三種華法林基因預(yù)測(cè)模型與心臟瓣膜置換術(shù)后華法林劑量的相關(guān)性研究

彭 齊，陶 涼，陳曉英，胡大清

華法林是目前臨床最常用的口服抗凝藥物，影響華法林用藥劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等。華法林國(guó)際藥理學(xué)聯(lián)盟(IWPC)的研究顯示，加入藥物基因組學(xué)的預(yù)測(cè)模型(包括基因型)比臨床預(yù)測(cè)模型(不包括基因型)準(zhǔn)確性提高了80%［1］。所以個(gè)體的遺傳特征對(duì)于華法林的劑量影響很大。目前研究發(fā)現(xiàn)與華法林藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)相關(guān)的基因達(dá)30多種，其中起主要作用的有2種，即細(xì)胞色素P450酶2C9基因(CYP2C9)和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1(VKORC1)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督局(FDA)在華法林用藥說明書中介紹了CYP2C9和VKORC1基因?qū)┝康挠绊懖⒔ㄗh在用藥之前做基因檢測(cè)［2］。本文旨在對(duì)不同華法林基因預(yù)測(cè)模型與華法林劑量的相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2012年3—8月在武漢亞洲心臟病醫(yī)院心臟外科行心臟瓣膜置換術(shù)患者108例。入選標(biāo)準(zhǔn)為:漢族、＞18歲、穩(wěn)定華法林抗凝至少3個(gè)月、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)控制在2.0～3.0。排除標(biāo)準(zhǔn):肝、腎及甲狀腺功能異常;服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等影響INR的藥物。所有入選對(duì)象均來自湖北省各地區(qū)就診的漢族居民，相互間無血緣關(guān)系及異族通婚史。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集:收集入選受試者靜脈血(枸櫞酸鈉抗凝)3 ml用于檢測(cè) INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同時(shí)觀察患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量及3種基因預(yù)測(cè)模型的華法林劑量。

1.2.2 基因檢測(cè)方法:從血液中提取患者DNA，擴(kuò)增目的片段，再進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。DNA提取采用TIANGE血液基因組提取試劑盒，測(cè)序儀為美國(guó)ABI 3500 Genetic Analyzer。

1.3 預(yù)測(cè)模型 從以下3個(gè)模型來分析基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性，一方面采用美國(guó)FDA給出的基因型判斷用藥范圍(模型1)，并與出院劑量比較分析;另一方面采用2009年國(guó)外發(fā)表的預(yù)測(cè)模型(模型2)［1］，模型的建立包含了4043個(gè)樣本，含1200個(gè)亞洲人。同時(shí)還比較了Huang等［2］建立的中國(guó)人用藥模型(模型3)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，Pearsonχ2檢驗(yàn)用于檢查基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

2 結(jié)果

2.1 基因型分布 108例患者血樣，來自武漢亞洲心臟病醫(yī)院，取樣時(shí)間為2012年3—8月，男50例，女58例。108例中CYP2C9*3雜合突變8例，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*2突變;VKORC1突變105例，其中純合突變95例，雜合突變10例。

2.2 不同基因型華法林穩(wěn)態(tài)劑量比較 108例中CYP2C9基因型檢測(cè)有100例為*1/*1型、8例為*1/*3型、未發(fā)現(xiàn)*2突變，華法林穩(wěn)態(tài)劑量分別為(2.68±1.05)、(1.55±0.78)mg/d，*1/*3型較*1/*1型華法林穩(wěn)態(tài)劑量小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);VKORC1基因型檢測(cè)有95例為AA型、10例為雜合子GA型、3例為純合子GG型，華法林穩(wěn)態(tài)劑量分別為(2.46±0.85)、(3.15±1.22)mg/d，AA型較GA型華法林穩(wěn)態(tài)劑量小，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);VKORC1基因型GG型僅3例，未做組間比較。

2.3 基因檢測(cè)顯著提高準(zhǔn)確率 根據(jù)基因型判斷的用藥量與實(shí)際用藥劑量相關(guān)性更大，準(zhǔn)確率更高。同時(shí)預(yù)測(cè)模型3是中國(guó)人用藥模型，其相關(guān)性略高于預(yù)測(cè)模型2，同時(shí)美國(guó)FDA根據(jù)基因型給出的用藥敏感性與實(shí)際用量是吻合的，說明基因型對(duì)于判斷用藥量非常有幫助。模型1預(yù)測(cè)劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量之間的相關(guān)性見圖1;模型2加基因型與不加基因型預(yù)測(cè)劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量之間的相關(guān)性見圖2、3;模型3預(yù)測(cè)劑量與穩(wěn)態(tài)劑量之間的相關(guān)性見圖4。

圖1 預(yù)測(cè)模型1預(yù)測(cè)劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)性FDA根據(jù)基因型給出的用藥范圍與出院劑量之間的比較，-1表示敏感性高;0表示敏感性一般;1表示敏感性低

圖2 預(yù)測(cè)模型2不加基因型預(yù)測(cè)劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)性(R2=6.4%，P=0.0127)

圖3 預(yù)測(cè)模型2包括基因型預(yù)測(cè)劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)性(R2=31.3%，P＜0.0001)

圖4 預(yù)測(cè)模型3預(yù)測(cè)劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)性(R2=33.6%，P＜0.0001)

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)在與華法林藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)相關(guān)的基因中起主要作用的有CYP2C9和VKORC1基因。細(xì)胞色素氧化酶P450是人類肝臟中由CYP超基因家族編碼的一種重要的藥物代謝酶系統(tǒng)。CYP2C9是CYP2C亞家族中的一種同工酶，約占肝微粒體中CYP總量的20%。CYP2C9基因存在很多多肽位點(diǎn)，其中研究較多的也最常見的是CYP2C9*2和CYP2C9*3。在中國(guó)人群中CYP2C9*3變異位點(diǎn)相對(duì)更多，主要是第359位的氨基酸由異亮氨酸變成亮氨酸。CYP2C9*2和CYP2C9*3突變基因攜帶者華法林需求量較野生型患者低，且CYP2C9*3攜帶者出血風(fēng)險(xiǎn)較高。VKORC1基因位于16號(hào)染色體，含3個(gè)外顯子，編碼163個(gè)氨基酸的18KDa內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白［3］。此蛋白質(zhì)為組成維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位之一，主導(dǎo)維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點(diǎn)。VKORC1基因啟動(dòng)子區(qū)-1639G＞A多態(tài)性與華法林臨床用藥劑量相關(guān)，AA型華法林需求量較GA型低。在中國(guó)患者中三者的頻率分別是79.7% 、17.6% 和 2.7%［4］。

目前臨床上華法林的給藥方案通常是首先給予一定標(biāo)準(zhǔn)劑量，然后臨床醫(yī)生根據(jù)每個(gè)患者INR的情況，調(diào)整劑量直至INR達(dá)到靶目標(biāo)。但是調(diào)整劑量周期較長(zhǎng)，且患者發(fā)生血栓或出血的可能性較高［5-6］。因此，國(guó)內(nèi)外越來越多的學(xué)者開始建立華法林用藥劑量預(yù)測(cè)模型。這些模型并不能取代INR的監(jiān)控作用，但是能夠極大的提高華法林用藥劑量的準(zhǔn)確性［7-9］。華法林IWPC聯(lián)合9個(gè)國(guó)家的21個(gè)研究小組，提供了用華法林治療的超過4000例患者(亞洲人種1200余例)的臨床和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，并據(jù)此建立了華法林劑量預(yù)測(cè)模型，該模型中納入了遺傳因素以及臨床因素。結(jié)果表明，對(duì)于需要低劑量(≤21 mg/周)或高劑量(≥49 mg/周)治療的患者，納入遺傳因素的華法林劑量模型預(yù)測(cè)結(jié)果顯著優(yōu)于臨床預(yù)測(cè)模型。IWPC發(fā)表的研究顯示，加入藥物基因組學(xué)的預(yù)測(cè)模型(包括基因型)比臨床預(yù)測(cè)模型(不包括基因型)準(zhǔn)確性提高了80%［1］。Gage等［10］基于1015例樣本(混合種族)也建立了劑量預(yù)測(cè)模型，其中納入了最全面的非遺傳因素。這兩個(gè)模型是目前最權(quán)威的華法林劑量預(yù)測(cè)模型。

IWPC的研究表明，亞洲人IWPC預(yù)測(cè)模型效果雖然比臨床預(yù)測(cè)模型優(yōu)越，但較白種人差。在這些模型中，目標(biāo)INR設(shè)定為2.0～3.0，而實(shí)際上中國(guó)人目標(biāo)INR有所不同，且中國(guó)人與華法林劑量相關(guān)的基因突變頻率與高加索人差異較大［11］。因此，很多學(xué)者開始建立針對(duì)中國(guó)人的華法林劑量預(yù)測(cè)模型。從中可以看出，遺傳因素的納入使得模型對(duì)華法林劑量個(gè)體差異的解釋達(dá)到了74.3%。值得一提的是，與針對(duì)高加索人的華法林劑量預(yù)測(cè)模型不同的是，華人劑量預(yù)測(cè)模型納入的大都是CYP2C9*3，而不是CYP2C9*2，這是因?yàn)镃YP2C9*2在中國(guó)人群中的分布頻率極低。

綜上所述，導(dǎo)致華法林用藥劑量個(gè)體差異分遺傳因素和非遺傳因素，其中遺傳因素占主要地位。近年來，隨著研究的深入，針對(duì)中國(guó)人華法林劑量構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型已越來越多，且納入了遺傳因素，可解釋40% ～74%的個(gè)體劑量差異［12-14］。本研究表明，預(yù)測(cè)模型3預(yù)測(cè)劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)性略高于預(yù)測(cè)模型2，可見根據(jù)中國(guó)人數(shù)據(jù)建立的模型更適合中國(guó)人。但是，目前基于中國(guó)人群構(gòu)建的劑量預(yù)測(cè)模型存在樣本量較小、納入的影響因素少以及缺少外部驗(yàn)證等弊端。因此，我們需要更大樣本量的研究，對(duì)已構(gòu)建的模型進(jìn)行驗(yàn)證或是構(gòu)建新模型。我們也需要納入更多的遺傳和非遺傳因素，以期提高對(duì)華法林劑量個(gè)體差異的解釋百分比。此外，目前構(gòu)建的模型多為穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測(cè)模型，而對(duì)起始劑量預(yù)測(cè)模型和穩(wěn)態(tài)劑量的精確模型研究較少［15-17］。因此，在以穩(wěn)態(tài)劑量預(yù)測(cè)模型為基礎(chǔ)的前提下，進(jìn)一步豐富起始劑量模型和穩(wěn)態(tài)劑量的精確模型的構(gòu)建，以期更好地應(yīng)用于臨床。

模型1:

模型2:

Square root of weekly warfarin dose=5.6044-0.2614×Age in decades+0.0087×Height in cm+0.0128×Weight in kg-0.8677×VKORC1^A/G-1.6974×VKORC1 A/A-0.4854×VKORC1 genotype unknown-0.5211×CYP2C9*1/*2-0.9357×CYP2C9*1/*3-1.0616×CYP2C9*2/*2-1.9206×CYP2C9*2/*3-2.3312×CYP2C9*3/*3-0.2188×CYP2C9 genotype unknown-0.1092×Asian race-0.2760×Black or African American-0.1032×Missing or Mixed race+1.1816×Enzyme inducer status-0.5503×Amiodarone status

Legend for use of algorithms:

· Age in decades=1 for 10-19，2 for 20-29，etc…

· VKORC1 G/A=1 if heterozygous for rs 9923231，otherwise zero

· VKORC1 A/A=1 if homozygous for A at rs 9923231，otherwise zero

· VKORC1 genotype unknow n=1 if rs 9923231 genotype missing or unknown，otherwise zero

· CYP2C9*1/*2=1 if CYP2C9 genotype is*1/*2，otherwise zero

· CYP2C9*1/*3=1 if CYP2C9 genotype is*1/*3，otherwise zero

· CYP2C9*2/*2=1 if homozygous for CYP2C9*2 allele，otherwise zero

· CYP2C9*2/*3=1 if CYP2C9 genotype is*2/*3，otherwise zero

· CYP2C9*3/*3=1 if homozygous for CYP2C9*3 allele，otherwise zero

· CYP2C9 genotype unknow n=1 if CYP2C9 genotype unknown，otherwise zero

· Asian Race=1 if self-reported race is Asian，otherwise zero

· Black/African America n=1 if self-reported race is Black or African American，otherwise zero

· Missing or Mixed race=1 if self-reported race is unspecified or mixed，otherwise zero

· Enzyme inducer status=1 if patient taking carbamazepine，phenytoin，rifampin，or rifampicin，otherwise zero

· Amiodarone status=1 if patient taking amiodarone，otherwise zero

模型3:

predicted warfarin dose(mg/day)=exp(0.727-0.007×age+0.384×BSA+0.403×VKORC1 6484 TC+0.554×VKORC1 6484 CC-0.482×CYP2C9*1/*3-1.583×CYP2C9*3/*3).Age is given in years，BSA calculated from height and weight is given in square meters，and VKORC1 6484 TC，VKORC1 6484 CC，CYP2C9*1/*3，and CYP2C9*3/*3 are coded as 1 if present and 0 if absent.

［1］ Klein T E，Altman R B，Eriksson N，et al.Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmacogenetic data［J］.N Engl JMed，2009，360(8):753-764.

［2］ Huang SW，Chen H S，Wang X Q，et al.Validation of VKORC1 and CYP2C9 genotypes on interindividual warfarin maintenance dose:a prospective study in Chinese patients［J］.Pharmacogenet Genomics，2009，19(3):226-234.

［3］ Ansell J，Hirsh J，Hylek E，et al.Pharmacology and management of the vitamin K antagonists:American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines(8th Edition)［J］.Chest，2008，133(6 Suppl):S160-S198.

［4］ Yuan H Y，Chen JJ，Lee M M，et al.A novel functional VKORC1promoter polymorphism is associated with interindividual and inter-ethnic differences in warfarin sensitivity［J］.Human molecular genetics，2005，14(13):1745-1751.

［5］ Chern H D，Ueng TH，F(xiàn)u Y P，et al.CYP2C9 polymorphism and warfarin sensitivity in Taiwan Chinese［J］.Clin Chim Acta，2006，367(1-2):108-113.

［6］ Loebstein R，Yonath H，Peleg D，et al.Interindividual variability in sensitivity to warfarin——Nature or nurture?［J］.Clin Pharmacol Ther，2001，70(2):159-164.

［7］ Cha P C，Mushiroda T，Takahashi A，et al.Genomewide association study identifies genetic determinants of warfarin responsiveness for Japanese［J］.Hum Mol Genet，2010，19(23):4735-4744.

［8］ Takeuchi F，McGinnis R，Bourgeois S，et al.A genomewide association study confirms VKORC1，CYP2C9，and CYP4F2 as principal genetic determinants of warfarin dose［J］.PLoSGenet，2009，5(3):e1000433.

［9］ Aquilante C L，Langaee T Y，Lopez L M，et al.Influence of coagulation factor，vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，and cytochrome P450 2C9 gene polymorphisms on warfarin dose requirements［J］.Clin Pharmacol Ther，2006，79(4):291-302.

［10］ Gage B F，Eby C，Johnson JA，et al.Use of pharmacogenetic and clinical factors to predict the therapeutic dose of warfarin［J］.Clin Pharmacol Ther，2008，84(3):326-331.

［11］ Consortiumi W P.Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmacogenetic data［J］.The New England journal of medicine，2009，360(8):753.

［12］ Yang L，Ge W，Yu F，et al.Impact of VKORC1 gene polymorphism on interindividual and interethnic warfarin dosage requirement-a systematic review and meta analysis［J］.Thromb Res，2010，125(4):e159-e166.

［13］ Liang R，Li L，Li C，et al.Impact of CYP2C9*3，VKORC1-1639，CYP4F2rs2108622 genetic polymorphism and clinical factors on warfarin maintenance dose in Han-Chinese patients［J］.J Thromb Thrombolysis，2012，34(1):120-125.

［14］ Limdi N A，Wadelius M，Cavallari L，et al.Warfarin pharmacogenetics:a single VKORC1 polymorphism is predictive of dose across 3 racial groups［J］.Blood，2010，115(18):3827-3834.

［15］ Wadelius M，Chen L Y，Lindh J D，et al.The largest prospective warfarin-treated cohort supports genetic forecasting［J］.Blood，2009，113(4):784-792.

［16］高菲，宋洪濤，曾志勇，等.CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性對(duì)心臟瓣膜置換術(shù)后華法林維持劑量和抗凝效果的影響［J］.中國(guó)藥房，2010，21(22):2053-2057.

［17］Higashi M K，Veenstra D L，Kondo L M，et al.Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy［J］.JAMA，2002，287(13):1690-1698.