貓杯狀病毒基因及其抗原多樣性研究進(jìn)展

趙艷麗，董宏偉,2，陳小慶，姜 雪，劉秋艷，胡桂學(xué)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，吉林 長春 130021)

貓杯狀病毒(Feline calicivirus，F(xiàn)CV)是杯狀病毒科(Calicivirdae)水瘡性病毒屬(Vesivirus)的成員之一[1]，其基因組為單股正鏈RNA，無囊膜，核衣殼呈二十面體對稱。FCV 可引起貓多發(fā)性口腔和呼吸道傳染病，還可引起結(jié)膜炎，因此又稱為貓傳染性鼻-結(jié)膜炎病毒。自1957 年Fastier 首次分離鑒定FCV 以來，在歐洲、美洲、亞洲均有FCV 的報道，目前已呈世界性分布。幾乎所有的貓科動物，如貓、虎[2]、獅[3]和獵豹[4]等對FCV 均易感，一歲以下的貓最易感，也有狗感染的報道[5]。FCV 感染貓通常局限于口腔和上呼吸道。有些病毒株可以引起慢性胃腸炎和急性關(guān)節(jié)炎[6]。FCV 感染與慢性口腔炎有密切的關(guān)系，多數(shù)感染的貓可以向外界排毒[7]。FCV 在貓群中高度流行，主要是因為許多的臨床康復(fù)貓仍然是持續(xù)的病毒攜帶者。該病發(fā)病率較高，死亡率較低。近年來FCV 強毒變異株感染不斷暴發(fā)，甚至發(fā)生在疫苗免疫貓中[8]，不僅會引起口腔、皮膚潰瘍，還會導(dǎo)致肝、脾和胰臟的損傷，貓死亡率增加。FCV 變異株還可以引起貓的嚴(yán)重急性致命的全身性疾病(Virulent systemic disease，VSD)。

由于商品疫苗的使用，野毒株與活疫苗株F9 間的交叉保護(hù)反應(yīng)逐漸變?nèi)酰呙缑庖呤‖F(xiàn)象時有發(fā)生?，F(xiàn)有的疫苗雖然能夠減少臨床癥狀和病毒的排出，但可能無法防止感染。強毒株引起的暴發(fā)和疫苗免疫失敗與FCV 的基因及其抗原多樣性密切相關(guān)。

1 病毒基因多樣性

1.1 病毒基因組結(jié)構(gòu) FCV 通常被認(rèn)為只有一個基因組[9]，不過日本學(xué)者研究證明兩個分離基因組的存在[10]。在病毒感染的細(xì)胞中，除基因組RNA 外還存在著亞基因組RNA，基因組RNA 為7 600 nt，亞基因組RNA 為2 400 nt，二者5'端均連接著15 ku 的VPg 蛋白，VPg 蛋白取代了5'端的帽狀結(jié)構(gòu)，直接與蛋白翻譯起始因子作用，啟動病毒的翻譯過程[11]。二者3' 端均連接著poly(A)，正鏈RNA病毒poly(A)尾巴與病毒復(fù)制及侵染性有密切聯(lián)系[12]。病毒基因組RNA 包含3 個開放閱讀框(ORF)，分別為ORF1、ORF2、ORF3。ORF1 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括一個病毒蛋白酶和RNA 依賴的RNA 多聚酶。ORF2 編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1，共有A-F 6 個區(qū)。A 區(qū)有一段FCV 共有序列，高度保守，A 區(qū)在衣殼蛋白VP1 成熟過程中被裂解掉；B區(qū)含有潛在的肉豆蔻化甘氨酸和ATP/GTP 結(jié)合位點，組成病毒的核心結(jié)構(gòu)；C 區(qū)為可變區(qū)；D 區(qū)為高度保守區(qū)；E 區(qū)含有FCV 的抗原表位，含有主要B 細(xì)胞表位，可作為毒株分型的參照；E 區(qū)被28 個保守堿基(ConE)分成5'端和3' 端高變區(qū)(HRV)[13]，有人認(rèn)為FCV 不同毒株之間發(fā)生交叉反應(yīng)以及FCV 只具有單一血清型均與ConE 有關(guān)；F 區(qū)在衣殼蛋白的羧基端，高度保守，位于病毒的表面，是非中和單克隆抗體(MAbs)的連接位點。FCV 成熟的衣殼蛋白也能夠自我組裝成空衣殼即病毒樣粒子(VLPs)，但不具有感染性[14]。ORF3 位于基因組的3' 末端，編碼大小約為12 ku 的結(jié)構(gòu)蛋白VP2。病毒亞基因組包含ORF2 和ORF3，病毒可能利用亞基因組RNA 進(jìn)行基因表達(dá)。

1.2 病毒基因組多樣性 FCV 屬于RNA 病毒，與DNA復(fù)制基因信息相對精確相比，RNA 通常是不精確的，基因組具有高度適應(yīng)性，在選擇壓力的作用下表現(xiàn)為進(jìn)化快速。像許多其他的RNA 病毒一樣，F(xiàn)CV 有能力發(fā)展核心的生存策略，主要體現(xiàn)在基因組的多樣性上[15]。

FCV 病毒株間的基因變異型已被用于疾病暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查。一些研究顯示FCV 不同病毒株在衣殼變異區(qū)存在20 %～40 %的差異，而共享現(xiàn)在流行病學(xué)鏈的分離株，在該區(qū)的變異一般在6 %以下，很可能代表相同株的變異[16]。

澳大利亞FCV 分離株的衣殼蛋白與經(jīng)典病毒株F9 的不同，其預(yù)測氨基酸序列的變化為整個衣殼蛋白的11 %～17.5 %，最明顯的差異出現(xiàn)在HRV C 和E，HRV E 的變異為22 %～34 %。澳大利亞株對F9 株MAbs 缺乏反應(yīng)性，這與其E 區(qū)結(jié)合位點的氨基酸改變有關(guān)[17]。vsFCV 株(FCV-33585)衣殼蛋白的HRV 基因序列與114 個已知序列比較分析顯示vsFCV 株潛在的唯一特征是2 個氨基酸的變化[18]。首次分離于中國廣東的FCV CH-GD 株的全基因序列與各參考株的同源性僅為75.4 %～77.1 %，明顯低于各參考株之間的同源性78.9 %～99.9 %，而且CH-GD株有3 個區(qū)域的3 個連續(xù)的氨基酸發(fā)生了變異，3 個區(qū)域的抗原性和親水性也發(fā)生了相應(yīng)的變化[19]。分離自巴西南部南里奧格蘭德的13 個FCV 株與F9 株比較，其ORF2(B-F)預(yù)測氨基酸序列的主要變異出現(xiàn)在C 區(qū)和HRV E，D 區(qū)、HRV E 5' 端、Con E 的抗原表位也出現(xiàn)一些變化，核苷酸距離值存在0.8 %～50.1 %的差異。這是首次對FCV 巴西分離株的序列分析及對其系統(tǒng)發(fā)育間關(guān)系的描述[20]。Radford 等確定了FCV 在細(xì)胞培養(yǎng)物和持續(xù)感染貓中的序列進(jìn)化，并將其與病毒中和變化聯(lián)系起來[13]。隨后他們又鑒定了一個FCV 分離株衣殼基因HRV E 有一些輕微的變異，該病毒株與一個FCV 減毒活疫苗株密切相關(guān)，表明本地病毒已經(jīng)從疫苗病毒中進(jìn)化，而且持續(xù)存在[16]。Weeks 等對一株從佛羅里達(dá)州臨床健康的家貓口腔中分離的FCV 序列分析顯示其C、E、F 區(qū)序列與疫苗株F9 有顯著差異，其HRV E 比疫苗株F9 少3 個氨基酸，顯示當(dāng)前流行的FCV 株可能與疫苗株不一致[21]。此外，Schorr-Evans 等研究表明致命的FCV、流行的FCV 以及疫苗株FCV-F9 在遺傳和血清學(xué)上存在差異[8]。

由于抗FCV 疫苗的免疫失敗，在日本開展了有關(guān)能夠引起疫苗免疫失敗的野毒株(Vaccine breakdown strains，VBS)基因及特性的相關(guān)研究。2007 年Ohe 等從接種商業(yè)FCV 疫 苗(F9、FCV-255、FC-7)的貓中分離出15 個FCV-VBS 株并檢測其基因組。進(jìn)化樹分析顯示8 個分離株(53 %)、疫苗株F9、FCV-255 屬于基因群I(G(A)I)，7個分離株(47 %)屬于基因群II(G(A)II)，從接種F9、FCV-255、FC-7 疫苗的貓中分別分離到的VBS 株依次為屬于G(A)II 的多于G(A)I、G(A)II 少于G(A)I、G(A)II 等于G(A)I，表明病毒分離株的基因群隨著疫苗株的使用而變化；貓抗F9 和兔抗FCV-255 血清對15 個分離株的中和滴度都非常低，表明中和抗體滴度和基因群沒有關(guān)系；病毒分離株和疫苗株的基因序列同源性低，為70.6 %～82.9 %，表明沒有病毒株序列來自疫苗株；氨基酸序列比對顯示從接種F9、FCV-255 疫苗的貓中分離的FCV-VBS株在F9 株衣殼蛋白區(qū)5' 端HRV 位置有些變化，推測這些變化可能影響基因群；從接種F9 疫苗的貓中分離到的FCV-VBS 株，G(A)I 和G(A)II 共有的F9 線性表位氨基酸的改變發(fā)生在分離株衣殼蛋白E 區(qū)5' HRV 450，451，457 位置，接種FCV-255 疫苗的發(fā)生在449，450，451 位置，這些氨基酸的改變參與逃逸，與疫苗免疫失敗有關(guān)，這些結(jié)果顯示交替使用F9 和FCV-255 疫苗或包含G(A)II株的多價疫苗能夠抑制病毒進(jìn)化或變異[22]。隨后他們研究認(rèn)為疫苗免疫失敗存在兩個機制：一個是與疫苗免疫水平有關(guān)，另一個是無關(guān)。FCV-VBS 的特點為：病毒感染前帶有抗體滴度高時，病毒持續(xù)排出的時間短；排出的病毒分子種類不斷變化，并不是隨著時間限制在一個特定的種類；病毒物理化學(xué)性質(zhì)持續(xù)改變，F(xiàn)CV-VBS 改變了分子物種和物理化學(xué)特性，歸因于宿主免疫壓力減少，可能導(dǎo)致VSD[23]。

也有學(xué)者對FCV 持續(xù)感染和多樣性的進(jìn)化機制進(jìn)行了探討。Pedersen 等認(rèn)為FCV 持續(xù)感染不能單一地通過VBS 株的出現(xiàn)來解釋，疫苗病毒本身可能有助于急性、慢性感染和疾病的發(fā)生[24]。Coyne 等利用分布在5 個不同地理位置上的家貓F(tuán)CV 的流行感染，通過測定其衣殼蛋白免疫主導(dǎo)區(qū)和可變區(qū)序列，確定了病毒利用的不同進(jìn)化過程對確保它長期在宿主內(nèi)生存的相對貢獻(xiàn)。研究表明真正在個體中長期持續(xù)的感染是比較罕見的，大多數(shù)病毒攜帶者經(jīng)歷病毒逐漸演變和循環(huán)感染，在個體水平逐漸演變和在個體和群體水平變異株再感染與積極選擇有關(guān)。逐漸演變和變異株再感染引導(dǎo)一個特定病毒株在個體和群體中的多樣性逐漸增加，直到新病毒株出現(xiàn)[25]。他們的最新研究表明在大多數(shù)情況下，空間和時間不同的病毒株在系統(tǒng)發(fā)育過程中混合，當(dāng)前的FCV 進(jìn)化與病毒株間的選擇競爭無關(guān)。相反，伴隨許多病毒株的共同流行，這些變異可能通過從頭演變和從更廣泛的自然中偶爾的基因流動在群體水平上存在，這種復(fù)雜性首次提供了判斷當(dāng)?shù)睾蛧宜揭呙缃徊姹Ｗo(hù)的一個基準(zhǔn)[26]。

2 病毒抗原多樣性

由于FCV 基因組不同，F(xiàn)CV 抗原也呈現(xiàn)出多樣性，F(xiàn)CV 包含大量的病毒株，在病毒株之間有大量的抗原變異，大多數(shù)的病毒株被分為不同的抗原。這些抗原的不同已經(jīng)被用于開發(fā)FCV 的分型方法[17]?？梢哉J(rèn)為所有的FCV 株都屬于一個抗原多樣的血清型。

McArdle 等利用6 個抗FCV-F9 株的MAbs 檢測了55個FCV 分離株，結(jié)果顯示F9 株與6 個MAbs 均反應(yīng)，而一些野毒株與任何一個都不反應(yīng)。有口腔/呼吸癥狀組的分離株很少與MAbs 反應(yīng)，表明這些毒株與F9 株相關(guān)性低，同時顯示即使與F9 株密切相關(guān)的病毒株，也不能與6 個MAbs 都發(fā)生反應(yīng)[27]。Lauritzen 等通過血清稀釋的中和試驗確定了來自美國和英國的181 個FCV 分離株與5個參考株的抗原關(guān)系，參考株包含2 個疫苗株(F9，2280)和3 個野毒株(H，J，TN)。只有少量的英國株能夠被所有參考株的特定血清中和，沒有任何一個參考株在美國所有地理位置都占據(jù)主導(dǎo)，2280、H、J 株的抗血清能中和最高數(shù)量的分離株，F(xiàn)9 株與來自1958 年～1979 年間的分離株抗原相似性達(dá)到86 %，與來自1980 年～1995 年間的分離株抗原相似性降至43 %，J 株維持它的抗原相關(guān)性，與最近40 年的分離株代表的相似性達(dá)到75 %[28]。Rinaldo等通過體外中和試驗，評估了F9 株與從意大利具有FCV感染臨床癥狀貓中分離的野毒株的抗原相關(guān)性，確定了F9 株和貓群中蔓延的FCV 株相關(guān)性低[29]。Addie 等通過8個感染F9、255、FCVG1 和FCV431 的貓產(chǎn)生的抗血清檢測了來自英國的110 個FCV 野毒株的交叉中和易感性，研究顯示抗新疫苗株FCVG1 或FCV431 抗血清比抗F9 和255 抗血清能中和更大比例的野毒株[30]。

FCV 抗原的多樣性是當(dāng)前疫苗免疫失敗的主要原因，衣殼蛋白基因可變區(qū)免疫主導(dǎo)位點的抗原多樣性解釋了逃逸突變體的出現(xiàn)[31]。一些研究認(rèn)為FCV 抗原的變異來自疫苗引起的免疫壓力[13,28]?？乖亩鄻有砸馕吨鴽]有疫苗能中和所有的病毒分離株，這對于篩選制備疫苗的抗原帶來困難。

3 結(jié)語

FCV 基因多樣性導(dǎo)致不同病毒株對宿主組織嗜性的不同，從而引起了致病性的改變，F(xiàn)CV 除了能引起典型的呼吸、慢性胃腸炎和急性關(guān)節(jié)炎等疾病以外，還能引起VSD 和流行性出血熱樣疾病，呈現(xiàn)出不同的臨床癥狀。在美國，F(xiàn)CV 致命的突變已經(jīng)作為VSD 的一個病因，該病的特點是疫苗免疫的成年貓暴發(fā)性黃疸，水腫，高死亡率[8,32]。2003 年英國暴發(fā)相似的疾病[33]。2009 年法國暴發(fā)了VSD，其癥狀、病程、臨床結(jié)果和病變是典型的FCV引起的VSD[34]，但各地引發(fā)VSD 的FCV 株各不相同。2013 年意大利出現(xiàn)了第一例疑似FCV-VSD，臨床、尸檢和實驗室研究表明與之前報道的FCV-VSD 類似。發(fā)病貓同時感染了貓免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus，F(xiàn)IV)，而其他的貓盡管直接接觸病貓也沒有感染，表明FIV 感染可能有利于致病性FCV 株的增殖[35]。2000 年一個新的高致病性FCV 株引起貓流行性出血熱樣疾病[32]。2003 年一個小動物醫(yī)院暴發(fā)了24 例不尋常的致命FCV 感染，環(huán)境和癥狀與在北部加利福尼亞暴發(fā)的FCV 出血性疾病相似[8]。

綜上所述由FCV 引起的疾病變得難于控制，迫切地需要研制新型有效的疫苗。我們實驗室正在致力于FCV 的反向遺傳研究，希望能從DNA 水平上對FCV 基因組進(jìn)行體外操作，研制出能抵御FCV 感染發(fā)病的新型疫苗。

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