ERK1／2信號通路介導(dǎo)丙泊酚對H2O2誘發(fā)的心肌細胞損傷保護作用

梁艷麗，唐 敏，徐聰敏

（廣東湛江中心人民醫(yī)院麻醉科，廣東湛江524037）

ERK1／2信號通路介導(dǎo)丙泊酚對H2O2誘發(fā)的心肌細胞損傷保護作用

梁艷麗，唐 敏，徐聰敏

（廣東湛江中心人民醫(yī)院麻醉科，廣東湛江524037）

目的研究丙泊酚對H2O2誘發(fā)的心肌細胞損傷的保護作用及其作用機制。方法采用胰酶消化法獲取大鼠胎鼠心肌細胞，以H2O2損傷心肌細胞獲得心肌缺血再灌注損傷實驗?zāi)Ｐ?；加入不同濃度丙泊酚?2.5、25、50μmol·L－1），MTT法檢測細胞存活率；用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法分別測定各組細胞培養(yǎng)液中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平；Western blotting檢測細胞中ERK1／2、Bcl－2及Bax的表達。結(jié)果丙泊酚（12.5、25、50μmol·L－1）能抑制由H2O2導(dǎo)致的細胞死亡（P＜0.01）；減少MDA的產(chǎn)生（P＜0.01），提高SOD活性（P＜0.01）；25、50μmol·L－1丙泊酚能抑制由H2O2導(dǎo)致的細胞凋亡（P＜0.05）；25μmol·L－1丙泊酚作用于細胞后能激活ERK1／2磷酸化，增加Bcl－2且減少Bax的表達。結(jié)論丙泊酚通過激活ERK1／2磷酸化對H2O2誘發(fā)的心肌細胞損傷起到保護作用。

丙泊酚；心肌細胞；ERK1／2；過氧化氫

丙泊酚（propofol）是一種靜脈麻醉藥，因起效快、蘇醒迅速、平穩(wěn)、副作用少而被廣泛應(yīng)用于臨床［1］。丙泊酚對神經(jīng)、心、肝、腎等多種器官都有保護作用［2，3］，但保護心肌細胞受損的作用機制還有待進一步研究。過氧化氫（H2O2）是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物，當(dāng)其濃度積累到一定的程度時會造成心肌細胞損傷。本實驗利用離體乳鼠心肌細胞體外實驗?zāi)Ｐ脱芯勘捶訉σ訦2O2為代表的氧自由基誘發(fā)的心肌細胞損傷的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生1～3 d的Wistar大鼠，購于廣東醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2008－0008，動物使用許可證：SYXK（粵）2008－0007。

1.2 試劑 丙泊酚注射液購于西安力邦制藥有限公司，使用前用培養(yǎng)液配制，過濾除菌待用；胎牛血清、DMEM（低糖）培養(yǎng)液、胰蛋白酶購于GIBCO公司；MTT、H2O2、Hepes、Glucose、L－glutamine、丙烯酰胺、SDS、Tris購于Sigma公司；ERK1／2、磷酸化ERK1／2、Bcl－2和Bax抗體購于Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶山羊抗鼠抗體IgG購于華美生物工程有限公司；丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、Tunel檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 大鼠乳鼠心肌細胞離體培養(yǎng) 取出生1～3 d的Wister大鼠乳鼠，無菌條件下取出心臟，放入預(yù)冷的D－h(huán)ank′s瓶皿內(nèi)洗去殘余血液，剪掉心房，將洗凈的心室肌放入大離心管內(nèi)，用眼科剪快速剪碎，0.06%胰蛋白酶分次消化成單細胞懸液，離心收集沉淀，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮分散細胞，調(diào)整細胞密度約為1×10個·L－1接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，CO2孵箱（5%CO2、37℃）培養(yǎng)。90 min后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，取培養(yǎng)液接種到新培養(yǎng)瓶中。48 h換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細胞全部貼壁，相互連接成片，形成同步搏動，細胞生長狀態(tài)良好，即可進行下一步實驗。

1.4 MTT法檢測細胞存活率 取生長良好的心肌細胞，制成3.0×104個·mL－1細胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種100μL。培養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液，加入含有H2O2（100μmol·L－1）和不同濃度的丙泊酚（12.5、25、50μmol·L－1）。同時設(shè)置空白及模型組。每組設(shè)8個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。每孔加入MTT（5 g·L－1）20μL，培養(yǎng)4～6 h。每孔加入DMSO 100μL。在微型振蕩器上搖勻15 min，用ELX800型酶標儀在主波長為570 nm，參比波長為630 nm處測量OD值，比色以空白孔調(diào)零。

細胞存活率＝（實驗組OD值－空白組OD值）／（對照組OD值－空白組OD值）。

1.5 細胞培養(yǎng)液中MDA含量及SOD活性的測定

分別取各實驗組的細胞培養(yǎng)液，有硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。根據(jù)試劑盒說明書進行實驗操作。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取生長良好的心肌細胞，制成3.0×105個·mL－1細胞懸液，接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，更換含有H2O2和不同濃度的丙泊酚培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗2次，胰酶消化細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 rpm，離心5 min，收集細胞按Tunel試劑盒進行操作。用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.7 Western blot檢測蛋白表達 取生長良好的心肌細胞，制成3.0×105個·mL－1細胞懸液，接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，更換含有100μmol·L－1H2O2和50μmol·L－1的丙泊酚培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗2次，細胞刮刀刮落細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 rpm，離心5 min，提取細胞總蛋白。

采用Biorad法取總蛋白20μg進行電泳分離蛋白。蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，5%BSA液4℃封閉1 h后。加入不同一抗，4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶山羊抗鼠IgG二抗孵育1 h，ECL顯色照相。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，各組間進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對心肌細胞生長的保護作用

圖1 丙泊酚對受損心肌細胞生長的影響

從圖1可知，心肌細胞經(jīng)100μmol·L－1H2O2處理24 h后，活細胞率32.8%±1.3%與空白對照組相比明顯下降（P＜0.01）；而經(jīng)不同濃度丙泊酚處理后，細胞的生長存活率均有所提高，活細胞率分別為49.7%±2.5%、63.4%±2.1%、90.3%±1.8%，與H2O2組有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 丙泊酚對心肌細胞培養(yǎng)液中MDA和SOD含量的影響 在表1中，與對照組相比，H2O2損傷組MDA含量有明顯的升高（P＜0.01），而丙泊酚各實驗組MDA含量雖有不同程度的上升但上升幅度隨著給藥濃度的增加呈下降趨勢，且與損傷組有顯著性差異（P＜0.01）；H2O2損傷組能明顯減少SOD的含量（P＜0.01），而丙泊酚各組與空白對照組比無明顯變化，與模型組之間有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 丙泊酚對H2O2引起的心肌細胞凋亡的保護作用

表1 丙泊酚對心肌細胞培養(yǎng)液中MDA和SOD含量的影響

圖2 丙泊酚對H2O2引起的心肌細胞凋亡的保護作用

由圖2可以看出，H2O2能引起大量的心肌細胞凋亡，凋亡率為70.6%±3.1%；經(jīng)不同濃度的丙泊酚處理后發(fā)現(xiàn)，25、50μmol·L－1的丙泊酚能明顯的抑制由H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡（P＜0.05，P＜0.01），凋亡率分別降為44.2%±2.7%和15.9%±2.5%。

2.4 丙泊酚對心肌細胞蛋白表達的影響 經(jīng)H2O2作用24 h后，心肌細胞中ERK1／2磷酸化程度明顯降低，Bcl－2表達減少，Bax表達增多。而經(jīng)25 μmol·L－1丙泊酚處理后，能激活ERK1／2磷酸化，增加Bcl－2的表達，降低Bax表達，達到保護心肌細胞免受H2O2的凋亡誘導(dǎo)作用，結(jié)果如圖3所示。

圖3 丙泊酚對心肌細胞蛋白表達的影響

3 討論

丙泊酚（propofol）是一種快速強效的全身麻醉劑，其臨床特點是起效快、持續(xù)時間短、蘇醒迅速而平穩(wěn)、不良反應(yīng)少，該藥已廣泛應(yīng)用于臨床各科麻醉及重癥病人鎮(zhèn)靜。其作用機制還不十分明確，最近的實驗發(fā)現(xiàn)丙泊酚除了對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有作用外，還對心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)有一定的保護作用。其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于內(nèi)源性抗氧化劑維生素E和外源性抗氧化劑丁羥基甲苯，可直接與自由基反應(yīng)使自由基滅活［4］。研究表明，丙泊酚可以改善離體心臟I／R的機械功能以及促進能量代謝的恢復(fù)，減少I／R所致的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的聚積，從而發(fā)揮其心肌保護作用［5］。但其對心肌細胞的保護機制仍不十分清楚。

近年來，缺血心肌再灌注技術(shù)，在臨床上挽救了大量心肌缺血病人的生命，但由于再灌注本身也可引起心肌損傷而影響其療效。心肌缺血時導(dǎo)致心肌細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，使心肌細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，而自由基的累積進一步會誘導(dǎo)心肌細胞損傷。許多研究證實通過外源性活性氧H2O2，能建立H2O2誘導(dǎo)心肌氧化應(yīng)激的細胞模型［6～8］。在本研究中H2O2處理心肌細胞24 h后會引起心肌細胞凋亡并抑制細胞生長。而在培養(yǎng)液中同時加處不同濃度的丙泊酚則可在不同程度上保護心肌細胞免受H2O2的損傷。如圖1的結(jié)果所示，12.5、25、50 μmol·L－1的丙泊酚作用于心肌細胞以后，能增加細胞的生長活性，與H2O2損傷組相比具有顯著性差異（P＜0.01）。H2O2作用于心肌細胞以后不僅能抑制心肌細胞的生長還能誘導(dǎo)其出現(xiàn)凋亡，通過流式細胞儀檢測我們發(fā)現(xiàn)25、50μmol·L－1的丙泊酚能夠使細胞免于受H2O2損傷而出現(xiàn)凋亡，結(jié)果如圖2所示。丙泊酚這種對細胞的保護作用與H2O2損傷組相比也存在著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

氧自由基的大量合成能使心肌細胞膜中的不飽和脂肪酸受到攻擊，從而導(dǎo)致MDA大量增加；另一方面儲存的SOD因清除大量的超氧陰離子而消耗減少，從而導(dǎo)致氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，引起心血管組織的進一步損傷［9］。因此，自由基造成對心血管損傷的程度主要與MDA含量、SOD活性變化有關(guān)。本實驗表明100μmol·L－1的H2O2能損傷心肌細胞，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為MDA的水平上升（P＜0.01）和SOD的水平下降（P＜0.01）。而加入不同濃度的丙泊酚可以有效地抑制MDA的水平升高，同時能有效的維持SOD活性水平。提示丙泊酚可能通過增強機體消除自由基的能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而達到對心肌的保護作用。

ERK1／2是MAPK家族的抗凋亡激酶，有抗凋亡作用。研究證實，抑制ERK會導(dǎo)致細胞在自由基損傷時的凋亡增加，激活的ERK可促進胞漿靶蛋白磷酸化或調(diào)節(jié)其他蛋白激酶活性，促進多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，增強轉(zhuǎn)錄活性［10］。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能明顯的激活ERK1／2磷酸化，激活后的ERK1／2可以通過轉(zhuǎn)錄依賴和非依賴方式增加抗凋亡蛋白Bcl－2，減少促凋亡蛋白Bax表達。

因此，在離體培養(yǎng)的大鼠心肌細胞缺血再灌注損傷模型中，加入不同濃度的丙泊酚能明顯降低細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護心肌細胞受損；而ERK1／2信號通路介導(dǎo)丙泊酚對H2O2誘發(fā)的心肌細胞損傷的保護作用。

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ERK1／2 signal pathway mediated propofol protected on cultured rat cardiom yocytes damaged by H2O2

LIANG Yan-li，TANGMin，XU Cong-min
（Anesthesia Department，Central People′s Hospital of Zhanjiang，Zhanjiang 524037，China）

ObjectiveTo investigate the influence and mechanism of propofol on cardiomyocytes damaged by H2O2.M ethodsCardiomyocytes from the hearts of 1～3－day－old neonatal rats were prepared by a modified method.Treated cultured rat cardiomyocytes by H2O2，propofol（12.5，25，50μmol·L－1）.MTTwas used to detect cell viability.Malondialdehyde（MDA）was determined by measuring thiobarbituric acid－reactive substances.Superoxide dismutase（SOD）was assayed by xanthine oxidasemethod.The rates ofapoptosis of cardiomyocytewere detected by flow cytometry.The expression of ERK1／2，Bcl－2 and Bax were tested by western blotting.ResultsPropofol suppressed the cardiomyocyte death induce by H2O2（P＜0.01），and decreased the production of MDA（P＜0.01），promoted the ability of SOD（P＜0.01）.The apoptosis rates of propofol group significant different from that of H2O2group（P＜0.05）.Propofol activated the phosphorated ERK1／2.The expression of Bcl－2 was increased while thatof Baxwas suppressed.ConclusionPropofol protected on cultured rat cardiomyocytes damaged by H2O2via ERK1／2 signal pathway.

Propofol；Cardiomyocytes；ERK1／2；H2O2

R614.1

A

2095－5375（2014）05－0257－004

梁艷麗，女，研究方向：麻醉學(xué)，E－mail：plliu78＠sina.com