免疫組化法檢測(cè)鴨源大腸桿菌O46分離株在人工感染鴨體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布

冉丹丹，于學(xué)輝，羅 薇，劉 飛，孫 吉，劉亞剛

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

免疫組化法檢測(cè)鴨源大腸桿菌O46分離株在人工感染鴨體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布

冉丹丹，于學(xué)輝，羅 薇，劉 飛，孫 吉，劉亞剛*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

為研究鴨源致病性大腸桿菌(E.coli）O46分離株感染雛鴨后在其體內(nèi)組織器官中的動(dòng)態(tài)分布，本實(shí)驗(yàn)將E.coliO46分離株經(jīng)口服、肌注和皮下注射3種途經(jīng)感染雛鴨，于感染后不同時(shí)間點(diǎn)采集雛鴨15個(gè)不同的組織器官制備組織切片，采用免疫組化染色方法，利用E.coliO46定型血清對(duì)樣品中細(xì)菌抗原進(jìn)行定位跟蹤檢測(cè)。結(jié)果顯示：口服、肌注和皮下注射3種途經(jīng)接種E.coliO46分離株后，15個(gè)不同的組織器官中除氣管未檢測(cè)到細(xì)菌抗原外，其余的組織器官均檢測(cè)到細(xì)菌抗原。心臟、肺臟、脾臟、腎臟和腸道是感染的主要靶器官，并且抗原主要存在于其感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，陽(yáng)性信號(hào)最早出現(xiàn)于心臟。本研究表明鴨源E.coliO46分離株能夠在鴨體內(nèi)廣泛的侵嗜增殖并造成鴨急性發(fā)病和死亡。

大腸桿菌O46分離株；免疫組化；感染雛鴨；動(dòng)態(tài)分布

鴨大腸桿菌病是由鴨致病性大腸桿菌(E.coli）引起的一種急性敗血性傳染病，主要引起鴨的嚴(yán)重腹瀉，影響鴨生長(zhǎng)發(fā)育并引發(fā)死亡，鴨E.coli病已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最主要的細(xì)菌性傳染病之一[1]。2008年，本實(shí)驗(yàn)室從成都某規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)送檢的患典型敗血癥的發(fā)病雛鴨中首次分離到血清型為O46的鴨致病性E.coli(以下稱O46分離株），該分離株接種2周齡雛鴨100%致死，具有很強(qiáng)的致病性[2]。其毒力基因hlyA、eaeA、iss等檢測(cè)均為陽(yáng)性，并且hlyA基因與O157∶H7 Sakai序列同源性為100%，為一株攜帶多種毒力基因的鴨致病性E.coli[3]。間接免疫酶組化(Indirect immunoperoxidase staining，IIS）方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、便于直觀等優(yōu)點(diǎn)，因而近幾年在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中得到廣泛應(yīng)用[4-5]，尤其是在檢測(cè)E.coli方向[6-7]，本研究將O46分離株分別以不同途徑感染10日齡的雛鴨，采用IIS方法檢測(cè)其抗原在雛鴨體內(nèi)的定位和動(dòng)態(tài)分布，為研究鴨源E.coliO46分離株對(duì)機(jī)體的感染與致病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 鴨致病性E.coliO46分離株(EF620923）由西南民族大學(xué)禽病研究所分離、鑒定和保存；鴨胚購(gòu)自成都市新津種鴨場(chǎng)，自行孵化，隔離器內(nèi)飼養(yǎng)至10日齡；E.coliO46定型血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào) 9405；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(IgG-HRP）和DAB顯色劑均購(gòu)自華美生物工程公司；UltraSensitiveTM超敏濃縮試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 72只10日齡雛鴨隨機(jī)分成4組，分別進(jìn)行E.coliO46分離株的人工感染。感染劑量及途徑見(jiàn)表1。接菌后2 h、4 h、12 h、24 h、36 h及72 h采集心、肝、脾、肺、腎、腦、氣管、胸腺、十二指腸、空、回、盲、直腸、法氏囊及胰腺，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行采集2只雛鴨，對(duì)死亡的雛鴨同樣進(jìn)行采樣并檢測(cè)病理變化，樣品經(jīng)4%多聚甲醛固定。同時(shí)平行采集對(duì)照組鴨的各器官樣品。

1.3 I I S染色及結(jié)果判定 將實(shí)驗(yàn)鴨的心、肝及脾等組織按常規(guī)方法制備4 μm石蠟切片，脫蠟入水后進(jìn)行抗原的修復(fù)，封閉組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，按照UltraSensitiveTM超敏濃縮試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，以E.coliO46定型血清(1∶50）為一抗，羊抗兔IgG-HRP(1∶150）為二抗，進(jìn)行切片IIS染色，利用DAB顯色劑進(jìn)行切片顯色。以正常健康鴨組織切片為陰性對(duì)照；O46分離株感染發(fā)病死亡的雛鴨各器官組織切片為陽(yáng)性對(duì)照。顯色結(jié)果按光學(xué)顯微鏡視野下觀察到的特定細(xì)胞經(jīng)染色后棕黃色顯色的有無(wú)、數(shù)量、種類及深淺來(lái)判定：①組織胞漿中未出現(xiàn)棕黃色著色的判為陰性；②組織胞漿中棕黃色著色零星分布并且少于5%的判為弱陽(yáng)性；③組織胞漿中棕黃色著色分布比例為5%～50%為陽(yáng)性；④組織胞漿中棕黃色著色在總組織胞漿中分布比例大于50%為強(qiáng)陽(yáng)性。

表1 人工感染試驗(yàn)Table 1 Artifical infection experiment

1.4E.c o l iO46分離株感染雛鴨組織內(nèi)細(xì)菌分布的動(dòng)態(tài)觀察檢測(cè) 利用IIS方法對(duì)采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)顯微鏡觀察，照相記錄。

2 結(jié) 果

不同途徑接種O46分離株雛鴨的各器官在不同時(shí)間采用IIS方法檢測(cè)E.coli分布的結(jié)果見(jiàn)表2、表3和表4。其中，肝臟陽(yáng)性信號(hào)在肝小葉間的結(jié)締組織和肝索區(qū)、肝血竇區(qū)細(xì)胞質(zhì)中呈散在分布；脾臟陽(yáng)性信號(hào)主要位于白髓淋巴細(xì)胞胞質(zhì)；腎臟陽(yáng)性顆粒主要位于皮質(zhì)區(qū)的間質(zhì)和腎小球毛細(xì)血管基質(zhì)細(xì)胞質(zhì)中；心臟陽(yáng)性信號(hào)主要分布在心肌膜心肌纖維的肌漿；胰腺陽(yáng)性信號(hào)主要位于腺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)；胸腺髓質(zhì)區(qū)的網(wǎng)狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞質(zhì)中均檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)；肺臟陽(yáng)性信號(hào)主要位于支氣管腔的紅細(xì)胞團(tuán)塊以及毛細(xì)血管中；大腦陽(yáng)性信號(hào)主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞漿；法氏囊陽(yáng)性顆粒主要分布在囊小結(jié)淋巴細(xì)胞胞質(zhì)；十二指腸陽(yáng)性顆粒主要分布在腸絨毛粘膜上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞；空、回、盲和直腸陽(yáng)性顆粒主要分布在粘膜上皮細(xì)胞和腸腺上皮細(xì)胞；氣管各時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到細(xì)菌抗原。對(duì)照組各組織的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。部分臟器免疫組化陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖1。

不同途徑接種E.coli均以心臟、肺臟及脾臟的陽(yáng)性檢出率最高。肌注組和皮下組2 h即可從心臟檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，口服組12 h才能夠檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，24 h～72 h時(shí)3個(gè)組絕大部分樣品均能夠檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)(圖2）。

表2 肌注組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組織IIS檢測(cè)結(jié)果Table 2 IIS result of tissues for detection ofE.coliat different time after intramascular injection infected

表3 皮下組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組織IIS檢測(cè)結(jié)果Table 3 IIS result of tissues for detection ofE.coliat different time after subcutaneous injection infected

3 討 論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染E.coli后出現(xiàn)的特定致病現(xiàn)象可以為細(xì)菌在動(dòng)物機(jī)體中定殖以及毒素對(duì)機(jī)體的作用等致病機(jī)理分析提供一定參考依據(jù)。本研究通過(guò)IIS方法觀察了O46分離株在人工感染鴨體內(nèi)的侵嗜過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，O46分離株能夠在實(shí)驗(yàn)鴨除氣管外的所有器官組織中被檢出，表明O46分離株在鴨體內(nèi)能夠進(jìn)行大面積的侵嗜。陽(yáng)性信號(hào)主要存在于單核巨嗜細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞漿內(nèi)，于學(xué)輝對(duì)O46分離株超微病理學(xué)觀察也表明受到感染的細(xì)胞主要有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞[2]，這可能是由于E.coli進(jìn)入體內(nèi)后被吞噬細(xì)胞吞噬所致。細(xì)菌抗原陽(yáng)性檢出率是衡量細(xì)菌對(duì)該組織侵害性的重要指標(biāo)，肌注組、皮下組和口服組均以心臟、肺臟和脾臟的陽(yáng)性檢出率最高，均出現(xiàn)極強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，這和于學(xué)輝對(duì)O46分離株超微病理觀察的結(jié)果(在心臟、脾臟和脾臟中觀察到E.coli）一致[2]，進(jìn)一步表明心臟、肺臟和脾臟是O46分離株感染機(jī)體的主要靶器官。腎臟、回腸、直腸、十二指腸、空腸和盲腸等均出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，表明O46分離株可以由接種部位到達(dá)主要內(nèi)臟器官并對(duì)這些內(nèi)臟器官造成損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，肌注組2 h、皮下組4 h，口服組12 h可以在心臟心肌纖維的肌漿中檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)合于學(xué)輝對(duì)O46分離株超微病理學(xué)觀察[2]，接種后24 h在心肌血管中檢測(cè)到細(xì)菌，36 h在心肌纖維中檢測(cè)到細(xì)菌，48 h橫紋兩側(cè)的肌元纖維出現(xiàn)溶解斷裂，顯示細(xì)菌在斷裂處復(fù)制，進(jìn)一步表明O46分離株感染機(jī)體的首要靶器官是心肌纖維，E.coli以心臟為主要靶器官為首次報(bào)道。另外，腦組織中檢測(cè)到的較弱陽(yáng)性信號(hào)，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞漿中，這是由于后期出現(xiàn)菌血癥時(shí)，血液中的O46向組織內(nèi)侵襲時(shí)需通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞而分散在血管內(nèi)細(xì)胞胞漿中的緣故。

表4 口服組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組織IIS檢測(cè)結(jié)果Table 4 IIS result of tissues for detection ofE.coliat different time after orally injection infected

圖1 部分臟器IIS檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The partial results of organs IIS detection

圖2 不同途徑接種O46分離株的陽(yáng)性信號(hào)檢出時(shí)間分布情況Fig.2 Distribution of time for O46isolate positive signal detection with different inoculation approach

目前認(rèn)為禽致病性大腸桿菌(APEC）主要通過(guò)呼吸道感染，APEC進(jìn)入家禽的上呼吸道，首先附著氣管上皮細(xì)胞，結(jié)合后的APEC不易被機(jī)體清除，很易侵入呼吸道深部進(jìn)行定殖，這是細(xì)菌發(fā)揮其致病作用的關(guān)鍵一步。當(dāng)侵入肺部時(shí)，APEC從肺泡毛細(xì)血管進(jìn)入血液循環(huán)，引起菌血癥，從而在全身組織內(nèi)增殖，當(dāng)家禽體內(nèi)血液和組織抵抗力被抑制時(shí)，APEC大量繁殖，引起敗血癥。石火英等對(duì)APEC O18分離株研究結(jié)果表明，氣管、肺和氣囊是雞E.coli定居的場(chǎng)所[8]。但在本實(shí)驗(yàn)中，人工感染O46分離株的雛鴨氣管中均未檢測(cè)到目的細(xì)菌陽(yáng)性信號(hào)，不同途徑接種E.coli均以心臟、肺臟及脾臟的陽(yáng)性檢出率最高。而口服組最早12 h可以在小腸、心、肺、肝和脾臟檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，表明O46分離株有別于其他血清型APEC的呼吸道感染，可能是通過(guò)腸道或其它途徑感染家禽，感染機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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The dynamic detection of duckE.coliO46distribution in organs of experimentally infected duckling by immunohistochemistry

RAN Dan-dan,YU Xue-hui,LUO Wei,LIU Fei,SUN Ji,LIU Ya-gang*
(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China）

To investigate the dynamic distribution of a pathogenic duckE.coliO46strain in different organs of ducklings after experimental infection,the ducklings were inoculated with theE.coliO46isolate via oral,intramuscular injection and subcutaneous routes,respectively.At different time points after infection,tissue samples were collected from 12 organs,and slices were prepared and tested by immunohistochemical assay with O46-specific antiserum to observe the bacterial antigen localizations in infected ducklings.The results showed that the bacterial antigen was detected in all organs except for trachea.Heart,lung,spleen kidney and intestinal tract were proven to be the main target tissues of the bacteria,and bacterial antigen mainly located in cytoplasm of infected cells.Positive signals were first detected in heart.The results obtained in this study suggested that theE.coliO46strain isolated from duck has a broad tissue tropism,and therefore could lead to acute onset and death of the ducks.

E.coliO46isolated;immunohistochemistry;infected duckling;dynamic change

S852.61

A

1008-0589(2014）03-0192-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.03.06

*Correspondingauthor

2013-07-31

國(guó)家科技部農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2013GDZF000422）；西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目(CX2013SZ72）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(11NPT03）

冉丹丹(1988-），女，土家族，貴州銅仁人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病防治研究工作.

*通信作者：E-mail：LYG_068@163.com

(本文編輯：任安琦）