yàn)，可充分保證受試者安全和試驗(yàn)的順利進(jìn)行。

采用單劑口服雙周期、雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。36名受試者按體重分層后隨機(jī)分為兩組，每組18人。試驗(yàn)期間統(tǒng)一進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐，飲用純凈水，禁食補(bǔ)鈣制劑及對胃腸強(qiáng)刺激性食物，保證每日提供鈣9.35 mmol，使鈣的攝入和排出趨于穩(wěn)定。受試者試驗(yàn)前二日入?、衿诓》?，試驗(yàn)前一日采集受試者給藥前（空白期）尿液，試驗(yàn)日晨7∶00，單次口服受試制劑或參比制劑5.0 g，250 mL溫開水溶解送服，收集給藥后尿液。

試驗(yàn)前后尿液分段采集，分別為0～2、2～4、4～6、6～8、8～10，10～12、12～24 h，記錄尿液體積，留取10 mL，分雙份－20℃冷凍待測。清洗期為7 d，于第8天兩組志愿者交叉服藥，進(jìn)行第二周期試驗(yàn)。

1.4 尿液鈣離子濃度測定 采用原子吸收分光光度計(jì)測定尿液中鈣離子的濃度。儀器參數(shù)燈電流：4 mA，檢測波長：422.7 nm，光譜通帶寬度：0.5 nm，火焰類型為Air－C2H2，燃?xì)饬髁浚?.4 L·min－1，燃燒器高度：11.0 mm。

尿樣室溫中融化，取1mL加入5mL比色管中，加入1 mL硝酸，混勻，放置5 min，水定容至刻度?；靹蚝笕?mL溶液，置于5 mL容量瓶中，用氧化鑭溶液定容至刻度，混勻，上機(jī)測定。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 分別精密量取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，置100 mL容量瓶中，加20 mg·mL－1氧化鑭溶液至刻度，搖勻。配制成濃度為0.5、1、2、4、6、8、10μg·mL－1鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定相應(yīng)吸光度，每個(gè)濃度測5次。以鈣濃度作為X，相對應(yīng)的吸光度值作為Y，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝0.025 0＋0.040 01X（r＝0.999 8，線性范圍為0.5～10μg·mL－1），最低定量限為0.5μg·mL－1。

2.1.2 精密度和回收率 分別精密量取0.05、0.5、0.9 mL鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100 mL容量瓶中，加20μg·mL－1氧化鑭溶液到刻度，搖勻。每個(gè)濃度于1 d內(nèi)測定25次，考察批內(nèi)精密度。每個(gè)濃度連續(xù)測定3 d，每天測定25次，考察批間精密度；根據(jù)測定濃度計(jì)算尿鈣相對回收率。方法精密度良好，批內(nèi)、批間精密度均＜5%；回收率均101%～105%，可滿足尿鈣測定要求。

2.1.3 穩(wěn)定性 取低、中、高（0.5、5、9μg·mL－1）濃度的質(zhì)控樣品，分別測定室溫放置7 d、14 d、－20℃存放15 d、－20℃存放24 h凍融2次的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液室溫7 d、14 d，－20℃存放15 d及－20℃存放24 h凍融2次均穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）在0.4%～3.7%內(nèi)。

2.2 24 h尿量、尿鈣濃度和尿鈣排泄量 5.0 g枸櫞酸氫鉀鈉顆粒試驗(yàn)制劑和參比制劑給藥前、后24 h各時(shí)間段尿量、尿鈣濃度及尿鈣排泄量，見表1、2。

表1 給受試制劑前后尿量、尿鈣濃度（n＝36，±s）

表1 給受試制劑前后尿量、尿鈣濃度（n＝36，±s）

時(shí)間（h）用藥前 用藥后尿量（mL）鈣濃度（g·mL－1）尿量（mL）鈣濃度（g·mL－1）4 49.81±63.16 2～4 263.89±147.6 67.97±71.32 337.42±210.80 52.63±46.83 4～6 229.47±140.34 84.89±49.07 399.33±218.66 80.43±41.84 6～8 337.61±178.57 43.42±32.35 390.39±194.05 55.34±34.46 8～10 370.22±212.37 48.10±36.70 524.06±254.21 42.97±25.34 10～12 291.33±166.55 49.88±38.48 418.22±215.24 56.92±42.42 12～24 487.25±253.76110.55±71.77 673.58±38 0～2 216.64±125.28 63.37±56.16 340.33±215.5 5.90 59.34±35.22

表2 給參比制劑前后尿量、尿鈣濃度（n＝36，±s）

表2 給參比制劑前后尿量、尿鈣濃度（n＝36，±s）

時(shí)間（h）用藥前 用藥后尿量（mL）鈣濃度（g·mL－1）尿量（mL）鈣濃度（g·mL－1）0 45.82±28.30 2～4 217.28±143.83 82.11±80.46 368.22±175.73 61.31±50.53 4～6 240.61±185.28 87.95±64.78 352.86±187.06 76.10±46.18 6～8 257.44±156.49 77.54±75.46 387.78±215.61 59.22±39.05 8～10 356.75±202.75 49.30±64.62 440.53±198.45 56.60±48.23 10～12 334.83±181.71 47.48±39.62 414.47±194.72 66.14±45.87 12～24 583.44±318.00 90.02±56.08 609.81±323 0～2 216.53±128.98 66.64±40.75 332.72±190.7.67 81.98±52.78

2.3 不同周期24 h尿鈣累積排泄量 見表3。

表3 參比制劑（R）和受試制劑（A）不同周期24 h尿鈣累積排泄量（mg）

2.4 受試和參比制劑生物等效性的評價(jià) 36名志愿者口服受試和參比枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑前、后24 h尿鈣累積排泄量見表4?？梢娪描蹤此釟溻涒c顆粒劑的參比制劑后24 h尿鈣累積排泄量比用藥前明顯增加，差別有顯著意義（P＜0.01）；用枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的受試制劑后24 h尿鈣累積排泄量也比用藥前明顯增加，差別有顯著意義（P＜0.05）。但由受試制劑引起尿鈣排泄的增加量與參比制劑比較，沒有顯著性差異（P＞0.05）。36名健康志愿者分別服試驗(yàn)制劑和受試制劑后，各時(shí)間區(qū)間尿量、尿鈣排泄量均值與用藥前相比，部分不同程度增加，沒有顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果見表5、6。綜上，說明枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的受試制劑和受試制劑具有生物等效應(yīng)。

表4 口服受試和參比枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑前、后24 h尿鈣累積排泄量（mg，n＝36，±s）

表4 口服受試和參比枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑前、后24 h尿鈣累積排泄量（mg，n＝36，±s）

用藥前參比制劑 128.34±59.55 179.65±103.96*藥物 用藥前 用藥后 用藥后－51.31±73.18受試制劑 128.47±76.45 163.53±81.28**35.06±61.26

注：*P＜0.01，**P＜0.05，與用藥前比較

表5 參比制劑（R）和受試制劑（A）不同時(shí)間區(qū)間尿鈣差值（mg）

表6 參比制劑（R）和受試制劑（A）不同時(shí)間區(qū)間尿量差值（mL）

3 討論

枸櫞酸氫鉀鈉口服可降低尿液鈣離子濃度，增加尿液pH值和枸櫞酸根濃度。低鈣離子濃度可降低尿液中能形成結(jié)石的鈣鹽飽和度，降低尿液中形成鈣鹽結(jié)石的可能性；高pH值能增加尿酸和胱氨酸結(jié)石的可溶性，溶解尿酸結(jié)石，防止新的結(jié)石的形成。

某些內(nèi)源性物質(zhì)如鉀離子由于機(jī)體存在自穩(wěn)機(jī)制，在一定范圍內(nèi)血濃度相對恒定，難以獲得理想的血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)［5］。本試驗(yàn)以給藥前后24 h鈣排泄量增加值為指標(biāo)，評價(jià)枸櫞酸氫鉀鈉口服制劑的生物等效性。

鈣離子為體液中固有的電解質(zhì)成分，屬內(nèi)源性物質(zhì)，血鈣水平受飲食等生理因素的影響。因此，采用平衡飲食、給藥前后對比的方法，計(jì)算給藥前后24 h鈣排泄量增加值。尿藥累積排泄法非創(chuàng)傷性取樣，易為受試者接受，尿液量大，成分簡單，干擾成分少［6，7］。但可變因素多，如易受飲水量、尿量收集的完整性影響。

本試驗(yàn)參照FDA文件設(shè)立一定時(shí)間的飲食平衡期和基線期，受試者在整個(gè)兩周期的試驗(yàn)中都嚴(yán)格的定時(shí)定量接受標(biāo)準(zhǔn)飲食和純凈水，測定尿鈣離子基線水平?？诜蹤此釟溻涒c制劑后，檢測尿鈣濃度，其變化可以反映枸櫞酸氫鉀鈉降低尿液鈣離子的作用［8］。

枸櫞酸氫鉀鈉為尿石癥常用治療藥物，口服可降低尿液鈣離子濃度，增加尿液pH值和枸櫞酸根濃度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，健康志愿者空腹口服枸櫞酸氫鉀鈉顆粒劑的受試制劑與參比制劑后，尿液鈣離子濃度均降低，24 h尿液鈣累積排泄量與用藥前相比，有不同程度增加，但2種制劑引起的增量無顯著性差異（P＞0.05），符合生物等效性的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求以及兩制劑生物等效的假設(shè)，枸櫞酸氫鉀鈉受試制劑與參比制劑生物等效。

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Evaluation of the bioequivalence of domestic and im ported Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granulesw ith accumulative urinary excretion of calcium as index in healthy volunteers

ZHANG Hua1，2，3，LIU Sha3，LIRong3，WANG Ben-jie3，GUO Rui-chen3
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Department of Pharmacy，Shandong Wanjie Medical College，Zibo 255213，China；3.Institute of Clinical Pharmacology，Qilu Hospital，Shandong University，Jinan 250012，China）

ObjectiveTo evaluate the bioequivalence of imported and domestic Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules with accumulative urinary excretion of calcium as index in Chinese healthy volunteers.MethodsThirty－six healthymale volunteers were randomLy administered with a oral single dose of5.0 g domestic（test）and imported（reference）Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules in a crossover study with a washout period of7 days.Urinewas collected before or after oral doses at the scheduled time（0～2，2～4，4～6，6～8，8～10，10～12，12～24 h）.Urine volumes were recorded，urinary calcium concentration was determined by atomic absorption spectrophotometric and twenty－four hours of accumulative urinary excretion of calcium were calculated.ResultsTwenty－four hours of accumulative urinary excretion of calcium were（128.47±76.45）mg and（163.53±81.28）mg before and after taking test preparation；（128.34 ±59.55）mg and（179.65±103.96）mg before and after taking reference preparation，respectively.Increase in 24 h urinary excretion of calcium after taking test and reference preparation were（35.06±61.26）mg and（51.31±73.18）mg，respectively.There was no significant difference（P＞0.05）in increase of24 h accumulative urinary excretion of calcium between the two preparations.ConclusionThe domestic and imported Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granuleswere bioequivalent.

Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules；Reference preparation；Test preparation；Calcium；Bioequivalence；Atomic absorption spectrophotometry

R944

A

2095－5375（2014）09－0501－004

張華，女，講師，研究方向：藥物分析，E－mail：zhanghua0216＠126.com

郭瑞臣，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：臨床藥理學(xué)，Tel：0531－82169636，E－mail：grc7636＠126.com