MicroRNAs在早期胚胎發(fā)育中的研究進(jìn)展

江勝林綜述，凌秀鳳，張軍強審校

0 引 言

蛋白質(zhì)一直在基因表達(dá)過程中起主要的調(diào)控作用，RNA處于不顯要地位。然而，后來人們發(fā)現(xiàn)原核生物中，RNA能通過堿基配對的方式抑制操縱子的表達(dá)。既之，又發(fā)現(xiàn)RNA還能在mRNA前體加工和蛋白質(zhì)合成過程中具有催化功能，于是使RNA在細(xì)胞中所具備的功能被進(jìn)一步拓展開來。1993年線蟲的發(fā)育調(diào)控中的第1個microRNA(1in-4)被發(fā)現(xiàn)后，原來有很多既往看似不重要的非編碼RNA參與了生命活動過程［1］，為我們進(jìn)一步探索生命的奧秘，打開了一扇新的通道［2］。

1 microRNAs合成和作用機制

microRNA基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和內(nèi)含子的剪接后，形成成熟的microRNA。microRNA經(jīng)典的生物合成途徑是microRNA經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ或者RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄形成具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(poly A)的原始microRNA(pri-microRNA)，pri-microRNA再經(jīng)核糖核酸酶ⅢDrosha(RNaseⅢDrosha)和其輔助因子Pasha/DGCR8(一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白)結(jié)合形成的微處理器蛋白復(fù)合體處理，再形成長約70個核苷酸、具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體microRNA(premicroRNA)。然后在轉(zhuǎn)運蛋白Exporti-n5的作用下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，被胞漿中的RNaseⅢDicer剪切成約22個核苷酸長度的雙螺旋鏈microRNA分子。雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，其中一條鏈被降解，另一條成熟的microRNA以完全或不完全配對方式結(jié)合到與其互補的mRNA靶位，進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，從而達(dá)到抑制蛋白的翻譯或者降解mRNA的目的。還有少數(shù)microRNA反而能激活翻譯［3］。除此外，Wu 等［4］提出microRNA可能還有另外一種調(diào)控機制，即對哺乳動物細(xì)胞的靶mRNA有脫腺苷作用。Bartel D P曾對microRNA在基因組、生物合成、作用機制以及功能等方面做了很好的總結(jié)［5］。

2 microRNAs在植入前胚胎的表達(dá)

哺乳動物受精后到植入前的胚胎發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，包括受精卵的分裂、緊密態(tài)、桑椹胚和囊胚的形成?，F(xiàn)階段已有大量的研究證明，microRNAs在早期胚胎細(xì)胞增殖分化的過程中，表現(xiàn)出明顯的時空特異性。張平和王穎［6］通過芯片分析和RT-PCR等方法在小鼠的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞期、8細(xì)胞期和囊胚期篩查到近百個特異性表達(dá)的microRNAs，如miR-295在8細(xì)胞期以后表達(dá)呈漸升趨勢;而miR-125a在卵母細(xì)胞到2細(xì)胞期階段下降，以后逐漸上升。Argonaute(Ago)是一類龐大的蛋白質(zhì)家族，是組成RISCs復(fù)合物的主要成員。含多個結(jié)構(gòu)域，能準(zhǔn)確識別出小RNA向?qū)ф?，從而?dǎo)致目標(biāo)mRNA的切割或者翻譯的抑制。Garcia-Lopez J 和 del Mao J［7］發(fā)現(xiàn)小鼠除了 Ago1、Ago3、Ago4 在2細(xì)胞期以及Ago2在4、8細(xì)胞期不明顯外，Drosha酶、Dgcr8、Exportin5、Dicer、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4和Ago5基因都是從卵裂期開始下降。表明在受精后至植入前經(jīng)典的microRNA通路都是下降的，同時囊胚期的miR-292-3P和miR-292-5P可作為體內(nèi)潛在的 microRNAs庫存。2013年，Maraghechi等［8］在兔的早期胚胎和胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了特異表達(dá)的 OCU-miR-302和 OCU-miR-290家族，OCU-miR-302從早期囊胚表達(dá)持續(xù)至ES樣細(xì)胞;與此相反，OCU-miR-290集群在早期胚胎發(fā)育過程中較高，在兔ES樣細(xì)胞的表達(dá)水平卻很低。據(jù)此推測OCU-miR-302集群可能是兔ES樣細(xì)胞中與多能性密切相關(guān)的microRNA，而OCU-miR-290集群則在早期胚胎發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用。

在胚胎事件發(fā)育進(jìn)程中，與發(fā)育相關(guān)的microRNAs表現(xiàn)出特異的表達(dá)趨勢，或升高、或降低，從而發(fā)揮獨特的影響胚胎發(fā)育的角色。胚胎發(fā)育本身是一個連續(xù)不斷的過程，伴隨著細(xì)胞和組織漸進(jìn)性的結(jié)構(gòu)和機能變化。即使是同一時期，microRNAs也有不同的空間表達(dá)差異。受精卵經(jīng)過6次卵裂后形成囊胚，囊胚腔內(nèi)的細(xì)胞繼續(xù)分化，分為胚泡腔、內(nèi)細(xì)胞群(inner cell mess，ICM)和外滋養(yǎng)層(trophectoderm，TE)，其中內(nèi)細(xì)胞群具有全能性，能分化發(fā)育成完整的個體。Goossens等則通過整體原位雜交和定量RT-PCR分析了牛囊胚期的ICM和TE的microRNA水平，發(fā)現(xiàn)ICM中的bta-miR-155是TE表達(dá)量的50倍［9］。Rosenbluth等從捐贈的人類胚胎中檢測到了microRNAs的差異表達(dá)，其中整倍體中miR-372的表達(dá)量較非整倍體顯著增加，這種明顯的差異表達(dá)，可能對囊胚的存活很關(guān)鍵，可能是胚胎最終發(fā)育結(jié)局或其相關(guān)機制的早期暗示［10］。

以上提示我們，小鼠、牛、兔和人類的植入前胚胎的microRNAs表達(dá)均具有時間和空間動態(tài)性，且不同的物種具有不同的表達(dá)模式。因此，microRNAs在早期胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要的作用。

3 microRNAs在早期胚胎發(fā)育過程中的作用

Zondag等［11］通過microRNA測序，發(fā)現(xiàn)在蜜蜂早期胚胎中28%的microRNA都有表達(dá)，并且和果蠅一樣有明顯的表達(dá)差異。敲除Dicer酶的蜜蜂發(fā)育有缺陷，提示蜜蜂的早期胚胎發(fā)育可能受到了microRNA的作用。同樣，Blakaj也推測如果缺失了合成成熟microRNAs所必需的酶(Dicer或DGCR8)，小鼠早期胚胎發(fā)育就會阻滯，多能干細(xì)胞增殖和分化也會受到影響［12］。

改變了成熟microRNA的量，胚胎的發(fā)育就受到明顯的阻滯。反之，人們又構(gòu)造了發(fā)育阻滯的早期胚胎模型，去監(jiān)測這些發(fā)育異常的胚胎的microRNA表達(dá)量的變化，得出了相同的結(jié)論。Zhang等［13］將斑馬魚胚胎暴露于可導(dǎo)致發(fā)育毒性的全氟辛烷磺酸或二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，與未暴露組對比，利用基因芯片對已知斑馬魚的219個microRNA的表達(dá)譜進(jìn)行分析，并用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)來驗證microRNA表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)。最終，暴露全氟辛烷磺酸或DMSO后microRNA表達(dá)譜有顯著變化。受精后24h和120h，分別有39個和81個microRNA在暴露全氟辛烷磺酸后表達(dá)模式發(fā)生了明顯改變。受精后24h有20個基因顯著上調(diào)，19個明顯下降，而在受精后120h有41個顯著上調(diào)，40個明顯下調(diào)。胚胎接受全氟辛烷磺酸或DMSO暴露，引起了microRNA的一系列表達(dá)改變，并可能導(dǎo)致發(fā)育毒性。Mondou等［14］通過基因芯片篩選出牛的植入前早期胚胎的有表達(dá)差異的特異microRNA，并選取其中有表達(dá)差異的miR-21和miR-130a對牛的卵泡期、分裂期、2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期及囊胚期胚胎半定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)成熟的miR-21、miR-130a和miR-130a前體呈線性增加。在2細(xì)胞階段對胚胎暴露鵝膏蕈堿后，miR-21、premiR-21和miR-130a顯著減少，提示microRNAs可能對牛的胚胎的早期發(fā)育起著調(diào)節(jié)作用，從而影響到母源基因向胚胎的過渡。

發(fā)育異常的早期胚胎，microRNA的量的改變，提示兩者可能有明顯的相互關(guān)系。金孝華等進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)miR-21在大鼠胚胎植入期的表達(dá)增加，推測miR-21的表達(dá)增加可能有利于胚胎植入的發(fā)生［15］。以上對斑馬魚、蜜蜂、鼠類、牛等動物的研究，無論從干預(yù)microRNA表達(dá)到影響胚胎的發(fā)育，還是發(fā)育異常胚胎中microRNA的改變，均提示microRNAs在動物早期胚胎發(fā)育過程中可能起了十分重要的作用。

4 microRNAs在早期胚胎發(fā)育中的調(diào)控機制和相關(guān)的靶基因

目前，microRNAs在早期胚胎發(fā)育過程中的作用機制尚不明了。對microRNAs作用機制的探究，主要是通過預(yù)測相關(guān)的靶基因，并進(jìn)一步驗證。Tripurani等［16］驗證了牛的早期胚胎中miR-196a在4細(xì)胞和8細(xì)胞期時表達(dá)水平增高，且能負(fù)調(diào)節(jié)NOBOX基因(newborn ovary homeobox gene)。NOBOX作為一種轉(zhuǎn)錄因子，對早期胚胎發(fā)育的母體效應(yīng)起重要作用，有研究已證實其與小鼠不育密切相關(guān)［17］。這意味著NOBOX在發(fā)育過程中可能降解母源性轉(zhuǎn)錄物，同樣的情況也可在斑馬魚miR-430、非洲爪蟾miR-427和小鼠miR-290上觀察到，揭示了早期發(fā)育中microRNA誘導(dǎo)母源性mRNAs的清除可能是普遍存在的一種機制［18］。Pang等［19］證明了 Siah1a的表達(dá)模式與miR-135a呈負(fù)相關(guān)，顯微注射miR-135a的抑制劑，超過30%以上的受精卵的第1次分裂被抑制。進(jìn)一步對注射了miR-135a抑制劑的小鼠同時注射 Siah1a特異性抗體，一定程度上抵消了miR-135a的抑制作用。因此，miR-135a可能是通過調(diào)節(jié)Siah1a的表達(dá)，來調(diào)節(jié)合子的第1次細(xì)胞分裂，參與蛋白酶體降解的調(diào)控。

microRNAs在著床前胚胎的表觀調(diào)控途徑中也可能起到一定的作用。Takada等［20］通過m-RAP分析發(fā)現(xiàn)，miR-29b可能通過作用于Dnmt3a和 Dnmt3b，調(diào)控小鼠原生殖細(xì)胞基因組甲基化，從而在雌性性腺發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。近期Lee等［21］研究得出結(jié)論在小鼠桑椹胚向囊胚過渡過程中microRNAs受DNA甲基化影響。該實驗用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對胚胎進(jìn)行處理后，通過實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，桑椹胚向囊胚的發(fā)育被抑制，microRNAs基因中總共有48個下調(diào)、17個上調(diào)，包括 let-7e，miR-20a，miR-21，miR-34b，miR-128b 和miR-452等，并最后證實了8個以上可能作用的靶基因。

Wong［22］發(fā)現(xiàn) miR-125b 能抑制 Nanog 和 Oct4的表達(dá)，抑制人類胚胎干細(xì)胞多能性，參與早期胚胎事件，促進(jìn)中胚層分化。LEE等［23］研究結(jié)果明確提示miR-124a通過下調(diào)SLUG和IQGAP1的表達(dá)，抑制胚胎干細(xì)胞向原腸胚形成，從而保持干細(xì)胞特性。Foshay發(fā)現(xiàn)miR-17家族在哺乳動物的早期發(fā)育中表達(dá)，且能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)已知的干細(xì)胞調(diào)節(jié)器STAT3來參與干細(xì)胞分化，促進(jìn)或降低胚層分化［24］。Colas等［25］篩選了小鼠全基因組的 microRNA，發(fā)現(xiàn)let-7和miR-18在早期胚胎過程中胚層形成起調(diào)節(jié)作用，兩者是直接作用于Acvr1b和Smad2的3'-UTR。可見microRNAs在早期胚胎的胚層分化過程中，也起了不小的作用。Lu等［26］通過將胚胎的培養(yǎng)外環(huán)境HCO3-濃度降低，或者抑制囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)后，發(fā)現(xiàn) miR-125b的表達(dá)水平下降，下游的P53上升，細(xì)胞生命周期受到影響，從而影響了胚胎的發(fā)育。Byrne等比較了Ped基因陰性(B6K1)和陽性(B6K2)的鼠胚胎各個時期miR-125a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ped基因陰性小鼠的囊胚期miR-125a水平10倍高于陽性小鼠，提示Ped基因可能是通過調(diào)控miR-125a的表達(dá)途徑，來調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育［27］。

Liu等［28］篩選出休眠和激活的小鼠囊胚的238個microRNAs中有45個表達(dá)差異。增加小鼠囊胚期let-7a的表達(dá)后，體內(nèi)植入率下降，體外囊胚著床和生長均受影響。過表達(dá)與植入相關(guān)的分子Integrinbeta3后，let-7a的作用可被抑制，let-7a可能通過調(diào)節(jié)Integrin-beta3來參與植入過程。

綜上所述，microRNAs可能通過降解母源性mRNA、抑制合子有絲分裂、表觀調(diào)控機制等調(diào)節(jié)胚層分化、影響植入等環(huán)節(jié)，通過作用于相關(guān)的靶基因，在早期胚胎事件中發(fā)揮微妙而獨特的生理作用。相關(guān)復(fù)雜的調(diào)控機制還需要進(jìn)一步的探索。

5 展 望

目前根據(jù)microRNA可能的作用機制，對于microRNA在胚胎中的研究大致有2種思路［29］:一是通過突變生物體，如microRNAs生成所必需的酶突變或缺失時來驗證microRNA在早期胚胎發(fā)育中的正常作用。二是對于人類等大型哺乳動物，選擇基因芯片和/或生物信息學(xué)從胚胎或干細(xì)胞對比篩選出特異性microRNAs，過表達(dá)或抑制特異性microRNAs，分析其在胚胎干細(xì)胞中的功能［14］。具體的技術(shù)方法主要有:①直接克隆和測序列;②借助計算機和數(shù)據(jù)庫，microRNA芯片對基因組的生物信息學(xué)搜索;③Northern雜交和原位雜交等方法;④靶向抑制基因序列的人工構(gòu)建的內(nèi)含子iRNA;⑤TaqMan探針法進(jìn)行實時定量 PCR［30］。

microRNAs除了在早期胚胎發(fā)育過程中起重要作用外，在腫瘤細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的分化等方面也起到重要作用［31－32］。參與生物體生長發(fā)育和細(xì)胞分化調(diào)控的研究，為我們了解生物的正常成長及疾病的發(fā)生診斷提供了強有力的工具和全新的思維。然而，目前已被驗證的并且功能明確的microRNA的數(shù)量還是甚少，其在各種生命活動中所扮演的角色尚未完全明確。隨著研究的深入，microRNA研究中還存在一些需要解決的問題:如靶基因的預(yù)測和確定;調(diào)控microRNA表達(dá)的相關(guān)因子的鑒定;某個microRNA的準(zhǔn)確表達(dá)時間的測定;以及眾多microRNA如何整合為一個復(fù)雜龐大的分子網(wǎng)絡(luò)等。正確認(rèn)識和掌握microRNA在早期胚胎發(fā)育過程中的作用和機制，對于提高人類輔助生殖技術(shù)的成功率以及降低流產(chǎn)率，可以提供新的臨床思路。

［1］Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75(5):843-854.

［2］金吉春，金星林.microRNA的概述及其研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26(10):1109-1112.

［3］Vasudevan S，Tong Y，Steitz JA.Switching from repression to activation:microRNAs can up-regulate translation［J］.Science，2007，318(5858):1931-1934.

［4］Wu LG，F(xiàn)an JH，Belasco JG.MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(11):4034-4039.

［5］Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116(2):281-297.

［6］張 平，王 穎.miRNA在小鼠著床前胚胎的表達(dá)［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38(10):1286-1287.

［7］García-López J，Del MJ.Expression dynamics of microRNA biogenesis during preimplantation mouse development［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1819(8):847-854.

［8］Maraghechi P，Hiripi L，Toth G，et al.Discovery of pluripotency-associated microRNAs in rabbit preimplantation embryos and embryonic stem-like cells［J］.Reproduction，2013，145(4):421-437.

［9］Goossens K，De Spiegelaere W，Stevens M，et al.Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples［J］.Anal Biochem，2012，423(1):93-101.

［10］Rosenbluth EM，Shelton DN，Sparks AE，et al.MicroRNA expression in the human blastocyst［J］.Fertil Steril，2013，99(3):855-861.

［11］Zondag L，Dearden PK，Wilson MJ.Deep sequencing and expression of microRNAs from early honeybee(Apis mellifera)embryos reveals a role in regulating early embryonic patterning［J］.BMC Evol Biol，2012，12:211.

［12］Blakaj A，Lin H.Piecing together the mosaic of early mammalian development through microRNAs［J］.J Biol Chem，2008，283(15):9505-9508.

［13］Zhang L，Li YY，Zeng HC，et al.MicroRNA expression changes during zebrafish development induced by perfluorooctane sulfonate［J］.J Appl Toxicol，2011，31(3):210-222.

［14］Mondou E，Dufort I，Gohin M，et al.Analysis of microRNAs and their precursors in bovine early embryonic development［J］.Mol Hum Reprod，2012，18(9):425-434.

［15］金孝華，夏紅飛，宋培培，等.MicroRNA-21在大鼠胚胎植入過程中的差異表達(dá)與調(diào)節(jié)［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2009，18(3):284-290.

［16］Tripurani SK，Lee KB，Wee G，et al.MicroRNA-196a regulates bovine newborn ovary homeobox gene(NOBOX)expression during early embryogenesis［J］.BMC Dev Biol，2011，11:25.

［17］Choi Y，Qin Y，Berger MF，et al.Microarray analyses of newborn mouse ovaries lacking Nobox［J］.Biol Reprod 2007，77(2):312-319.

［18］Qiu R，Liu Y，Wu JY，et al.Misexpression of miR-196a induces eye anomaly in Xenopus laevis［J］.Brain Res Bull，2009，79(1):26-31.

［19］Pang RT，Liu WM，Leung CO，et al.miR-135A regulates preimplantation embryo development through down-regulation of E3 Ubiquitin Ligase Seven In Absentia Homolog 1A(SIAH1A)expression［J］.PLoS One，2011，6(11):e27878.

［20］Takada S，Berezikov E，Choi YL，et al.Potential role of miR-29b in modulation of Dnmt3a and Dnmt3b expression in primordial germ cells of female mouse embryos［J］.RNA，2009，15(8):1507-1514.

［21］Lee YM，Chen HW，Maurya PK，et al.MicroRNA regulation via DNA methylation during the morula to blastocyst transition in mice［J］.Mol Hum Reprod，2012，18(4):184-193.

［22］Wong SS，Ritner C，Ramachandran S，et al.miR-125b promotes early germ layer specification through Lin28/let-7d and preferential differentiation of mesoderm in human embryonic stem cells［J］.PLoS One，2012，7(4):e36121.

［23］Lee MR，Kim JS，Kim KS.miR-124a is important for migratory cell fate transition during gastrulation of human embryonic stem cells［J］.Stem Cells，2010，28(9):1550-1559.

［24］Foshay KM，Gallicano GI.miR-17 family miRNAs are expressed during early mammalian development and regulate stem cell differentiation［J］.Dev Biol，2009，326(2):431-443.

［25］Colas AR，Mckeithan WL，Cunningham TJ，et al.Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis［J］.Genes Dev，2012，26(23):2567-2579.

［26］Lu YC，Chen H，F(xiàn)ok KL，et al.CFTR mediates bicarbonate-dependent activation of miR-125b in preimplantation embryo development［J］.Cell Res，2012，22(10):1453-1466.

［27］Byrne MJ，Warner CM.MicroRNA expression in preimplantation mouse embryos from Ped gene positive compared to Ped gene negative mice［J］.J Assist Reprod Genet，2008，25(5):205-214.

［28］Liu WM，Pang RT，Cheong AW，et al.Involvement of microRNA lethal-7a in the regulation of embryo implantation in mice［J］.PLoS One，2012，7(5):e37039.

［29］Song L，Tuan RS.MicroRNAs and cell differentiation in mammalian development［J］.Birth Defects Res C Embryo Today，2006，78(2):140-149.

［30］Thompson RC，Deo M，Tumer DL.Analysis of microRNA expression by in situ hybridization with RNA oligonucleotide probes［J］.Methods，2007，43(2):153-161.

［31］封 冰，陳龍邦.微小RNA與表觀遺傳調(diào)控:腫瘤治療新策略［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2011，24(1):92-95.

［32］van Rooij E，Sutherland LB，Qi X，et al.Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA［J］.Science，2007，316(5824):575-579.