熱處理對大豆油體表面的油體蛋白和外源性蛋白影響

陳業(yè)明，趙路蘋，熊小輝，阮奇珺，張彩猛，華欲飛

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

熱處理對大豆油體表面的油體蛋白和外源性蛋白影響

陳業(yè)明，趙路蘋，熊小輝，阮奇珺，張彩猛，華欲飛

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

研究了熱處理不同pH生豆?jié){和吸脹大豆種子對大豆油體上油體蛋白和外源性蛋白的影響，并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳表征油體蛋白和外源性蛋白的變化。研究表明：熱處理生豆?jié){和吸脹的大豆種子時(shí)，隨著溫度和時(shí)間的增加，都可以抑制內(nèi)切蛋白酶P34的活性，有利于油體蛋白保留在油體上；而且熱處理對吸脹的大豆種子效果更顯著。熱處理不同pH的生豆?jié){時(shí)，隨著熱處理強(qiáng)度和生豆?jié){pH的增加，外源性蛋白（主要是大豆球蛋白、伴大豆球蛋白和過敏性蛋白Bd 30K）會(huì)從油體上逐漸解離下來。在80℃、pH8.5下處理生豆?jié){5~30min時(shí)，油體純度高達(dá)97%，且含有的過敏性蛋白Bd 30K低于1%。

大豆油體，油體蛋白，外源性蛋白，熱處理，過敏性蛋白

大豆是世界上重要的油料作物之一，主要含有蛋白質(zhì)和油脂，其中蛋白質(zhì)貯存在蛋白質(zhì)液泡中，油脂貯存在大豆油體中[1-2]。油體是植物種子貯存油脂的亞細(xì)胞器，主要由三酰甘油酯（TAG）、磷脂（PL）和油體結(jié)合蛋白組成。Tzen和Huang提出的油體結(jié)構(gòu)模型認(rèn)為，油體內(nèi)部主要是甘油三酯，外部為磷脂單分子層和嵌入其內(nèi)的油體結(jié)合蛋白組成的半單位膜，這個(gè)半單位膜是由13個(gè)磷脂分子和1個(gè)油體結(jié)合蛋白質(zhì)分子組成[3]。油體結(jié)合蛋白質(zhì)分為三類：油體蛋白（oleosin）、油體鈣蛋白（caleosin）和油體固醇蛋白（steroleosin），但油體鈣蛋白和油體固醇蛋白在大豆油體中含量很少。Zhao等[4]報(bào)道大豆油體有多種不同 分 子 量 的 油 體 蛋 白（主 要 是 24ku oleosin和18ku oleosin）、兩種不同分子量的油體鈣蛋白（27ku和29ku）和一種油體固醇蛋白（41ku）。

大豆油體富含多不飽和脂肪酸和對人體健康有益的脂溶性生物活性物質(zhì)（如維生素E、磷脂和異黃酮等）[5-7]，其特殊結(jié)構(gòu)和功能性成分，使大豆油體成為天然的乳化劑，在食品和化妝品行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。

在大豆油體的提取過程中，許多外源性蛋白會(huì)結(jié)合到油體表面，如大豆球蛋白、伴大豆球蛋白和過敏性蛋白Bd 30K，其中Bd 30K是大豆蛋白中一種重要的免疫顯性過敏原，這給油體運(yùn)用帶來了安全問題。趙路蘋等[8]研究發(fā)現(xiàn)生豆?jié){經(jīng)過80~100℃加熱15min可以得到高純度大豆油體。Chen等[9]報(bào)道，從pH11的生豆?jié){中提取得到不含有過敏性蛋白（Bd 30K）的油體。由于在100℃和pH11的條件下大豆蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性，同時(shí)高pH提取油體不利于環(huán)境保護(hù)[10]。故本文選擇較低溫度（50~80℃）和較低pH（6.5~8.5）的條件，探索熱處理不同pH的生豆?jié){和吸脹的大豆種子，對大豆油體上油體蛋白和外源性蛋白的影響，并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳表征油體蛋白和外源性蛋白的變化，以期對在較低溫度與pH下提取不含過敏性蛋白的高純度大豆油體方法提供一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 南農(nóng)88-31號，購買于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心；蔗糖、溴酚藍(lán)、三羧基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍(lán)G250 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、巰基乙醇 優(yōu)級純，美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白 美國Bio-Rad公司。

90型磁力攪拌器 上海瀘西儀器分析廠；WH-1微型漩渦混合儀 上海瀘西分析儀器廠；PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；MJ-60BE01B組織搗碎機(jī) 美的電器有限公司；Optima L-XP超速離心機(jī) 美國Beckman Coulter；Mini-PROTEAN型垂直電泳儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生豆?jié){的制備[8]將20g大豆浸泡在去離子水（1∶9，w/w）中，在4℃冰箱放置18h。向吸脹的大豆中加入新鮮去離子水至總重200g，用組織搗碎機(jī)以18000r·min-1的速度磨漿90s，用四層紗布過濾除去豆渣。濾液稱為生豆?jié){（pH6.8）。

1.2.2 熱處理不同pH的生豆?jié){ 1.2.1制備的生豆?jié){分為三組，第1組不調(diào)pH，作為對照；第2、3組分別調(diào)pH7.5和8.5。三組生豆?jié){分別在50、60、70、80℃水浴鍋中加熱0、1、2、5、15、30min，取出后立即水冷卻。通過考察50~80℃加熱不同pH生豆?jié){0~30min，探究對大豆油體蛋白和外源性蛋白質(zhì)的影響。

1.2.3 熱處理吸脹的大豆種子 將20g大豆浸泡在去離子水（1∶9，w/w）中，在4℃冰箱放置18h。然后，向吸脹的大豆中加入新鮮去離子水至總重200g，分別在60、70、80℃水浴鍋中保溫0、5、15、30、45、60min，立即在水中冷卻，18000r·min-1磨漿90s，紗布過濾除去豆渣，得到不同條件下的豆?jié){。

1.2.4 大豆油體的提取方法 油體提取方法參考趙路蘋等[8]報(bào)道的方法，向熱處理的不同pH生豆?jié){和熱浸泡大豆后制備的豆?jié){中，分別加10%蔗糖（w/w）攪拌10min，取8.5g上述混合溶液加入超速離心管中，再在超速離心管上層加3g去離子水。4℃，35000r·min-1離心60min。收集上?。ㄓ腕w），用去離子水沖洗3次，去除表面粘附的溶液。提取的油體以1∶10（w/w）溶于去離子水。

1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） SDSPAGE參考Laemmli[11]的方法，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12.5%。樣品溶解液為0.25mol·L-1Tris-HCl（pH6.8），1%SDS，2% 巰基乙醇和0.02%溴酚藍(lán)。取油體樣品0.5mL，加入0.5mL樣品溶解液，在漩渦混合儀 上 混 勻 ，煮 沸3min，12000r·min-1離 心10min，取 下層清液上樣。樣品在濃縮膠中電流為15mA，樣品進(jìn)入分離膠后將電流調(diào)為25mA，溴酚藍(lán)距前沿約1cm時(shí)停止電泳，再固定、染色和脫色。用凝膠成像儀拍照，電泳分析使用QuantityOne1-D分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH生豆?jié){的熱處理結(jié)果與分析

2.1.1 熱處理pH6.8生豆?jié){對大豆油體蛋白和外源性蛋白的影響 從圖1可以看到，生豆?jié){提取的油體上有很多種蛋白，包括內(nèi)源性蛋白和外源性蛋白。內(nèi)源性蛋白主要是24ku oleosin和18ku oleosin，外源性蛋白主要是大豆球蛋白（A3、酸性肽鏈與堿性肽鏈）、β-伴大豆球蛋白（α、α’與β）、γ-伴大豆球蛋白和30ku（Bd 30K和P34）。其中，Bd 30K是大豆中主要的過敏性蛋白，P34是特異性水解大豆油體蛋白的一種內(nèi)切蛋白酶[12]。圖中16ku是24ku oleosin水解的肽段。根據(jù)Zhao等[4]報(bào)道，4℃下從pH6.8生豆?jié){中提取的大豆油體于室溫放置1h后，24ku oleosin被內(nèi)切蛋白酶P34水解，產(chǎn)生16ku的肽段。

圖1 熱處理pH6.8生豆?jié){對大豆油體蛋白和外源性蛋白的影響Fig.1 Effect of heat treatment of pH6.8 raw soymilk on oleosins and extrinsic proteins

從圖1可以看出，未經(jīng)熱處理的生豆?jié){（pH6.8）中提取的油體上，24ku oleosin較少，16ku肽段較多。然而隨著熱處理溫度和時(shí)間的增加，24ku oleosin在油體上保留較多，16ku的肽段減少。50℃加熱15min、60℃加熱5min、70℃加熱2min及80℃加熱1min以上，24ku oleosin保留在油體上較多，水解產(chǎn)生的16ku肽段較少。這是因?yàn)椋何唇?jīng)熱處理的生豆?jié){中存在內(nèi)切蛋白酶P34，熱處理可使內(nèi)切蛋白酶P34活性受抑制，那么24ku oleosin水解程度降低，更多的油體蛋白保留在油體上，產(chǎn)生較少的16ku肽段。經(jīng)過電泳分析軟件計(jì)算，隨著熱處理強(qiáng)度的增加，18ku oleosin含量變化不明顯。

此外，從圖1還可以看出，隨著pH6.8生豆?jié){熱處理溫度和時(shí)間的增加，油體上外源性蛋白質(zhì)從大豆油體表面解離的越來越多。外源性蛋白從油體上解離下來的原因可能：生豆?jié){中大豆球蛋白的變性溫度為（90±2）℃，β-伴大豆球蛋白的變性溫度為變性溫度為（70±2）℃[13]，熱處理強(qiáng)度增加時(shí)，油體表面結(jié)合的外源性蛋白發(fā)生不同程度變性，改變這些蛋白的表面性質(zhì)[14]，從而減弱了與油體間的相互作用力。經(jīng)過電泳分析軟件得知，80℃熱處理15~30min生豆?jié){，所提取油體上90%的外源性蛋白質(zhì)解離下來，且30ku占總蛋白含量的5%以上，得到較高純度油體。

圖2 熱處理pH7.5生豆?jié){對大豆油體蛋白和外源性蛋白的影響Fig.2 Effect of heat treatment of pH7.5 raw soymilk on oleosins and extrinsic proteins

2.1.2 熱處理pH7.5生豆?jié){對大豆油體蛋白和外源性蛋白的影響 圖2可以看出，未經(jīng)加熱的生豆?jié){（pH7.5），24ku oleosin保 留 在 油體上 較 少 ，16ku肽 段較多；當(dāng)熱處理時(shí)間和溫度增加時(shí)，24ku oleosin在油體上保留較多，16ku逐漸減少。50℃加熱15min、60℃加熱5min、70℃加熱2min以上，較多24ku oleosin保留在油體上，水解產(chǎn)生較少的16ku肽段。與熱處理pH6.8生豆?jié){中提取的油體相比，在相同熱處理強(qiáng)度下，pH7.5生豆?jié){得到的油體上保留更多的24ku oleosin，水解產(chǎn)生的16ku肽段更少。這說明除溫度外，增加生豆?jié){pH也可以抑制P34活性。但是，當(dāng)80℃加熱pH 7.5生 豆 漿1min 以 上 ，P24 oleosin 沒 有 明 顯 變 化 ，而16ku肽段比70℃加熱時(shí)的多，甚至也比80℃加熱pH6.8生豆?jié){的多，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因還有待研究。綜上所述，增加溫度和pH可以抑制內(nèi)切蛋白酶P34活性，有利于油體蛋白保留在油體上。

此外，隨著熱處理強(qiáng)度的增加，外源性蛋白逐漸從油體上解離下來。在相同熱處理強(qiáng)度下，pH7.5比pH6.8的生豆?jié){中所提取油體上結(jié)合的外源性蛋白質(zhì)（尤其是30ku）少，經(jīng)電泳分析軟件計(jì)算，70℃加熱15~30min和80℃加熱5~30min可以去除95%以上的外源性蛋白。其中70℃加熱15~30min時(shí)30ku占總蛋白含量的4.5%以上；80℃加熱5~30min時(shí)，30ku占總蛋白含量的1.9%~2.7%。

圖3 熱處理pH8.5生豆?jié){對大豆油體蛋白和外源性蛋白的影響Fig.3 Effect of heat treatment of pH8.5 raw soymilk on oleosins and extrinsic proteins

2.1.3 熱處理pH8.5生豆?jié){對大豆油體蛋白和外源性蛋白的影響 從圖3可以看出，50~70℃熱處理pH8.5生豆?jié){中提取的油體上，24ku oleosin在1~30min內(nèi)都沒有明顯變化，水解產(chǎn)生很少的16ku肽段。在相同熱處理強(qiáng)度下，pH8.5抑制內(nèi)切蛋白酶P34的活性比pH6.5和pH7.5下作用更強(qiáng)，外源性蛋白質(zhì)從油體上解離下來的程度更大，且獲得高純度油體的加熱時(shí)間減少。這可能是因?yàn)榧冇腕w和外源性蛋白質(zhì)在中性條件下帶有負(fù)電[15]，隨著生豆?jié){pH的增加，油體及大豆蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷增加，導(dǎo)致油體和外源性蛋白質(zhì)之間的靜電斥力增加，促進(jìn)外源性蛋白從油體上解離下來。因此，70℃加熱15~30min及80℃加熱5~ 30min可以去除97%以上的外源性蛋白。且經(jīng)電泳分析軟件計(jì)算，在70℃加熱15~30min時(shí)30ku占總蛋白含量的1.2%~1.5%；80℃加熱5~30min時(shí)30ku占總蛋白含量的0.7%~0.9%。

2.2 熱處理吸脹大豆種子對大豆油體蛋白和外源性蛋白的影響

在成熟的植物種子中，蛋白質(zhì)貯存液泡與油體是獨(dú)立的亞細(xì)胞器[16]，吸脹的大豆種子經(jīng)過磨漿，蛋白質(zhì)貯存液泡破碎，釋放出的蛋白質(zhì)通過作用力結(jié)合到油體表面。本實(shí)驗(yàn)探究熱處理吸脹的大豆種子對油體蛋白和外源性蛋白的影響。

圖4 熱浸泡大豆種子對大豆油體蛋白和外源性蛋白的影響Fig.4 Effect of heat treatment of soybean seed on oleosins andextrinsic proteins

通過圖4可以看出，60℃浸泡15~60min和70、80℃浸泡5~60min都會(huì)使內(nèi)切蛋白酶P34失活，24ku oleosin和18ku oleosin含量變化不顯著，16ku肽段沒有出現(xiàn)。浸泡溫度為60℃時(shí)，即使浸泡60min，油體上結(jié)合的外源性蛋白仍很多，油體純度低；70℃浸泡處理30min和80℃浸泡15min以上，油體上結(jié)合的外源性蛋白明顯減少，油體純度增加。這說明，熱處理吸脹大豆種子可以有效抑制P34的活性。與熱處理生豆?jié){相比，熱處理吸脹的大豆種子更有利于減少油體蛋白的水解。導(dǎo)致這一結(jié)果的可能原因：吸脹的大豆種子經(jīng)過熱處理時(shí)，貯存液泡內(nèi)的大豆蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生不同程度的變性，種子磨漿后變性的大豆蛋白質(zhì)從貯存液泡里釋放出來，變性的蛋白質(zhì)不容易結(jié)合到油體表面，同時(shí)P34也在磨漿之前活性受抑制，即使磨漿后結(jié)合到油體表面，其活性也很低。

3 結(jié)論

本文考察了pH6.8、7.5、8.5生豆?jié){的熱處理和大豆種子的熱浸泡對大豆油體表面油體蛋白和外源性蛋白的影響。研究表明：

3.1 熱處理生豆?jié){和吸脹的大豆種子，對18ku oleosin影響不顯著。

3.2 生豆?jié){和大豆種子未經(jīng)熱處理時(shí)，24ku oleosin被內(nèi)切蛋白酶P34水解而在油體上保留較少，同時(shí)產(chǎn)生16ku肽段；熱處理強(qiáng)度和pH的增加會(huì)抑制P34活性和促進(jìn)外源性蛋白的從油體上解離。

3.3 增加生豆?jié){的pH、熱處理的溫度及熱處理的時(shí)間，可以更多的去除油體表面的外源性蛋白質(zhì)，增加油體的純度，同時(shí)促進(jìn)過敏性蛋白Bd 30K的去除，更有利于油體在食品和化妝品行業(yè)的應(yīng)用。

綜上所述，生豆?jié){pH8.5，經(jīng)80℃加熱5~30min處理，高速離心得到的油體純度高達(dá)97%，且含有的過敏性蛋白Bd 30K低于1%。

[1]韓寶達(dá)，李立新.植物種子貯藏蛋白質(zhì)及其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與加工[J]. 植物學(xué)報(bào)，2010，45（4）：492-505.

[2]IWANAGA D，GRAY D A，F(xiàn)ISK I D，et al.Extraction and characterization of oil bodies from soy beans：A natural source of pre-emulsified soybean oil[J].Journal of Agricuture and Food Chemistry，2007，55：8711-8716.

[3]TZEN J T C，HUANG A H C.Surface structure and properties of plants seed oil bodies[J].The Journal of Cell Biology，1992，117：327-335.

[4]ZHAO L，CHEN Y，CAO Y，et al.The Integral and Extarinsic Bioactive Proteins in the Aqueous Extracted Soybean Oil Bodies [J].Journal of Agricuture and Food Chemistry，2013，61（40）：9727-9733.

[5]WHITE D A，F(xiàn)ISK I D，GRAY D A.Characterisation of oat（Avena sativa L.） oil bodies and intrinsically associated E-vitamers[J].Journal of Cereal Science，2006，43：244-249.

[6]FISK I D，GRAY D A.Soybean（Glycine max） oil bodies and their associated phytochemicals[J].Journal of Food Science，2011，76：1349-1354.

[7]FISK I D，WHITE D A，CARVALHO A，et al.Tocopherol-an intrinsic component of sunflower seed oil bodies[J].Journal of the American Oil Chemists’Society，2006，83：341-344.

[8]趙路蘋，陳業(yè)明，張彩猛，等.提取條件對大豆油體表面蛋白質(zhì)的影響[J]. 大豆科學(xué)，2013，32（6）：835-839.

[9]CHEN Y，ONO T.Simple extraction method of non-allergenic intact soybean oil bodies that are thermally stable in an aqueous medium[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（12）：7402-7407.

[10]FRIEDMAN M，LEVIN C E，NOMA A T.Factors governing lysinoalanine formation in soy proteins[J].J Food Sci，1984，49，1282-1288.

[11]LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature，1970，227：680-685.

[12]CHEN Y，ZHAO L，CAO Y，et al.Oleosins（24 and 18 kDa）are hydrolyzed not only in extracted soybean oil bodies but also in soybean germination[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（12）：956-965.

[13]汪立君，李里特，張曉峰，等.利用DSC對大豆蛋白質(zhì)熱變性的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，6（6）：93-96.

[14]PETRUCCELLI S，ANON M C.Thermal aggregation of soy protein isolates[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1955，43：3035-3041.

[15]TZEN J T C，CAO Y Z，LAURENT P，et al.Lipids，proteins and structure of seed oil bodies from diverse species[J].Plant Physiology，1993，101（1）：267-276.

[16]KATAVIC V，AGRAWAL G K，HAJDUCH M，et al.Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivars[J].Proteomics，2006（6）：4586-4598.

Effect of heating on oleosins and extrinsic proteins from soybean oil bodies

CHEN Ye-ming，ZHAO Lu-ping，XIONG Xiao-hui，RUAN Qi-jun，ZHANG Cai-meng，HUA Yu-fei
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Effect of heat treatment of soybean seed and different pH value of raw soybean milk on oleosins and extrinsic proteins from soybean oil bodies were studied，and oleosins and extrinsic proteins were characterized by SDS-PAGE.The conclusions were demonstrated as three points.When soybean seed of imbibition and raw soybean milk were treated by heat，the endo protease activity of P34 was inhibited with increasing of temperature and time.Consequently，it was benefical for oleosin keeping at oil body and the effect of heat treatment on soybean seed of imbibition was more remarkable than raw soybean milk.Extrinsic proteins（including glycinin，conglycinin，and allergic protein of Bd 30K）were gradually hydrolyzed from oil body with increasing of heat treated strength and pH when raw soybean milk with different pH walues was heated.The purity of oil body and content of Bd 30K were 97%and under 1%respectively when oil body was prepared from raw soybean milk at 80℃，pH8.5，and 5～30min.

soybean oil body；oleosins；extrinsic proteins；heating；allergic protein

TS214.2

A

1002-0306（2014）22-0106-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.015

2014－02－17

陳業(yè)明（1982-），男，副教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白。

* 通訊作者：華欲飛（1962-），男，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白。

國家自然科學(xué)青年基金（31301496）；江南大學(xué)博士研究生科學(xué)研究基金項(xiàng)目（JUDCF10025）。