弓形蟲酵母雙雜交c DNA文庫(kù)構(gòu)建及與AMA1羧基端相互作用蛋白的篩選

程子英，高 洋，王 銘，鄭 君，賈洪林*，趙 權(quán)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-美國(guó)密西根州立大學(xué)天然免疫聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001；3.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133000；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的一種重要的人畜共患寄生蟲病。受弓形蟲感染的孕婦可將其垂直傳播給胎兒，造成孕婦流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎及先天性弓形蟲??；是造成免疫缺陷病人致死的機(jī)會(huì)性感染或引起先天性弓形蟲病的重要原因[1-2]。同樣，弓形蟲病對(duì)家畜也會(huì)造成相同危害[3]。因此弓形蟲的防治尤為重要。

AMA1(Apical membrane antigen 1，AMA1)是弓形蟲的微線蛋白，該基因具有一個(gè)較短的羧基末端細(xì)胞質(zhì)尾巴和一個(gè)較大的氨基末端胞外區(qū)域[4]，在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞及其在細(xì)胞中復(fù)制起著重要的作用[5-6]。最初AMA1 羧基端(AMA1c)被認(rèn)為僅提供蛋白運(yùn)輸?shù)男盘?hào)[7]，近期研究表明其并無細(xì)胞器分泌的靶向作用[8]，而是對(duì)蟲體的侵入機(jī)制和細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制產(chǎn)生一定的影響。這些研究表明，AMA1c 不僅對(duì)蟲體侵入宿主細(xì)胞有作用，而且對(duì)蟲體在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制也有影響[9-10]。這些均為AMA1c的功能研究提供了新的線索。

酵母雙雜交系統(tǒng)是一種簡(jiǎn)便有效、準(zhǔn)確快捷的研究蛋白間相互作用的方法，廖亞金等利用該方法篩選出17 個(gè)與CSFV E2 相互作用的蛋白[11]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了弓形蟲酵母雙雜交文庫(kù)，通過酵母雙雜交技術(shù)共篩選得到13 個(gè)與AMA1c 相互作用的蛋白，為進(jìn)一步對(duì)AMA1c 的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株及主要試劑 弓形蟲RH 株為日本北海道帶廣畜產(chǎn)大學(xué)原蟲病研究中心玄學(xué)南教授惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α 由本研究室保存；Make Your Own"Mate&Plate" Library System 和 MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System 試劑盒及各種酵母缺陷型培養(yǎng)基均購(gòu)自Clontech 公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa 公司；DNA 聚合酶KOD 購(gòu)自TOYOBO 公司；RNeasy Plus Mini Kit 購(gòu)自QIAGEN 公司。

1.2 基因的克隆與鑒定 收集弓形蟲RH 株蟲體，利用RNeasy Plus Mini Kit 提取弓形蟲總RNA。以oligo dT 為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，以獲得的cDNA為模板，采用引物 5'-CCGGAATTCTGCTACT TCGCGAAGAGGTTGGACA-3'(Eco R Ⅰ)和5'-CGC GGATCCTTAGTAATCCCCCTCGACCATAACA-3'(Bam HⅠ)擴(kuò)增AMA1c 基因片段。將擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物連接至pGBKT7，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)，通過含有卡那的LB 平板37 ℃培養(yǎng)過夜，菌落PCR 初步篩選后提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 弓形蟲RH株酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建 按照Clontech 公司提供的說明書進(jìn)行弓形蟲總RNA 的抽提，合成cDNA 第一條鏈，進(jìn)行dsDNA 的擴(kuò)增及純化，之后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。

1.4 重組誘餌蛋白毒性及自激活檢測(cè) 根據(jù)MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System 說明書方法制備及轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-AMA1c 以及作為陽(yáng)性對(duì)照的共轉(zhuǎn)質(zhì)粒pGBKT7-53 和pGADT7-T，分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂 于SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal，SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d～5 d，驗(yàn)證誘餌蛋白的毒性及自激活活性。

1.5 酵母雙雜交 篩選相互作用蛋白挑取白色單菌落活化，按照酵母雙雜交系統(tǒng)說明書方法，加入弓形蟲RH 株文庫(kù)進(jìn)行雜交。20 h～24 h 后，1 000 r/min 離心收集菌體，8 mL 0.5×YPDA 重懸菌體，取200 μL 涂布于SD/Leu-Trp-His-Ade(SD/4)固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d～5 d，獲得的白色菌落進(jìn)一步在SD/4/X-α-Gal/AbA 平板上劃線培養(yǎng)篩選，產(chǎn)生的藍(lán)色菌落即為陽(yáng)性克隆。PCR 鑒定并測(cè)序分析。

1.6 共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證 篩選的陽(yáng)性克隆根據(jù)測(cè)序比對(duì)結(jié)果提取重組陽(yáng)性質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，純化捕獲重組質(zhì)粒。將其與pGBKT7-AMA1c 共轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)中，同時(shí)設(shè)pGBKT7-53 和pGADT7-T為陽(yáng)性對(duì)照，pGBKT7-λ 和pGADT7-T 為陰性對(duì)照，pGBKT7 和pGADT7 為空白對(duì)照。

1.7 篩選蛋白分析 在ToxoDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索目的蛋白，應(yīng)用BLAST 進(jìn)行GO 分析。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲RH株酵母文庫(kù)構(gòu)建及滴度的檢測(cè) 電泳鑒定結(jié)果表明，制備的雙鏈cDNA 大多集中在500 bp～2 000 bp，滴度為4.26×107cfu/mL。應(yīng)用pGBKT7-AMA1c 篩選得到的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR 鑒定，得到的片段大小集中在500 bp～2 000 bp(圖1)。

2.2 AMA1c互作蛋白的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證 經(jīng)培養(yǎng)觀察，顯示誘餌質(zhì)粒pGBKT7-AMA1c 無毒性，并且無自激活作用。根據(jù)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選得到約300 個(gè)陽(yáng)性候選菌落，根據(jù)PCR 鑒定結(jié)果及測(cè)序分析，經(jīng)BLAST 比對(duì)后顯示有13 個(gè)與AMA1c 相互作用的蟲體蛋白(圖2)。

圖1 AMA1c 篩選的陽(yáng)性克隆PCR 鑒定結(jié)果(部分)Fig.1 Identification of the positive clones by PCR(Partial)

圖2 AMA1c 相互作用蛋白的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證Fig.2 Identification of the AMA1c-interacting celluar proteins by co-transformation

2.3 篩選蛋白分析 根據(jù)ToxoDB 數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果表明，篩選得到的13 個(gè)蛋白中有6 個(gè)假定蛋白，一個(gè)ATP 依賴性RNA 解旋酶，一個(gè)6 磷酸葡萄糖脫氫酶，一個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白，一個(gè)磷酸二酯酶，一個(gè)環(huán)脂蛋白，一個(gè)tRNA 假尿嘧啶合酶D，一個(gè)SDS 域蛋白(表1)。

表1 與AMA1c 相互作用蛋白的GO 分析Table 1 AMA1c-interacting proteins with GO analysis

3 討論

在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞過程中，AMA1 被分泌至蟲體表面，胞外區(qū)域水解切割并脫落，而AMA1c留在蟲體內(nèi)[12]。AMA1c 具體功能還不明確，本研究應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與AMA1c 相互作用的蛋白，進(jìn)行AMA1c 功能的研究。

本實(shí)驗(yàn)將誘餌重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2H中，經(jīng)表型篩選法檢測(cè)，結(jié)果表明，pGBKT7-AMA1c 無毒性及自激活活性。本研究根據(jù)酵母雙雜交系統(tǒng)，從構(gòu)建的弓形蟲RH 株文庫(kù)中篩選獲得13個(gè)與AMA1c 相互作用的蛋白，表明本研究構(gòu)建的酵母表達(dá)文庫(kù)具有較高的質(zhì)量。將篩選獲得的13 個(gè)蛋白進(jìn)行GO 分析，結(jié)果顯示，其中蛋白1 和222均為發(fā)育調(diào)控基因，Cleary 等使用弓形蟲cDNA 微陣列研究表明蛋白1 和222 均參與弓形蟲緩殖子與速殖子之間轉(zhuǎn)錄水平的變化[13]；蛋白243 則與寄生蟲的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[14]，其與AMA1c 的相互作用可能影響寄生蟲蛋白合成下調(diào)和干擾同源信使的表達(dá)；蛋白161 為磷酸二酯酶，主要參與水解細(xì)胞內(nèi)的第二信使，目前成為抗原蟲藥物開發(fā)很有吸引力的作用靶點(diǎn)[15]。AMA1c 與這些蛋白的相互作用為進(jìn)一步研究AMA1c 的功能奠定了基礎(chǔ)。

[1]Echeverria P C,Matrajt M,Harb O S,et al.Toxoplasma gondii Hsp90 is a potential drug target whose expression and subcellular localization are developmentally regulated[J].J Mol Biol,2005,350(4):723-734.

[2]Ramos J M,Milla A,Rodríguez J C,et al.Seroprevalence of Toxoplasma gondii in fection among immigrant and native pregnant women in Eastern Spain[J].Parasitol Res,2011,109(5):1447-1452.

[3]汪明.人畜共患寄生蟲病危害與公共衛(wèi)生意義(中)[J].動(dòng)物保健，2006，109(9)：22-25.

[4]Gaffar F R,Yatsuda A P,Franssen F F,et al.Erythrocyte invasion by Babesiabovis merozoites is inhibited by polyclonal antisera directed against peptides derived from a homologue of Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1[J].InfectImmun,2004,72(5):2947-2955.

[5]Triglia T,Healer J,Caruana S R,et al.Apical membrane antigen 1 plays a central role in erythrocyte invasion by Plasmodium species[J].Mol Microbiol,2000,38(4):706-718.

[6]Kato K,Mayer D C G,Singh S,et al.Domain III of Plasmodium falciparum apical membrane antigen 1 binds to the erythrocyte membrane protein Kx[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(15):5552-5557.

[7]Di Cristina M,Spaccapelo R,Soldati D,et al.Two conserved amino acid motifs mediate protein targeting to the micronemes of the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii[J].Mol Cell Biol,2000,20(19):7332-7341.

[8]Sheiner L,Santos J M,Klages N,et al.Toxoplasma gondii transmembranemicroneme proteins and their modular design[J].Mol Microbiol,2010,10(1111):1365-2958.

[9]Santos J M,Ferguson D J P,Blackman M J,et al.Intramembrane cleavage of AMA1 triggers Toxoplasma to switch from an invasive to a replicative mode[J].Science,2011,331(6016):473-477.

[10]Buguliskis J S,Brossier F,Shuman J,et al.Rhomboid 4(ROM4)affects the processing of surface adhesins and facilitates host cell invasion by Toxoplasma gondii[J].PLoS Pathog,2010,6(4):e1000858.

[11]廖亞金，李素，賀番，等.豬外周血單個(gè)核細(xì)胞cDNA 酵母表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及與豬瘟病毒E2 蛋白相互作用細(xì)胞蛋白的篩選[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35(9)：707-710.

[12]Howell S A,Fleck S L,Kettleborough C,et al.A single malaria merozoite serine protease mediates shedding of multiple surface proteins by juxtamembrane cleavage[J].J Biol Chem,2003,278(26):23890-23898.

[13]Cleary M D,Singh U,Blader I J,et al.Toxoplasma gondii asexual development:identification of developmentally regulated genes and distinct patterns of gene expression[J].Eukaryot Cell,2002,1(3):329-340.

[14]Pradhan A,Tuteja R.Bipolar,dual plasmodium falciparum helicase 45 expressed in the intraerythrocytic developmental cycle is required for parasite growth[J].J Mol Biol,2007,373(2):268-281.

[15]Seebeck T,Sterk G J,Ke H.Phosphodiesterase inhibitors as a new generation of antiprotozoan drugs:exploiting the benefit of enzymes that are highly conserved between host and parasite[J].Future Med Chem,2011,3(10):1289-1306.