沙蔥不同部位提取物總黃酮含量及其體外抗氧化、抗菌活性研究

薩茹麗，木其爾，王翠芳，包玲玲，敖長(zhǎng)金

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

沙蔥不同部位提取物總黃酮含量及其體外抗氧化、抗菌活性研究

薩茹麗，木其爾，王翠芳，包玲玲，敖長(zhǎng)金*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

以沙蔥花、葉、稈提取物為對(duì)象，研究沙蔥不同部位提取物中總黃酮含量、還原能力、清除DPPH自由基能力、體外清除羥基自由基能力以及體外對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用。結(jié)果表明：沙蔥不同部位提取物總黃酮含量最高的為沙蔥葉提取物，且各提取物均有一定的體外抗氧化與抗菌作用，其中沙蔥葉提取物體外抗氧化及抗菌活性較好，對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)52.2%、對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)84.4%。

沙蔥提取物，總黃酮含量，體外抗氧化活性，體外抗菌活性

沙 蔥（Allium Mongolicum Regel）在 蒙 古 語(yǔ) 中 稱(chēng)之為“胡穆利”，學(xué)名“蒙古韭，為百合科，蔥屬植物[1]。沙蔥營(yíng)養(yǎng)成分豐富，所含氨基酸與微量元素種類(lèi)齊全[2]，其嫩葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高且味道鮮美，是草原人民餐桌上常見(jiàn)的菜肴，也是牧畜喜愛(ài)的優(yōu)良牧草。多項(xiàng)研究表明沙蔥中所含有的特殊天然成分具有良好的抗氧化[3-5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、免疫調(diào)節(jié)[8-9]、提高畜產(chǎn)品 品 質(zhì)[10-11]等 生 物 功 效[6-11]，但 對(duì) 于 沙 蔥 不 同 部 位的生物活性成分以及生物功效的相關(guān)研究報(bào)道卻較為少見(jiàn)。目前已有的研究認(rèn)為，植物的乙醇提取物中含有較多的黃酮類(lèi)化合物。黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)廣泛存在于瓜果、蔬菜以及中草藥中的活性成分，也是體外抗氧化的主要有效成分[12-14]，在體外對(duì)DPPH自由基、羥基自由基具有較好的清除作用。也有研究表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌以及真菌等致病菌具有一定的抑制作用[15-16]。本研究以沙蔥花、葉、稈為對(duì)象，探究了沙蔥不同部位提取物的還原能力、體外清除DPPH自由基和羥基自由基能力以及體外對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌作用，旨在探討沙蔥不同部位提取物的體外抗氧化與抗菌能力，為沙蔥的開(kāi)發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙蔥嫩葉、花蕾以及粗稈 均采自?xún)?nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克前旗天然牧場(chǎng)（經(jīng)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院鑒定）；DPPH、BHT、DMSO、MTT 均購(gòu)自Sigma公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 貴州迪大科技有限責(zé)任公司；其他化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，大腸桿菌（ATCC-25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC-25923）、綠膿桿菌（27853）、和沙門(mén)氏菌（50096） 所用菌種均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；Synergy H4多功能酶標(biāo)儀，電子分析天平 Sartorius；超聲波清洗機(jī) 長(zhǎng)沙惠一儀器有限公司；離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；冷凍干燥機(jī) Millipore公司；恒溫培養(yǎng)箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；超凈工作臺(tái) 蘇州凈化儀器廠(chǎng)；微量振蕩混勻機(jī) 南通無(wú)線(xiàn)電三廠(chǎng)；平板離心機(jī) Eppendorf公司；高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)原料的預(yù)處理 將樣品洗凈、65℃烘干，粉碎，過(guò)80目細(xì)篩。按1∶10的比例加入石油醚進(jìn)行脫脂脫色處理，揮干石油醚后干燥貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取物的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g預(yù)備粉末置于150mL三角錐形瓶中，加入70%乙醇50mL，混勻后置于超聲波清洗機(jī)內(nèi)超聲提取。超聲條件為：240W、提取時(shí)間20min、提取溫度40℃、提取次數(shù)1次。將所得產(chǎn)物經(jīng)2000r/min離心10min后棄掉沉淀，收集上清后，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃濃縮至10mL左右后使用冷凍干燥機(jī)對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥48h，即可得到粉末狀的總黃酮。使用前稱(chēng)取100mg凍干粉末用75%乙醇定容至10mL即為10mg/mL總黃酮原液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌備用。試驗(yàn)分別就沙蔥花、葉以及稈進(jìn)行提取，每組五個(gè)重復(fù)。

1.2.3 沙蔥不同部位黃酮含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別配制濃度為0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42、0.48、0.54、0.60mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用1.2.3.2所示測(cè)定方法測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液在510nm處的吸光值，參照趙春艷方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[8]。

1.2.3.2 樣品中黃酮含量的測(cè)定 從各組樣品原液中分別吸取300μL于2mL EP管中，加入20%的NaNO2溶液30μL，充分混勻后反應(yīng)3min；加入40%Al（NO3）3溶液40μL，充分混勻并反應(yīng)3min后加入100μL的20%NaOH溶液，充分混勻后反應(yīng)10min。從每管吸取200μL體積樣品于96孔板內(nèi)，酶標(biāo)儀測(cè)定其510nm處吸光度。

1.2.4 沙蔥不同部位提取物抗氧化能力的測(cè)定

1.2.4.1 總還原能力的測(cè)定 在試管中分別加入2.5mL pH為6.6的磷酸鹽緩沖溶液（PBS溶液），再加入0.01g/mL的鐵氰化鉀溶液1mL、混勻后加入待測(cè)樣品1mL后充分搖勻，50℃水浴保溫靜置20min，待冷卻后迅速加入0.1g/mL的三氯化鐵溶液1mL，混勻靜置10min后于700nm處檢測(cè)吸光值，總還原能力以吸光度值表示[17]。

1.2.4.2 體外清除DPPH自由基的能力 準(zhǔn)確稱(chēng)取7.88mg DPPH，用95%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得濃度為2×10-4mo1/L的DPPH原液，避光保存（0～4℃）。分別取100μL的沙蔥不同部位乙醇提取液與2×10-4mol/L DPPH液100μL于96孔板中，中速混勻5min，避光反應(yīng)30min后測(cè)定525nm處吸光度（Ai）。與此同時(shí)也分別測(cè)定100μL 95%乙醇加100μL DPPH后 的 吸 光 度（Ac）和 100μL 待 測(cè) 液 加 100μL 95% 乙 醇后的吸光度（Aj）。

1.2.4.3 清除羥基自由基的能力 按照南京建成試劑盒操作說(shuō)明執(zhí)行。

1.2.5 體外抑菌試驗(yàn) 抑菌圈直徑的測(cè)定與最小抑菌濃度的檢測(cè)試驗(yàn)方法參照烏仁張嘎[5]方法。

MTT法檢測(cè)沙蔥總黃酮的體外抑菌率的試驗(yàn)方法參照許穎[17]方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件進(jìn)行初步整理后使用SAS9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙蔥不同部位所含黃酮類(lèi)化合物濃度

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制Fig.1 Rutin standard curve

如圖1所示，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，使用Excel軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=3.9038x+0.3515（R2= 0.9998）。依據(jù)此回歸方程，測(cè)定沙蔥不同部位總黃酮的吸光度，計(jì)算黃酮濃度。

表1 沙蔥不同部位總黃酮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量Table 1 Total flavonoids content of allium mongolicum regel different part extraction

由表1可以看出，沙蔥葉中黃酮濃度達(dá)到4.891mg/g。沙蔥稈中的黃酮濃度為2.144mg/g，沙蔥花的黃酮濃度顯著（p＜0.01）少于其他兩組，僅為1.921mg/g。由此可以看出，在沙蔥葉中所含黃酮濃度最高。

2.2 沙蔥不同部位提取物還原能力的測(cè)定

如圖2結(jié)果所示，沙蔥不同部位提取物均有一定的還原能力，且試驗(yàn)結(jié)果顯示其還原能力與提取物的質(zhì)量濃度具有劑量效應(yīng)關(guān)系，即試驗(yàn)樣品原液濃度在0.5mg/mL至3mg/mL的范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的升高其還原能力也呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。在濃度較低的情況下試驗(yàn)各組提取物還原能力顯著（p＜0.01）低于對(duì)照BHT組，但隨著濃度升高至3mg/mL時(shí)試驗(yàn)各組還原能力逐漸升高此差異呈現(xiàn)逐漸縮小的趨勢(shì)。圖2中顯示，當(dāng)各組濃度相同時(shí)，沙蔥葉提取物的還原能力高于沙蔥稈與花組的還原能力（p＜0.05）。

圖2 沙蔥不同部位提取物還原能力Fig.2 Reducing capacity of extraction from allium mongolicum regel different part

2.3 沙蔥不同部位提取物清除DPPH自由基的能力

圖3 清除DPPH自由基的結(jié)果Fig.3 Result of the clearance rate of DPPH free radical

試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，沙蔥各部位提取物的清除DPPH自由基的能力顯著低于相同劑量的對(duì)照組蘆丁及BHT。沙蔥不同部位提取物的清除DPPH自由基的能力隨著濃度的增加呈增加的趨勢(shì)，其中沙蔥葉中所得提取物的清除DPPH自由基的能力顯著高于其他部位的提取物清除DPPH自由基的能力（p＜0.01）。當(dāng)樣品濃度達(dá)到0.5mg/mL時(shí)沙蔥葉提取物在體外的環(huán)境下可以有效地清除DPPH自由基，清除率均為52.2%，與其他各組差異顯著（p＜0.01）。沙蔥花提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為37%顯著低于沙蔥葉組與沙蔥稈提取物的體外清除有機(jī)自由基DPPH的能力（p＜0.01）。

2.4 沙蔥不同部位提取物體外清除羥基自由基的作用

圖4 體外清除羥基自由基的作用研究Fig.4 Result of clearance rate of hydroxyl free radicals

由圖4中的結(jié)果可看出，蘆丁體外清除羥基自由基能力最強(qiáng)。當(dāng)濃度在0.1mg/mL至0.5mg/mL時(shí)，沙蔥不同部位提取物在體外對(duì)于羥基自由基的清除率與提取物濃度具有劑量效應(yīng)關(guān)系，即濃度越高，清除羥基自由基的能力越強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示沙蔥不同部位的提取物在體外環(huán)境下對(duì)羥基自由基的作用中，當(dāng)各組濃度為0.5mg/mL時(shí)沙蔥葉中得到的提取物對(duì)羥基自由基的抑制作用較強(qiáng)（清除率為84.4%），而此時(shí)沙蔥花提取物的清除率為68.2%，沙蔥稈提取物的體外清除羥基自由基的清除率為64%，與沙蔥葉提取物體外清除羥基自由基的能力相比其差異顯著（p＜0.01）。

2.5 沙蔥不同部位提取物體外抑菌作用

2.5.1 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定沙蔥提取物體外抑菌效果 實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)為最小抑菌圈直徑（以下以大寫(xiě)字母D表示）D≤8mm為不敏感，8mm＜D≤13mm為低度敏感，13mm＜D≤19mm為中度敏感，D＞19mm為高度敏感。結(jié)果如表2所示：沙蔥葉提取物的體外抑菌效果較其他兩個(gè)試驗(yàn)組具有明顯的抑菌作用，對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌環(huán)直徑可達(dá)13.6mm，為中度敏感；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)直徑為9.3mm，為低度敏感。

表2 沙蔥不同部位提取物的體外抑菌作用Table 2 The effect of the antibacterial test of extraction from allium mongolicum regel different part

2.5.2 最小抑菌濃度的測(cè)定 使用微量稀釋法測(cè)定沙蔥不同部位提取物最小抑菌濃度。結(jié)果如表3所示，沙蔥不同部位提取物對(duì)綠膿桿菌無(wú)顯著抑制作用，沙蔥花中和沙蔥稈提取物對(duì)沙門(mén)氏菌的最小抑菌濃度均為5mg/mL；沙蔥葉提取物對(duì)綠膿桿菌無(wú)顯著抑制作用，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為5mg/mL、對(duì)沙門(mén)氏菌的最小抑制濃度為1.25mg/mL。由此表明，沙蔥葉提取物在體外對(duì)沙門(mén)氏桿菌具有較好的抑菌作用。

表3 沙蔥不同部位提取物最小抑菌濃度的測(cè)定Table 3 Minimal inhibitory concentration of extraction from allium mongolicum regel different part

2.5.3 MTT法檢測(cè)沙蔥不同部位提取物的體外抑菌率 圖5為MTT法檢測(cè)沙蔥不同部位提取物的體外對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌率。結(jié)果顯示隨著提取物濃度的升高其抑菌能力也有增高趨勢(shì)。其中對(duì)于大腸埃希氏菌的抑制作用由強(qiáng)到弱的順序是葉＞稈＞花，且各組抑制率差異顯著（p＜0.05）。對(duì)于綠膿桿菌，沙蔥各部位提取物的抑制率差異不顯著（p＞0.05），各組抑制率顯著低于對(duì)照組（p＜0.05）。對(duì)于金黃色葡萄球菌，沙蔥花與沙蔥葉中提取物（組間差異不顯著，p＞0.05）的抑制率均高于沙蔥稈提取物的抑制率，且差異顯著（p＜0.05）。對(duì)于沙門(mén)氏傷寒菌，隨著提取物濃度的升高，各組抑制率呈上升的趨勢(shì)，且差異顯著（p＜0.05），其中沙蔥葉提取物對(duì)沙門(mén)氏傷寒菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率顯著高于沙蔥花與沙蔥稈提取物的抑制率（p＜0.05）。由此來(lái)看沙蔥不同部位提取物在體外條件下對(duì)供試菌種均有一定的抑制作用，其中對(duì)沙門(mén)氏傷寒菌的抑制作用最為顯著。

圖5 沙蔥不同部位提取物體外抑菌作用的研究結(jié)果Fig.5 The effects of the antibacterial test of extraction from allium mongolicum regel different part

3 結(jié)論

近年來(lái)對(duì)于沙蔥的研究主要集中在沙蔥葉上，對(duì)于沙蔥花以及沙蔥稈的研究較少，本次實(shí)驗(yàn)以沙蔥不同部位提取物為研究對(duì)象比較沙蔥花、葉、稈提取物的抗氧化與抗菌活性。結(jié)果表明沙蔥不同部位提取物中沙蔥葉提取物具有較強(qiáng)的體外還原能力、其體外對(duì)有機(jī)自由基DPPH·的清除率可達(dá)52.2%、對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)84.4%，顯著高于沙蔥花和沙蔥稈提取物的抗氧化能力。同時(shí)在沙蔥葉提取物中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量也最高。研究表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌以及真菌等致病菌具有一定的抑制作用[18-21]。本次實(shí)驗(yàn)證明沙蔥不同部位提取物均具有一定的抗菌活性，其中沙蔥葉提取物的抗菌活性顯著高于其他兩組，對(duì)供試菌中沙門(mén)氏傷寒菌的抑菌作用較強(qiáng)，其抑菌圈直徑達(dá)13.6mm、最小抑菌濃度為1.25mg/mL。由此來(lái)看在相同的提取條件下沙蔥不同部位提取所得的提取物中，黃酮含量不同，活性也不同。其中以沙蔥葉中的黃酮含量最多，抗氧化活性與抗菌活性也較好。在后期的研究中可以使用沙蔥葉作為研究對(duì)象進(jìn)行沙蔥總黃酮的提取，并進(jìn)一步研究發(fā)掘沙蔥總黃酮的其他生物功效。

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Effect of the different parts of Allium Mongolicum Regel extraction’s total flavonoids content and antioxidant，antibacterial effects in vitro

SA Ru-li，MU Qi-er，WANG Cui-fang，BAO Ling-ling，AO Chang-jin*
（College of Animal Science，Inner Mongolia Agriculture University，Hohhot 010018，China）

The antioxidant effects and antibacterial effects of extraction from different parts of Allium Mongolicum Regel were studied.The total reducing capacity ，the scavenging abilities on DPPH radicals ，hydroxyl radicals and antibacterial activity were studied.The results showed that extraction of allium mongolicum regel leaves had the significant scavenging effects on DPPH radicals and hydroxyl radicals，inhibition ratio was 52.2%and 84.4% ， extraction from allium mongolicum regel leaves had the significant antibacterial effect to Salmonella typhoid.

Allium Mongolicum Regel extraction；total flavonoids content；anti-oxidation ability；antibacterial ability

S816.11

A

1002-0306（2014）22-0124-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.019

2014－03－11

薩茹麗（1986-），女，在讀博士研究生，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)。

* 通訊作者：敖長(zhǎng)金（1962-），教授，研究方向：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260558）。