重組乳酸乳球菌表達(dá)外源蛋白的研究進(jìn)展

劉淑杰，李永明，徐子偉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生主要終產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽(yáng)性球菌或桿菌，該菌被廣泛地應(yīng)用于食品生產(chǎn)工業(yè)和發(fā)酵領(lǐng)域，是公認(rèn)的安全級(jí)(GRAS)微生物。乳酸菌在自然界分布廣泛，是人和大多數(shù)動(dòng)物腸道內(nèi)常見(jiàn)菌群，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收及增強(qiáng)免疫力等功能，對(duì)維持機(jī)體健康具有重要作用。近年來(lái)乳酸菌基因工程取得重大進(jìn)展，乳酸菌作為一種新型宿主菌用來(lái)表達(dá)外源蛋白已在生物醫(yī)藥、食品工業(yè)和畜牧獸醫(yī)等領(lǐng)域備受關(guān)注。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是乳酸菌的模式菌株，具有生長(zhǎng)迅速、免疫原性弱、自身分泌蛋白數(shù)量少等特點(diǎn)，成為表達(dá)外源蛋白的理想候選者。目前，建立和發(fā)展了一系列克隆和表達(dá)系統(tǒng)，利用L.lactis 已表達(dá)多種類型外源蛋白(消化酶、外源抗原、細(xì)胞因子和促生長(zhǎng)激素等)[1-2]。在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，采用L.lactis 已開(kāi)展廣泛的研究，特別是表達(dá)疾病相關(guān)抗原作為活載體口服疫苗用于畜禽疾病防治，表達(dá)消化酶、活性肽等作為新型飼料添加劑用于改善動(dòng)物生理機(jī)能、生產(chǎn)性能等。具有重要功能的活性蛋白在L.lactis 中成功的表達(dá)，將為畜禽健康養(yǎng)殖提供一條重要的途徑。

1 L.lactis表達(dá)系統(tǒng)

1.1 L.lactis組成型表達(dá)系統(tǒng) 組成型表達(dá)載體一般由啟動(dòng)子、復(fù)制子、多克隆位點(diǎn)和篩選標(biāo)記等部分組成，其中啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)水平關(guān)鍵元件之一。組成型啟動(dòng)子是指在該啟動(dòng)子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平通常恒定在一定水平上，在不同組織和部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。L.lactis 大部分啟動(dòng)子是隨機(jī)從基因組文庫(kù)中分離出來(lái)，并帶有氯霉素抗性的報(bào)告基因cat-86。目前己分離P21、P23、P32、P44 和P59 等組成型啟動(dòng)子，根據(jù)氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶活性區(qū)分出強(qiáng)啟動(dòng)子(P21，P23 和P59)和弱啟動(dòng)子(P32 和P44)。以L.lactis subsp.cremoris 蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)為基礎(chǔ)構(gòu)建了L.lactis 第一個(gè)組成型表達(dá)載體，Guchte 等構(gòu)建了第二個(gè)組成型表達(dá)載體pMG36e，該載體是目前應(yīng)用較多的一個(gè)典型組成型表達(dá)載體。pMG36e 載體包括P32 強(qiáng)啟動(dòng)子、紅霉素和氯霉素抗性基因、prtp 轉(zhuǎn)錄終止子以及pWV01 復(fù)制子[3]。pMG36e 載體也能在大腸桿菌、枯草桿菌和乳酸桿菌中復(fù)制，將大腸桿菌、枯草桿菌作為構(gòu)建重組載體的中間宿主，可以提高載體表達(dá)效果，擴(kuò)大其宿主范圍。目前，采用pMG36e 載體已經(jīng)成功的表達(dá)多種外源蛋白，如β-半乳糖苷酶(lacZ)、幽門螺桿菌Cag7-ct383 蛋白，磷酸山梨醇脫氫酶等。

1.2 L.lactis誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng) 組成型表達(dá)系統(tǒng)的建立使多種外源蛋白在L.lactis 中成功表達(dá)，但持續(xù)高水平表達(dá)會(huì)導(dǎo)致外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)堆積、降解，并且對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)和代謝造成毒害作用。為了防止負(fù)面效果產(chǎn)生，可以在表達(dá)系統(tǒng)中引入誘導(dǎo)信號(hào)，調(diào)控外源蛋白的時(shí)相表達(dá)，使細(xì)菌生長(zhǎng)與外源基因高效表達(dá)分開(kāi)。針對(duì)此問(wèn)題發(fā)展起一系列適合L.lactis 的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)物或誘導(dǎo)條件(糖、PH、溫度、乳酸菌肽等)調(diào)節(jié)使目的蛋白得到持續(xù)、高效表達(dá)。

最初用于調(diào)控基因表達(dá)是含有l(wèi)acA 啟動(dòng)子的L.lactis乳糖操縱子系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò)自我調(diào)節(jié)的LacR 阻遏物調(diào)控基因表達(dá)，不受乳糖分解代謝產(chǎn)物的阻遏，而是通過(guò)中間產(chǎn)物6-磷酸塔格糖抑制乳糖的產(chǎn)生[4]。該系統(tǒng)受中間產(chǎn)物調(diào)節(jié)，其濃度不易控制，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白水平相對(duì)較低。Wells 等將大腸桿菌噬菌體T7 聚合酶基因克隆到lacA 啟動(dòng)子下游，使基因表達(dá)受乳糖的調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生乳糖時(shí)誘導(dǎo)發(fā)生，并可顯著增加T7 啟動(dòng)子下游目的基因的表達(dá)水平[5]。采用該系統(tǒng)表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段C，目的蛋白產(chǎn)量占細(xì)胞總蛋白的22 %[5]。

一些表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)可通過(guò)改變環(huán)境條件來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平。將轉(zhuǎn)座子插入lacZ 基因上，使L.lactis 不同染色體基因座發(fā)生融合而產(chǎn)生數(shù)百個(gè)表達(dá)lacZ 的重組子。帶有PA170 啟動(dòng)子的重組子表達(dá)lacZ 的量最高，細(xì)胞在pH5.2 條件下產(chǎn)生的酶活性高于pH7.0 時(shí)的酶活性，在低溫條件產(chǎn)生的酶活性高于高溫下的酶活性[6-7]。將來(lái)自PA170 的DNA 克隆到多拷貝載體上，轉(zhuǎn)化L.lactis 后，則表現(xiàn)出相似的調(diào)節(jié)模式，在不同的條件下，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)水平在8～50 倍左右[6]。該系統(tǒng)可用來(lái)表達(dá)毒素蛋白或者在低溫條件下表達(dá)易降解的蛋白，也可用于發(fā)酵工程，通過(guò)培養(yǎng)物中酸的積累進(jìn)行自我調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。

利用裂解噬菌體的復(fù)制子和表達(dá)信號(hào)建立了L.lactis噬菌體Φ31 爆發(fā)式誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)以噬菌體Φ31為啟動(dòng)子，將lacZ 作為報(bào)告基因克隆至Φ31 啟動(dòng)子下游，當(dāng)Φ31 感染L.lactis 后可使其產(chǎn)生大量的lacZ。在低拷貝數(shù)的表達(dá)質(zhì)粒中引入噬菌體復(fù)制子，表達(dá)載體處于低拷貝狀態(tài)時(shí)，L.lactis 仍然能正常生長(zhǎng)[8]。當(dāng)宿主菌被噬菌體Φ31 感染后，表達(dá)質(zhì)粒大量復(fù)制，在1 h～2 h 內(nèi)目的基因的表達(dá)量可以迅速增加到1 000 倍以上[8]。該系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)合成大量的外源蛋白，最后細(xì)胞破裂，表達(dá)的蛋白被釋放，由此稱為爆發(fā)式表達(dá)。令人遺憾地是該系統(tǒng)存在特定的寄主噬菌體交互作用，不能在生產(chǎn)上大規(guī)模使用。

乳鏈菌肽(Nisin)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Nisin controlled expression system，NICE)是目前最為有效、應(yīng)用最為廣泛的L.lactis 食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。Nisin 是一個(gè)含有34 個(gè)氨基酸的多肽，安全無(wú)毒性，常被用做食品防腐劑。Nisin 的生物合成涉及從A 到G 的11 個(gè)基因，該基因簇位于L.lactis 染色體的一個(gè)接合型轉(zhuǎn)座子上，其中nis R 和nis K 是重要的反應(yīng)調(diào)節(jié)基因[9]。當(dāng)誘導(dǎo)劑nisin 與nis K 結(jié)合后，nis K 磷酸化并把磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給nis R，激活nis R 從而轉(zhuǎn)錄基因簇中的兩個(gè)啟動(dòng)子，誘導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。將nis K 和nis R 整合到L.lactis 的pepN 基因中，目的基因插入含有PnisA 啟動(dòng)子的質(zhì)粒上，則可以實(shí)現(xiàn)nisin 自主調(diào)節(jié)基因表達(dá)[10]。NICE 系統(tǒng)易于操作，誘導(dǎo)物nisin 的濃度和外源蛋白表達(dá)量之間呈線性關(guān)系，誘導(dǎo)效率可達(dá)1 000倍以上。NICE 系統(tǒng)已經(jīng)被用來(lái)表達(dá)致病抗原、代謝酶、細(xì)胞因子及一些毒素蛋白等，用于致病菌的遺傳學(xué)、生物學(xué)功能、代謝工程和黏膜免疫等方面研究。

2 L.lactis表達(dá)外源蛋白的策略

根據(jù)研究目的不同，確定外源蛋白在L.lactis 中的定位表達(dá)非常重要，L.lactis 表達(dá)外源蛋白主要有細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、細(xì)胞外分泌及表面展示3 種方式，重組蛋白表達(dá)定位不同，其產(chǎn)量、活性和在機(jī)體內(nèi)作用效果往往不同(表1)。當(dāng)L.lactis 被作為“細(xì)胞工廠”來(lái)生產(chǎn)外源蛋白時(shí)，采用分泌表達(dá)更為可取。分泌表達(dá)可以連續(xù)培養(yǎng)宿主菌，避免外源蛋白被胞內(nèi)蛋白酶降解，提高蛋白產(chǎn)量，簡(jiǎn)化純化步驟。另外，分泌表達(dá)的外源蛋白(酶或抗原等)在人或動(dòng)物消化道內(nèi)可直接與受體(底物或免疫系統(tǒng))充分接觸和作用，發(fā)揮重組蛋白的最大生物活性。當(dāng)L.lactis 作為活菌載體表達(dá)抗原蛋白或活性肽類時(shí)，也可以采用在細(xì)胞表面展示外源蛋白的策略。細(xì)胞表面展示可以保持外源蛋白相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，使相關(guān)反應(yīng)直接在細(xì)胞表面發(fā)生，提高反應(yīng)效率。細(xì)胞表面展示技術(shù)將L.lactis 的基因工程提升到一個(gè)新的領(lǐng)域，在活菌疫苗、生物酶制劑、生物吸附劑和構(gòu)建多肽文庫(kù)等研究方面展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景[11-12]。

表1 L.lactis 表達(dá)外源蛋白的策略

2.1 L.lactis分泌表達(dá)外源蛋白 分泌表達(dá)的外源蛋白首先被宿主菌合成由成熟蛋白和N 端信號(hào)肽組成的前體蛋白，在信號(hào)肽(SP)引導(dǎo)下目的蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，最后信號(hào)肽被切除，成熟蛋白被釋放到胞外。信號(hào)肽是影響外源蛋白分泌的首要因素，Usp45 是L.lactis 主要分泌蛋白，SPUsp45被認(rèn)為是目前分泌效率最好的信號(hào)肽。以葡萄球菌核酸酶(Nuc)作為報(bào)告蛋白，采用SPUsp45構(gòu)建分泌表達(dá)載體pSEC∶Nuc，使得重組L.lactis 分泌表達(dá)Nuc 量是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的6 倍多，分泌效率約為70 %[13]。研究比較SPUsp45和Nuc自身信號(hào)肽SPNuc的分泌效率，結(jié)果顯示采用SPUsp45的Nuc分泌效率約為95%，采用SPNuc 的Nuc 分泌效率為60%，表明利用宿主菌同源信號(hào)肽可增加L.lactis 分泌效率。進(jìn)一步分析L.lactis 同源信號(hào)肽的分泌效率，SP310(L.lactis未知蛋白信號(hào)肽)顯示較高的Nuc 分泌量，但分泌效率仍明顯低于SPUsp45。對(duì)SP310進(jìn)一步優(yōu)化，優(yōu)化的SP310mut2可將Nuc 分泌表達(dá)量提高45 %，但采用SP310mut2表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶(SIase)，卻有60 %的重組酶滯留在細(xì)胞內(nèi)，表明外源蛋白也會(huì)影響信號(hào)肽的分泌效率[14-15]。另外，研究顯示，以乳酸桿菌的S-層蛋白定位排列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的SPSLPmod，使重組L.lactis 分泌表達(dá)mIL-12 產(chǎn)量是SPusp45的4 倍[16]。

L.lactis 分泌效率還依賴成熟蛋白N 端所帶的凈電量即負(fù)電荷。N 端帶有堿性氨基酸或帶正電荷的肽會(huì)顯著降低分泌效率，而出現(xiàn)中性、酸性氨基酸或帶負(fù)電荷的肽則可改善分泌效率。研究發(fā)現(xiàn)，在信號(hào)肽與成熟蛋白N 末端之間插入9 個(gè)氨基酸合成肽LEISSTCDA(帶有2 個(gè)負(fù)電荷)，能夠提高NucB、NucT、huIFN-a2b 等外源蛋白的分泌效率，LQVDDIPSA(帶有2 個(gè)負(fù)電荷)和LGISSTCNA(不帶電荷)合成肽同樣能夠改善L.lactis 分泌效率，這些肽在組成上都避免采用堿性氨基酸。另外，對(duì)于易降解的蛋白來(lái)說(shuō)，可通過(guò)融合一個(gè)穩(wěn)定的蛋白來(lái)增加其分泌表達(dá)量。將布魯氏菌核糖體蛋白L7/L12 與穩(wěn)定的Nuc 融合，構(gòu)建pSEC∶Nuc∶L7/L12 分泌表達(dá)載體，可使L.lactis 分泌L7/L12 量增加2.5 倍[17]。牛β-乳球蛋白(BLG)與Nuc 融合后，增加了BLG 分泌表達(dá)量，當(dāng)LEISS 與Nuc-BLG 進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，融合蛋白分泌表達(dá)量是Nuc-BLG 的2 倍[18]。

2.2 L.lactis細(xì)胞表面展示外源蛋白 細(xì)胞表面展示是指將外源蛋白(乘客蛋白)與特定的表面蛋白(運(yùn)載蛋白)進(jìn)行融合后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，通過(guò)后者的表面識(shí)別和定位功能使外源蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)。細(xì)胞表面展示外源蛋白要求運(yùn)載蛋白除了含有信號(hào)肽外，還應(yīng)具有錨定單元的定位結(jié)構(gòu)，能夠?qū)⑼庠吹鞍桌喂潭ㄎ辉诩?xì)胞表面(圖1)。L.lactis最常用的錨定單元是LPXTG 類型細(xì)胞壁錨定域(CWA)，該類型具有較強(qiáng)的錨定性能，CWA 一般包括分撿信號(hào)LPXTG、約30 個(gè)氨基酸構(gòu)成的疏水區(qū)和C 端較短的帶正電荷氨基酸尾部。金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的CWA是研究革蘭氏陽(yáng)性菌表面錨定機(jī)制的典型模式，外源蛋白首先在宿主菌內(nèi)被合成前體肽，信號(hào)肽引導(dǎo)前體肽跨膜，在分選酶的作用下，LPXTG 基序中蘇氨酸與甘氨酸之間的肽鍵被蛋白酶水解，C 末端的蘇氨酸共價(jià)連接到位于肽聚糖層的五肽甘氨酸上，從而使外源蛋白錨定到細(xì)胞表面[19]。L.lactis 蛋白水解酶PrtP、保加利亞乳桿菌蛋白水解酶PrtB、釀膿鏈球菌M6 蛋白等均含有LPXTG 基序。采用該類型錨定序列已成功在L.lactis 表面展示了多種外源蛋白，如幽門螺桿菌尿素酶B 亞基E 片段(ureBE)、惡性瘧原蟲裂殖子芽孢M(jìn)SA2 和布魯氏菌核糖體蛋白L7/L12 等。

圖1 乳酸乳球菌表面展示外源蛋白元件示意圖

N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(N-acetylglucosaminidase，AcmA)是L.lactis 的一種肽聚糖水解酶，也是一種自溶素，參與細(xì)胞分離、分裂及穩(wěn)定期菌體自溶過(guò)程，因具有細(xì)胞壁錨定性質(zhì)已被用來(lái)構(gòu)建L.lactis 表面展示系統(tǒng)，是一個(gè)很有研究潛力的運(yùn)載蛋白。AcmA 主要由N 端活性結(jié)構(gòu)域和C 端肽聚糖錨定結(jié)構(gòu)域(cA 結(jié)構(gòu)域)組成，C 端結(jié)構(gòu)域由3 個(gè)高度同源性的重復(fù)序列組成，其中每個(gè)重復(fù)序列由45 個(gè)氨基酸組成，也稱作LysM 域，可與肽聚糖高度特異性結(jié)合。AcmA 錨具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：(1)即使保留C 端結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)重復(fù)序列，外源蛋白也能錨定在細(xì)胞壁上，可用來(lái)展示分子量較大的外源蛋白；(2)外源蛋白能夠從細(xì)胞外向細(xì)胞壁回向錨定，在一個(gè)細(xì)胞壁上能夠展示多個(gè)外源蛋白。但有研究顯示，帶有AcmA 錨的L.lactis 展示的外源蛋白存在于細(xì)胞表面和培養(yǎng)介質(zhì)中，顯示LysM 定位于細(xì)胞壁的功能要弱于LPXTG 類型錨，這可能由于L.lactis 細(xì)胞壁成分阻礙LysM 結(jié)合到細(xì)胞肽聚糖上[20]。Okano 等將α-淀粉酶(AmyA)與AcmA 的C 端肽聚糖結(jié)合域進(jìn)行基因融合，AmyA 成功展示在L.lactis 細(xì)胞表面，但酶活性卻被抑制，當(dāng)增加cA 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量則融合蛋白產(chǎn)量隨之增加，采用3 個(gè)重復(fù)域作為錨定蛋白時(shí)，可以檢測(cè)到82 %的酶活性[21]。

2.3 L.lactis表達(dá)外源蛋白的生物活性 L.lactis 具有安全、益生和免疫佐劑等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種具有極大潛力的活疫苗載體。Norton 等采用L.lactis 表達(dá)模式抗原破傷風(fēng)毒素片段C，通過(guò)灌胃和鼻接種途徑免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，有效地保護(hù)了小鼠抵抗致死劑量毒素片段的攻毒[22]。Marelli 等構(gòu)建了表達(dá)輪狀病毒突起蛋白亞基VP8 的重組L.lactis，口服免疫小鼠重組L.lactis，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)VP8 的重組L.lactis 能夠顯著增加腸道IgA 抗體水平，預(yù)防輪狀病毒感染效率達(dá)50 %；表面表達(dá)VP8 的重組L.lactis 誘導(dǎo)小鼠在腸道和系統(tǒng)水平均產(chǎn)生特異性抗體，完全阻止輪狀病毒感染[23]。Hugentobler 等采用L.lactis 分別表達(dá)利什曼原蟲保護(hù)性抗原LACK 和鼠源IL-12，同時(shí)皮下免疫小鼠兩種重組菌，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗原特異性多功能TH1 CD4+、CD8+T 細(xì)胞和LACK 特異性TH1 免疫反應(yīng)，可顯著延緩利什曼原蟲感染引起的小鼠足墊腫脹反應(yīng)[24]。Liu 等構(gòu)建表達(dá)腸毒性大腸桿菌粘附素FaeG 的重組L.lactis，通過(guò)口服途徑免疫小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，并且脾臟、派伊爾結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)產(chǎn)生特異性抗體分泌細(xì)胞[25]。

L.lactis 作為宿主菌的獨(dú)特魅力使其在表達(dá)酶類、抗菌肽和活性蛋白等方面同樣具有突出的優(yōu)勢(shì)。Li 等構(gòu)建了表達(dá)食品級(jí)LacZ 的重組L.lactis MG1363/FGZW，乳糖不耐癥小鼠口服重組菌后，能夠顯著地緩解攝取乳糖后的腹瀉癥狀[11]。尹建洪等構(gòu)件了食品級(jí)L.lactis 表達(dá)載體，并成功表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)，經(jīng)驗(yàn)證重組酶具有活性[26]。Azevedo 等采用木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建表達(dá)麻風(fēng)分枝桿菌65 ku 熱應(yīng)激蛋白(Hsp65)的重組L.lactis，重組菌分泌表達(dá)Hsp65 量約7 mg/L，對(duì)鱟變形細(xì)胞溶解物分析顯示，在重組Hsp65 樣品中LPS 含量比美國(guó)食品和藥品管理局規(guī)定水平還低10～100 倍[27]。白彩明等采用L.lactis 表達(dá)小腸三葉因子(ITF)，在誘導(dǎo)成年兔胃潰瘍后，采用重組L.lactis 進(jìn)行灌胃能促進(jìn)胃潰瘍黏膜再生[12]。

3 L.lactis表達(dá)載體的選擇標(biāo)記

為了篩選合適的轉(zhuǎn)化子并在基因改造后保持一定的選擇壓力，表達(dá)載體需要帶有選擇性篩選標(biāo)記。傳統(tǒng)的L.lactis 表達(dá)載體通常帶有紅霉素、氯霉素等抗性基因，但由于抗性因子具有轉(zhuǎn)移性，將載體投放到外界環(huán)境會(huì)帶來(lái)生物安全隱患，解決該問(wèn)題最有效方法是構(gòu)建食品級(jí)選擇性標(biāo)記的表達(dá)載體。目前已建立的L.lactis 食品級(jí)選擇標(biāo)記主要有3 類：(1)糖利用選擇標(biāo)記。根據(jù)L.lactis 具有發(fā)酵某種糖類的表型特征建立起來(lái)的，主要包括乳糖、蔗糖、木糖、蜜二糖等。如蜜二糖是乳酸菌的特殊發(fā)酵物，α-半乳糖苷酶(aga)是其代謝降解的關(guān)鍵酶，由于L.lactis通常不能利用蜜二糖，因此可將棉子糖乳球菌aga 基因的Mel+表型特征開(kāi)發(fā)為載體選擇標(biāo)記，Boucher 等利用aga基因作為選擇標(biāo)記成功構(gòu)建了載體pRAF800[28]。(2)營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記。主要包括編碼丙氨酸消旋酶(alr)、編碼胸苷酸合成酶(thyA)、參與天冬氨酸到蘇氨酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程(thr)、supB 和supD(無(wú)義抑制基因)。如孫強(qiáng)正等構(gòu)建以thy 為選擇標(biāo)記的載體pSH91，thyA 基因缺陷的突變株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，但將pSH91 轉(zhuǎn)化突變株L.lactis MBP71后，突變株恢復(fù)了野生型表型[29]。(3)細(xì)菌素抗性或免疫性標(biāo)記。細(xì)菌能分泌多種細(xì)菌素，可利用細(xì)菌素的免疫基因和抗性基因作為載體選擇標(biāo)記。研究較為深入的細(xì)菌素是nisin，采用nisin 抗性基因(nsr)和免疫基因(nisI)作為選擇標(biāo)記已成功構(gòu)建食品級(jí)表達(dá)載體。Takala 等利用nisI 作為選擇標(biāo)記構(gòu)建了表達(dá)載體pLEB590，并成功表達(dá)脯氨酸亞氨基肽酶PepI[30]。

4 存在問(wèn)題與展望

雖然基因工程技術(shù)發(fā)展已相對(duì)成熟，但是作為一種新型的宿主菌，L.lactis 還存在不足之處。首先，L.lactis 表達(dá)的外源蛋白普遍存在產(chǎn)量低的問(wèn)題，有些蛋白無(wú)法通過(guò)SDS-PAGE 電泳進(jìn)行檢測(cè)；其次，L.lactis 諸多的表達(dá)載體仍以紅霉素、氯霉素等抗生素為篩選標(biāo)記，所以仍存在抗性基因向環(huán)境或內(nèi)源微生物轉(zhuǎn)移的生物安全隱患；第三，重組L.lactis 通過(guò)口服途徑進(jìn)入人或動(dòng)物消化道，重組蛋白要經(jīng)歷胃酸、膽鹽和酶的破壞，到達(dá)腸道發(fā)揮作用的數(shù)量、活性和作用機(jī)制仍無(wú)法確定；第四，L.lactis 表達(dá)的一些外源蛋白活性較弱，提高外源蛋白的生物活性是今后研究的重點(diǎn)；第五，L.lactis 宿主菌還僅限于個(gè)別菌株，并且多為無(wú)質(zhì)粒營(yíng)養(yǎng)缺陷型株，在大規(guī)模生產(chǎn)條件下難以存活，所以應(yīng)開(kāi)發(fā)更多、更有效的宿主菌株；第六，目前關(guān)于多功能益生菌或重組活菌疫苗的研究還處于體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，距臨床或?qū)嶋H應(yīng)用還需要一段時(shí)間。

盡管存在以上種種問(wèn)題，但隨著基因工程研究的不斷深入，以及分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生態(tài)學(xué)和胃腸病學(xué)等不同學(xué)科知識(shí)的融合，將更好地解決L.lactis 表達(dá)外源蛋白普遍存在的問(wèn)題，進(jìn)一步促進(jìn)綠色、食品級(jí)的多功能L.lactis 研制和開(kāi)發(fā)，作為安全級(jí)宿主菌的L.lactis 將更具魅力和前景，更有力地推動(dòng)生物醫(yī)藥、食品工業(yè)和畜牧獸醫(yī)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

[1]Zhang Qiu-xiang,Zhong Jin.Expression of hepatitis B virus surface antigen determinants in Lactococcus lactis for oral vaccination[J].Microbiol Res,2011,166(2):111-120.

[2]劉淑杰,李永明,徐子偉,等.ETEC 粘附素蛋白亞基Fae G在乳酸乳球菌中的表達(dá)及免疫反應(yīng)性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31(9)：688-692.

[3]Guchte M,Vossen J M,Kok J,et al.Construction of a lactococcal expression vector:expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp.Lactis[J].Appl Environ Microbiol,1989,55(1):224-228.

[4]de Vos W M,Vaughan E E.Genetics of lactose utilization in lactic acid bacteria[J].FEMS Microbiol Rev,1994,15(2-3):217-37.

[5]Wells J M,Wilson P W.Lactococcus lactis:high-level expression of tetanus toxin fragment C and protection against lethal challenge[J].Mol Microbiol,1993,8(6):1155-1162.

[6]Israelsen H,Madsen S M,Vrang A,et al.Cloning and partial characterization of regulated promoters from Lactococcus lactis Tn917-lacZ integrants with the new promoter probe vector,pAK80[J].Appl Environ Microbiol,1995,61(7):2540-2547.

[7]Madsen S M,Arnau J.Molecular characterization of the pHinducible and growth phase-dependent promoter P170 of Lactococcus lactis[J].Mol Microbiol,1999,32(1):75-87.

[8]O'Sullivan D J,Walker S A,West S G.Klaenhammer TR.Development of an expression strategy using a lytic phage to trigger explosive plasmid amplification and gene expression[J].Biotechnology(N Y),1996,14(1):82-87.

[9]Kuipers O P,Beerthuyzen M M,de Ruyter P G,et al.Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by signal transduction[J].J Biol Chem,1995,270:27299-27304.

[10]Kuipers O P,Ruyter P,Kleerebezem M,et al.Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria[J].J Biotechnol,1998,64:15-21.

[11]Li Jing-jie,Zhang Wen,Wang Chuan,et al.Lactococcus lactis expressing food-grade β-galactosidase alleviates lactose intolerance symptoms in post-weaning Balb/c mice[J].Appl Microbiol Biotechnol,DOI 10.1007/s00253-012-3977-4.

[12]白彩明，畢研偉，楊旭，等.小腸三葉因子在乳酸菌中的表達(dá)[J].中國(guó)生物工程雜志，2009，29(10)：23-27.

[13]Ravn P,Arnau J,Madsen S M,et al.The development of TnNuc and its use for the isolation of novel secretion signals in Lactococcus lactis[J].Gene,2000,242:347-356.

[14]Ravn P,Arnau J,Madsen S M,et al.Optimization of signal peptide SP310 for heterologous protein production in Lactococcus lactis[J].Microbiology,2003,149(Pt 8):2193-2201.

[15]Park J Y,Jung J H,Seo D H,et al.Microbial production of palatinose through extracellular expression of a sucrose isomerase from Enterobacter sp.FMB-1 in Lactococcus lactis MG1363[J].Bioresour Technol,2010,101(22):8828-8833.

[16]Fernandez A,Horn N,Wegmann U,et al.Enhanced secretion of biologically active murine interleukin-12 by Lactococcus lactis[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(3):869-871.

[17]Ribeiro L A,Azevedo V,Le Loir Y,et al.Production and Targeting of the Brucella abortus Antigen L7/L12 in Lactococcus lactis:a First Step towards Food-Grade Live Vaccines against Brucellosis[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(2):910-916.

[18]Nouaille S,Bermúdez-Humarán L G,Adel-Patient K,et al.Improvement of bovine beta-lactoglobulin production and secretion by Lactococcus lactis[J].Braz J Med Biol Res,2005,38(3):353-359.

[19]趙朋朋，肖麗英，李繼遙.蛋白酶sortase 的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)口腔醫(yī)學(xué)，2006，33(1)：18-25.

[20]Andre G,Leenhouts K,Hols P,et al.Detection and localization of single LysM-peptidoglycan interactions[J].J Bacteriol,2008,190(21):7079-86.

[21]Okano K,Zhang Qiao,Kimura S,et al.System using tandem repeats of the cA peptidoglycan-binding domain from Lactococcus lactis for display of both N-and C-terminal fusions on cell surfaces of lactic acid bacteria[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(4):1117-1123.

[22]Norton P M,Wells J M,Brown H W,et al.Protection against tetanus toxin in mice nasally immunized with recombinant Lactococcus lactis expressing tetanus toxin fragment C[J].Vaccine,1997,15(6-7):616-619.

[23]Marelli B,Perez A R,Banchio C,et al.Oral immunization with live Lactococcus lactis expressing rotavirus VP8 subunit induces specific immune response in mice[J].J Virol Methods,2011,175(1):28-37.

[24]Hugentobler F,Yam K K,Gillard J,et al.Immunization against Leishmania major infection using LACK-and IL-12-expressing Lactococcus lactis induces delay in footpad swelling[J].PLoS One,2012,7(2):e30945.

[25]Liu Shu-jie,Li Yong-ming,Xu Zi-wei,et al.Immune responses elicited in mice with recombinant Lactococcus lactis expressing F4 fimbrial adhesin FaeG by oral immunization[J].Vet Res Commun,2010,34:491-502.

[26]尹建洪，羅立新，王成.南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)基因在乳酸乳球菌MG1363 中的整合及表達(dá)[J].生物技術(shù)通報(bào)，2012，5：105-109.

[27]de Azevedo M S,Rocha C S,Electo N,et al.Cytoplasmic and extracellular expression of pharmaceutical-grade mycobacterial 65-kDa heat shock protein in Lactococcus lactis[J].Genet Mol Res,2012,11(2):1146-1157.

[28]Boucher I,Parrot M.Novel food-grade plasmid vector based on melibiose fermentation for the genetic engineering of Lactococcus lactis[J].Appl Environ Microbiol,2002,68:6152-6161.

[29]孫強(qiáng)正，熊衍文，李振軍，等.乳酸乳球菌食品級(jí)載體的構(gòu)建及Mn-SOD 基因的克隆和表達(dá)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22(6)：498-501.

[30]Takala T M,Saris P E.A food-grade cloning vector for lactic acid bacteria based on the nisin immunity gene nisI[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,59(4-5):467-471.