生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)D-阿洛糖的分離純化

馮再平，沐萬孟，江 波，*，張 濤，薛 冬

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050；3.太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司，浙江紹興 312000）

生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)D-阿洛糖的分離純化

馮再平1，2，沐萬孟1，江 波1，*，張 濤1，薛 冬3

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050；3.太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司，浙江紹興 312000）

利用重組菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib，將原料D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化為具有抑癌效果的稀有糖D-阿洛糖。經(jīng)液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）鑒定，反應(yīng)混合液中25%的D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化成了D-阿洛糖。等電聚焦法測定了重組蛋白的等電點為6.3，并成功運用到產(chǎn)物混合液的去蛋白沉淀中。經(jīng)過預(yù)處理的混合糖液，通過DTFCa2+型離子交換樹脂實現(xiàn)了分離純化。最佳分離條件為：柱溫60℃，進(jìn)樣量4mL，流速1mL/min。

D-阿洛糖，生物轉(zhuǎn)化，等電點沉淀，純化

稀有糖（Rare sugar）是一類重要的碳水化合物，在膳食、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域中發(fā)揮著非常重要的功能。根據(jù)國際糖協(xié)會（ISRS）定義，已知的己糖和戊糖中，除了葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、核糖和L-阿拉伯糖等7種單糖在自然界大量存在以外，其余20種己糖和9種戊糖都屬于在自然界含量極少的稀有糖[1]。稀有糖一般具有低熱量、低吸收的特點，如D-塔格糖、D-阿洛酮糖等。D-阿洛糖由于具有廣泛的生理功能[2]，特別是具有優(yōu)異的抑癌作用[3]和輔助癌癥放[4]、化療[5]的作用，而成為稀有糖功能性及生物轉(zhuǎn)化研究中的熱點。

D-阿洛糖是D-葡萄糖的C-3位差向異構(gòu)體，屬于稀有糖，可利用化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。相對于化學(xué)法，生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、污染小等優(yōu)點。D-阿洛糖的生物轉(zhuǎn)化可以通過兩步反應(yīng)實現(xiàn)[6]：首先由較便宜的D-果糖出發(fā)，通過D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶（D-tagatose-3-epimerase，DTE）家族轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖[7]；D-阿洛酮糖再由L-鼠李糖異構(gòu)酶（L-Rhamnose isomerase，L-RhI）[8]或者核糖-5-磷酸異構(gòu)酶B（ribose-5-phosphate isomerase，RpiB）[9]等酶類催化酮醛糖異構(gòu)化反應(yīng)從而獲得D-阿洛糖。生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)稀有糖時，產(chǎn)物和底物通常以一定平衡比例混合存在于混合液中，因此解決產(chǎn)物分離的問題是稀有糖生產(chǎn)中必須面對的難題。通過Ca2+型陽離子樹脂配位交換可實現(xiàn)單糖的分離[10]，D-阿洛酮糖與D-果糖的分離方法已有文獻(xiàn)報道[11]，而D-阿洛糖與D-阿洛酮糖的分離尚未見報道。要實現(xiàn)D-阿洛糖在食品、制藥等領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用，先要解決生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)得到的混合糖液的分離純化問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-阿洛糖、D-阿洛酮糖 Sigma公司，（≥95%）；DTF-Ca2+色譜分離樹脂 江蘇蘇青集團(tuán)；IPG預(yù)制膠條 、 水 化 上 樣 緩 沖 液 美 國 Bio-Rad 公 司 ；CaCl2、DTT、丙酮、鹽酸等試劑 均為分析純。

Agilent 1260高效液相色譜 Agilent公司；Sugar-PakTM1糖柱、UPLC/ES-QTOF-MS液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC色譜儀 Waters公司；HL-2B型數(shù)顯恒流泵、DBS-100自動部分收集器 上 海 滬 西 分 析 儀 器 廠 ；PowerPac Basic電 泳 設(shè)備 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 D-阿洛糖的生物轉(zhuǎn)化[9]RpiB酶因具有廣泛的底物特異性，可催化與磷酸糖相類似的單糖底物發(fā)生酮醛異構(gòu)化，而被應(yīng)用于D-阿洛糖的酶法生產(chǎn)。本實驗室構(gòu)建了可以表達(dá)Thermotoga lettingae TMO RpiB酶的重組菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib，誘導(dǎo)表達(dá)后獲得凍干菌體備用。在pH8.0，55℃條件下，適量凍干菌體振蕩轉(zhuǎn)化100g/L的D-阿洛酮糖底物24h。

1.2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LC-MS/MS鑒定 LC-MS/MS檢測含D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的產(chǎn)物混合糖液。色譜條件為：ACQUITY UPLC色譜儀，TSK-gel Amide-80氨基柱，流動相65%乙腈，柱溫35℃，流速0.3mL/min，進(jìn)樣量1μL。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子（ESI）源；毛細(xì)管電壓3.0kV；錐孔電壓30V；離子源溫度100℃。將D-阿洛糖、D-阿洛酮糖標(biāo)樣及反應(yīng)產(chǎn)物分別上樣，測定分析，對照標(biāo)樣和樣品峰的出峰時間及質(zhì)譜碎片，分析樣品成分。

1.2.3 重組酶蛋白等電點測定[12]采用離心配合等電點沉淀的方法除去混合糖液中大量存在的RpiB蛋白，需要先測定重組蛋白的等電點。純化得到電泳純度95%以上的重組蛋白，重懸于含0.2%DTT的預(yù)冷丙酮中，-20℃沉淀過夜。4℃，12000r/min離心30min，沉淀重懸于含0.2%DTT的預(yù)冷丙酮中，-20℃放置1h。4℃，12000r/min離心30min，在通風(fēng)櫥中讓丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀。500μL水化上樣緩沖液充分溶解適當(dāng)量的蛋白粉末。在裝有預(yù)制膠條的水化盤中加入蛋白水化液，4℃水化過夜后進(jìn)行等點聚焦電泳、考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.4 D-阿洛糖樣品預(yù)處理 經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化得到的產(chǎn)物混合液，8000r/min離心30min除去菌體。調(diào)節(jié)溶液pH至等電點后煮沸，保持5min使產(chǎn)物混合液中的酶蛋白變性沉淀，12000r/min離心30min除去溶液中蛋白質(zhì)。采用陰陽離子色譜法脫鹽脫色[11]，得到含D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合糖液。

1.2.5 DTF-Ca2+離子交換層析[13]DTF-Ca2+色譜分離樹脂的處理再生：180mL樹脂裝填到長1m，內(nèi)徑1.6cm的帶有恒溫夾套的層析柱，5%的鹽酸溶液沖洗至進(jìn)出口酸度相同后，浸泡4h，純水沖洗至中性；10%CaCl2溶液沖洗至流出液pH7.30后，浸泡4h，純水沖洗樹脂至中性。上樣一定量的混合糖液，以去離子水作為流動相，分別控制夾套溫度為55、60、65℃，進(jìn)樣量為4、8、12mL，流速為0.5、1、2mL/min進(jìn)行洗脫，部分收集器收集洗脫樣品。

1.2.6 收集部分的HPLC檢測 HPLC測定各收集部分中D-阿洛糖和D-阿洛酮糖的濃度[13]，計算分離度。分離度的計算公式為[11]：

式中，tDP為D-阿洛酮糖保留時間，tDA為D-阿洛糖保留時間，為D-阿洛酮糖色譜峰的半峰寬度，為D-阿洛糖半峰寬，以上單位均為min。

2 結(jié)果與討論

2.1 D-阿洛糖產(chǎn)物的定性、定量檢測

以含RpiB酶的菌體催化D-阿洛酮糖的生物轉(zhuǎn)化，獲得含有D-阿洛糖的產(chǎn)物混合液。對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS-MS定性，對比轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品的液相出峰時間及質(zhì)譜圖譜，分析反應(yīng)產(chǎn)物成分。如圖1所示，在（e）產(chǎn)物色譜圖中，有兩個峰分別與（a）中的D-阿洛糖標(biāo)樣及（c）中的D-阿洛酮糖標(biāo)樣色譜出峰時間 相 對 應(yīng) ；且 對 應(yīng) 時 間 出 峰 處 的 MS-MS 圖 譜 ，（f）與（b）中D-阿洛糖標(biāo)樣、（g）與（d）中D-阿洛酮糖標(biāo)樣的MS-MS譜圖碎片相一致。因此，可以判定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中確實存在D-阿洛糖、D-阿洛酮糖兩種組分，即生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-阿洛糖的產(chǎn)物與底物，且根據(jù)色譜定量結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中兩者的比例是25∶75，與其他文獻(xiàn)[3]報道的RpiB催化D-阿洛糖生成的酶反應(yīng)產(chǎn)物平衡比例較為接近。

2.2 等電點測定及產(chǎn)物預(yù)處理

重組RpiB等電點的計算值為6.49，而根據(jù)IPG預(yù)制膠條的線性梯度計算出來的RpiB的等電點為6.3，說明該酶的等電點在中性偏酸的位置。在等電點沉淀去蛋白的時候，以鹽酸調(diào)節(jié)產(chǎn)物混合液的pH至6.3~6.5之間時出現(xiàn)明顯混濁，加熱處理后出現(xiàn)大量沉淀；與同不調(diào)節(jié)pH并直接進(jìn)行加熱處理的產(chǎn)物混合液相比，蛋白沉淀增加顯著。本轉(zhuǎn)化反應(yīng)中運用的RpiB酶耐熱性較好，轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以在較高溫度下進(jìn)行，提高了轉(zhuǎn)化效率且不易受微生物污染。因此，不同于其他酶高溫處理后即可變性沉淀，在產(chǎn)物處理的時候，必須結(jié)合等電點沉淀和高溫處理，才能達(dá)到滿意的蛋白去除效果。同時，調(diào)節(jié)反應(yīng)產(chǎn)物pH到中性偏酸后再進(jìn)行加熱處理，也可避免單糖在偏堿性環(huán)境中加熱生成較多的副產(chǎn)物。

2.3 糖液的離子交換樹脂分離

2.3.1 溫度對分離效果的影響 根據(jù)HPLC測定結(jié)果，D-阿洛糖先于D-阿洛酮糖洗脫下來。糖液濃度與洗脫體積進(jìn)行Gause擬合，計算兩者的分離度。如圖2所 示 ，進(jìn) 樣 量 為 12mL，流 速 為1mL/min，柱 溫 為55、60、65℃時，分離度分別為1.01、1.09和1.01，可見60℃時D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離效果較好，在后續(xù)實驗中采用此柱溫條件。

2.3.2 進(jìn)樣量對分離效果的影響 采用流速1mL/min，柱溫60℃的分離條件，考察進(jìn)樣量對分離效果的影響。由圖3可知，進(jìn)樣量為4、8、12mL時對應(yīng)的分離度分別為1.76、1.51和1.13。在固定填料體積的情況下，進(jìn)樣為4mL時的分離效果較好，上樣量增加，加大了分離柱的負(fù)荷，糖之間的分離度下降。進(jìn)樣體積8mL時，分離效果稍有下降，但是一次進(jìn)樣量提高了1倍，產(chǎn)品量較多而對純度要求不高時可以考慮使用該條件。

2.3.3 洗脫速率對分離效果的影響 柱溫為60℃、進(jìn)樣體積為4mL時，不同洗脫速率下D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離曲線如圖4所示。結(jié)果顯示，洗脫速率為0.5、1、2mL/min時，分離度分別為1.45、1.76和1.37，1mL/min為最佳洗脫速率，在此條件下可以分離得到純度90%以上的D-阿洛糖。

圖1 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的LC-MS-MS圖譜Fig.1 LC-MS-MS profile of main products in the reaction mixture

圖2 不同柱溫時D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離曲線Fig.2 Seperation curve of D-allose and D-psicose at different temparatures

3 結(jié)論

利用重組菌E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib，以D-阿洛酮糖為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，LC-MS-MS檢測，獲得了D-阿洛糖、D-阿洛酮糖兩者比例為25∶75的產(chǎn)物混合液。針對重組RpiB耐熱性好，僅用高溫處理反應(yīng)液去蛋白效果不理想的情況，本研究通過等電聚焦電泳測得重組酶的等電點為6.3，在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了等電點沉淀結(jié)合熱處理法去除反應(yīng)液里的蛋白，取得了較好的效果。建立了DTF-Ca2+型離子交換樹脂分離D-阿洛糖、D-阿洛酮糖的方法，分離得到了純度90%以上的D-阿洛糖，為大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)D-阿洛糖提供了技術(shù)支持。DTF-Ca2+型離子交換樹脂分離D-阿洛糖的具體條件為：填料180mL，帶恒溫夾套的層析柱長1m，內(nèi)徑1.6cm，去離子水為流動相，進(jìn)樣量為4mL，洗脫速率為1mL/min流速，柱溫為60℃。

圖3 不同上樣體積時D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離曲線Fig.3 Seperation curve of D-allose and D-psicose with different loading volume

圖4 不同洗脫速率時D-阿洛糖和D-阿洛酮糖分離曲線Fig.4 Seperation curve of D-allose and D-psicose at different flow rate

[1]Granstrom T B，Takata G，Tokuda M，et al.Izumoring：A novel and complete strategy for bioproduction of rare sugars[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2004，97（2）：89-94.

[2]沐萬孟，張龍濤，江波，等.D-阿洛糖的功能及生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ，2007，35（32）：10192-10193，10200.

[3]Lim Y R，Oh D K.Microbial metabolism and biotechnological production of D-allose[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91（2）：229-235.

[4]Hoshikawa H，Indo K，Mori T，et al.Enhancement of the radiation effects by D-allose in head and neck cancer cells[J]. Cancer Letters，2011，306（1）：60-66.

[5]Yamaguchi F，Kamitori K，Sanada K，et al.Rare sugar D-allose enhances anti-tumor effect of 5-fluorouracil on the human hepatocellular carcinoma cellline HuH-7[J].Journalof Bioscience and Bioengineering，2008，106（3）：248-252.

[6]柏瑋，朱玥明，門燕，等.以D-果糖為原料利用新型異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿洛糖[J]. 生物工程學(xué)報，2012，28（4）：457-465.

[7]Mu W M，Zhang W L，F(xiàn)eng Y H，et al.Recent advances on applications and biotechnological production of D-psicose[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2012，94（6）：1461-1467.

[8]Lin C J， Tseng W C，F(xiàn)ang T Y.Characterization of a thermophilic L-rhamnose isomerase from caldicellulosiruptor saccharolyticus atcc 43494[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（16）：8702-8708.

[9]Feng Z P，Mu W M，Jiang B.Characterization of ribose-5-phosphate isomerase converting D-psicose to D-allose from Thermotoga lettingae TMO[J].Biotechnology Letters，2013，35（5）：719-724.

[10]錢永，戴軍，彭奇，等.離子交換樹脂層析法分離木糖醇結(jié)晶母液[J].離子交換與吸附，2005，21（2）：112-120.

[11] 邢慶超，沐萬孟，江波，等.D-阿洛酮糖的分離純化[J]. 食品工業(yè)科技，2011，32（9）：236-238.

[12] 郭堯君. 蛋白 質(zhì) 電 泳 實 驗 技 術(shù)[M]. 北 京 ：科 學(xué) 出 版 社 ，2001：262-283.

[13]趙萌，張濤，沐萬孟，等.陽離子交換樹脂分離純化酶法合成 的 雙 果 糖 酐 Ⅲ[J]. 食 品 與 發(fā) 酵 工 業(yè) ，2009，35（9）：134-136，141.

Separation and purification of D-allose produced by biotransformation

FENG Zai-ping1，2，MU Wan-meng1，JIANG Bo1，*，ZHANG Tao1，XUE Dong3
（1.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China；3.Taiji Group Zhejiang Dongfang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shaoxing 312000，China）

The anticancer rare sugar D-allose was converted from D-psicose by E.coli BL21/pET-22b-tl-rpib. The LC-MS/MS results showed that 25%of D-psicose was converted to D-allose in the reaction product mixture.The pI of the recombinant protein was 6.3 determined by isoelectrofocusing and was successfully applied in isoelectric precipitation.The methods of separation and purification of D-allose was established according to DTF-Ca2+cation exchange chromatography with a flow rate of 1mL/min，column temperature at 60℃ and the loading volume of 4mL.

D-allose；biotransformation；isoelectric precipitation；purification

TS202

A

1002-0306（2014）22-0304-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.058

2014－02－27

馮再平（1978-），女，博士研究生，講師，研究方向：食品生物技術(shù)。

* 通訊作者：江波（1962-），男，博士，教授，研究方向：酶在食品生物制造中的應(yīng)用。

國家自然科學(xué)基金項目（21276001，31171705）；紹興市科技計劃項目（2013A23002）。