鯊魚再生肝組織差異表達(dá)基因的篩選

朱愛萍，吳小華，于曉惠，張 敏，常秀峰，徐清華，焦保權(quán)，張 潔

肝臟是動物體內(nèi)最大的器官，具有十分復(fù)雜的功能，包括代謝、合成和儲存功能及調(diào)節(jié)和維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定等。肝臟再生能力極其強(qiáng)大，肝細(xì)胞受損24 h后開始增殖，這期間是由G0期細(xì)胞向G1/S轉(zhuǎn)變，肝部分切除48 h后小血管開始形成，薄壁組織、肝小葉逐漸形成，肝臟逐漸長大并恢復(fù)功能［1］。肝部分切除模型［2］的建立推動了肝臟再生機(jī)制的研究工作。大量研究結(jié)果顯示，肝臟的再生過程受到多種細(xì)胞因子和生長因子的調(diào)控，包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-A)［3］、白介素(IL)-6［4］、肝細(xì)胞生長因子(HGF)［5］、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)［6］、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)［7］、表皮生長因子(EGF)［8］及肝刺激物質(zhì)(HSS)［9］等，這些細(xì)胞因子和生長因子在動物體內(nèi)形成了一個復(fù)雜的信號傳導(dǎo)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，保證機(jī)體組織和器官的正常重建并維持其正常生長。鯊魚的肝臟約占內(nèi)臟重量的75%，許多研究者已從鯊魚體內(nèi)分離克隆了多種與肝再生和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的刺激因子［10-16］。本研究通過條紋斑竹鯊肝臟2/3部分切除模型建立獲得正常和24 h再生肝組織，利用差別顯示逆轉(zhuǎn)錄 －聚合酶鏈反應(yīng)(differential display reverse transcription polymerase chain reaction，DDRT-PCR)技術(shù)進(jìn)行肝再生過程中差異表達(dá)基因的篩選，為進(jìn)一步研究肝再生過程中差異表達(dá)的相關(guān)功能基因奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)肝病藥物作用新靶點(diǎn)及肝再生機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 條紋斑竹鯊魚(280 g)，編號4，為中科院南海海洋所海洋生物學(xué)實驗室饋贈;無菌注射器、吸收性明膠海綿、非吸收性外科縫線、醫(yī)用縫合針、手術(shù)剪、手術(shù)刀均購自杭州華東醫(yī)藥器材公司。

1.2 試劑 麻醉劑:2%水合氯醛溶液，按每公斤鯊魚體重注射15 ml即300 mg水合氯醛配制。大腸桿菌E．coli TG1菌株由本實驗室保存;Taq DNA聚合酶及相應(yīng)PCR反應(yīng)試劑購自上海萊楓生物公司;AxyPreTMDNA Gel Extraction Kit購自 AXYGEN公司;pMD?18-T Simple Vector購自 Takara公司;Trizol、Reverse Transcription Reaction(First-Strand cDNA Synthesis)試劑盒購自Promega公司。

1.3 肝臟2/3部分切除模型建立 將4 ml麻醉劑注射鯊魚腹部皮下，2 ～3 min 補(bǔ)加 1 ml［17］，待鯊魚失去運(yùn)動能力后開始手術(shù)。沿腹部中線剪開鯊魚皮膚，切開肌層，切除肝臟右葉2/3部分為正常肝組織，將其迅速放入液氮中冷凍后移至－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ趧?chuàng)傷處滴加鏈霉素(0．1 g)和青霉素(10萬單位)，縫合肌層和皮膚傷口，將鯊魚繼續(xù)飼養(yǎng)24 h后拆除傷口縫線取剩余肝組織的切除邊緣部分為再生肝組織［12］。

1.4 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法分別提取正常及再生24 h肝組織的total RNA，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計檢測其純度。采用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(First-Strand cDNA Synthesis Reverse Transcription Reaction)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件:1250 ng total RNA，RT primer/olig(dT)15 2．5 μl/1．25 μl，70℃ 10 min，迅速冰浴2～5 min;后依次加入MgCl2(25 mmol/L)5．0 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)2．5 μl，10 × RT buffer 2．5 μl，RNase inhibitor 0．625 μl，AMV Reverse Transcriptase 0．625 μl，總反應(yīng)體系為 25 μl，42℃50 min，95℃ 5 min，立即置于冰上冷卻，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 差異顯示PCR 采用萊楓公司2×Taq PCR Master Mix試劑，將2條錨定引物和20條隨機(jī)引物配對形成40種組合對正常和再生24 h肝組織cDNA進(jìn)行PCR，2種組織共80個PCR反應(yīng)，引物序列見表1。每個反應(yīng)體系如下:2×Taq PCR Master Mix 5 μl，錨定引物(50 μmol/L)0．1 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0．5 μl，cDNA 溶液 0．5 μl，ddH2O 3．9 μl，總體積 10 μl。反應(yīng)程序:95℃5 min;95℃ 30 s，40℃ 2 min，72℃ 1 min，40 個循環(huán);72℃ 10 min。參照《分子克隆》方法配制5%非變性聚丙烯酰胺凝膠，取PCR產(chǎn)物8μl上樣，電泳100 V，至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部停止;銀染顯色，直至條帶清晰，區(qū)分差異電泳條帶。

表1 鯊魚再生肝組織差別顯示逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)引物

1.6 差異條帶回收及二次擴(kuò)增 采用壓碎與浸泡法進(jìn)行目的片段回收，具體操作如下:將差異條帶切下壓碎后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入150μl 1×TBE，37℃搖床溫浴過夜;離心收集上清，再向原管中加入50μl 1×TBE，37℃搖床溫浴 15 min，離心合并上清;將上清用無水乙醇沉淀過夜，75%乙醇洗滌沉淀，產(chǎn)物溶于10μl ddH2O，－20℃保存?zhèn)溆?以回收的差異基因為模板，以相應(yīng)錨定引物和相應(yīng)下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系和程序同前;1．2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，核對條帶大小并割膠回收目的差異條帶。

1.7 目的片段克隆及序列分析 將回收的差異條帶與載體連接，反應(yīng)條件:Solution I 5μl，目的片段2 μl，pMD?18-T Simple Vector 1 μl，ddH2O 2 μl，總計10μl，16℃連接過夜。將5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coliTG1感受態(tài)細(xì)胞，利用載體通用引物菌落PCR鑒定陽性克隆，反應(yīng)體系:2×Taq PCR Master Mix 5 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0．4 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0．4 μl，總計10 μl;反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃1 min，30個循環(huán);72℃ 10 min。序列測定采用正向測序，由上海桑尼公司完成。然后將所得目的差異基因序列與國家生物技術(shù)信息中心已表達(dá)序列標(biāo)志(NCBI EST)庫進(jìn)行Blast比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取 Total RNA用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示5s RNA條帶較暗，28s RNA/18s RNA的比值約為2∶1，可見提取的RNA完整性較高(圖1);用紫外分光光度計檢測總RNA的 OD值，經(jīng)計算 OD260/OD280的比值為 1．8～2．0，提取的RNA可用于下一步實驗。

圖1 RNA 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測1．正常肝組織;2．再生肝組織

2.2 PCR擴(kuò)增目的片段 40對PCR產(chǎn)物經(jīng)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯示，條帶清晰可辨。圖2為6對PCR產(chǎn)物銀染顯示結(jié)果，其中有2條差異比較明顯的條帶，表明這2條差異條帶在肝再生過程表達(dá)增強(qiáng)。綜合分析，共獲得了10條差異較明顯的序列片段。

2.3 目的片段條帶瓊脂糖凝膠電泳檢測 將選取的10條差異表達(dá)的片段用原引物對進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增鑒定，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳核對條帶，顯示目的差異條帶大小與預(yù)期值相符，見圖3。

2.4 差異基因序列分析 10條差異序列通過Blast檢測，其中3條與NCBI EST庫的序列有較高相似性，為已知序列，其他7條序列與已報道基因無同源性，為新發(fā)現(xiàn)的功能序列。RF1-6l與33條灰斑竹鯊cDNA克隆序列同源性達(dá)到100%，NF2-2與2條貓鯊胚胎 cDNA文庫的序列同源性為80%以上，RF2-6s與狗鯊干細(xì)胞系SAE的序列同源性為88%。NF2-2和RF2-6s的比對結(jié)果見圖4。10條差異序列的比對及差異表達(dá)情況見表2，其中有8條大小為100～500 bp，5條序列在肝再生過程表達(dá)上調(diào)，另5條表達(dá)下調(diào)。

圖2 鯊魚再生肝組織差別顯示逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果M．100bp DNA ladder marker;1 ～12．分別為 NF1-1，RF1-1，NF1-2，RF1-2，NF1-3，RF1-3，NF1-4，RF1-4，NF1-5，RF1-5，NF1-6，RF1-6;N表示正常肝組織，R表示再生肝組織，F(xiàn)1表示錨定引物1，最后的數(shù)字編號表示隨機(jī)引物編號

圖3 鯊魚再生肝組織差異表達(dá)的目的片段瓊脂糖凝膠電泳檢測M．DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1～10．分別為條帶 RF1-6l 534 bp，NF1-19 326 bp，RF1-6s 258 bp，RF2-6s 244 bp，RF2-6l 278 bp，NF1-7 236 bp，RF2-8 283 bp，NF2-19 77 bp，NF1-9 208 bp，NF2-2 173 bp，N表示正常肝組織，R表示再生肝組織，F(xiàn)1表示錨定引物1，F(xiàn)2表示錨定引物2，最后的數(shù)字編號表示隨機(jī)引物編號

3 討論

mRNA差異顯示PCR技術(shù)(differential display PCR，DD-PCR)是由Liang等在1992年建立的一種尋找差異表達(dá)基因的方法。真核生物基因的mRNA 3'端多數(shù)都帶有一段多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)，其有12種組合:5'-NMAAA…AA-3'，其中 N 代表 A、G、C、T 任意一種堿基，M代表G、C、T任意一種堿基。根據(jù)此序列特征，按堿基配對的原則，人工合成Poly(dT)引物時在其3'末端加上兩個錨定堿基:5'-TTT…TTTMN-3'(M、N同上)，此引物可將 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(又稱為第1鏈)，用此引物錨定cDNA第2條鏈3'端，用5'端隨機(jī)引物與cDNA第1條鏈互補(bǔ)進(jìn)行PCR，隨機(jī)擴(kuò)增cDNA片段，將PCR產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，即可顯示不同的條帶位置，比較不同組間的顯示結(jié)果，將差異條帶回收再擴(kuò)增，通過雜交驗證、克隆測序等，進(jìn)一步分析其結(jié)構(gòu)與功能［18］。DDRT-PCR技術(shù)經(jīng)過多年的推廣和不斷完善，現(xiàn)已非常成熟，所需RNA量少，操作簡便，靈敏度高，實驗周期短，能同時比較多種樣品，避免了同位素的污染，可以直接從凝膠上切除肉眼可觀察到的條帶，并且能在任何配備了標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)試劑和儀器的實驗室進(jìn)行，所以目前大多數(shù)研究人員采用DDRT-PCR技術(shù)研究功能基因的篩選與克?。?9-21］，但DDRT-PCR操作中有兩個關(guān)鍵問題需要注意:一是如何得到穩(wěn)定、豐富和清晰的差異條帶，二是如何有效地從差異片段中篩選出真正差異表達(dá)的片段。

圖4 NF2-2和RF2-6s序列與已表達(dá)序列標(biāo)志庫比對結(jié)果A．NF2-2 Blast;B．RF2-6s Blast

表2 鯊魚再生肝組織表達(dá)差異序列分析

本實驗采用DDRT-PCR技術(shù)進(jìn)行鯊魚肝臟再生過程中差異表達(dá)基因的篩選，應(yīng)用垂直電泳槽非變性聚丙烯酰胺膠電泳、實驗室常規(guī)試劑配制的銀染溶液，能夠取得良好的差異顯示效果，由于所用試劑及配制銀染溶液的水質(zhì)差別，具體操作中應(yīng)根據(jù)PCR產(chǎn)物的效率對分離上樣量及銀染時間做適當(dāng)調(diào)整，才能得到清晰帶型。本實驗采用2條錨定引物、20條10堿基隨機(jī)引物，樣本為正常和再生24 h條紋斑竹鯊肝組織，獲得10條差異片段，其中3條與NCBI EST庫的序列有較高相似性，另外7條為新發(fā)現(xiàn)的功能序列片段;5條序列在肝再生過程中表達(dá)上調(diào)，另5條表達(dá)下調(diào)，這一結(jié)果為進(jìn)一步研究肝再生相關(guān)功能新基因及肝再生機(jī)制提供了有效信息。

［1］ Zimmermann A．Regulation of liver regeneration［J］．Nephrol Dial Transplant，2004，19(Suppl 4):6-10．

［2］ Maros T，Seres Sturm L，Lakatos O，et al．Data regarding the restorative effects of the partial removal of the liver in advanced stages of toxic cirrhosis［J］．Morphol Embryol(Bucur)，1975，21(3):213-217．

［3］ Bonninghoff R，Schwenke K，Keese M，et al．Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice［J］．Can J Surg，2012，55(6):389-393．

［4］ Yang H，Zhu Y L，Liu Q N，et al．The impact of ischemic postconditioning on the tumor necrosis factor-alpha/IL-6/signal transducers and activators of transcription-3 signal pathway of liver regeneration［J］．Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2012，50(10):909-913．

［5］ Lehwald N，Duhme C，Wildner M，et al．HGF and SDF-1-mediated mobilization of CD133+BMSCfor hepatic re-generation following extensive liver resection［J］.Liver Int，2014，34(1):89-101.

［6］ Riehle K J，Haque J，McMahan R S，et al.Sustained Glutathione Deficiency Interferes with the Liver Response to TNF-alpha and Liver Regeneration after Partial Hepatectomy in Mice［J］.J Liver Disease Transplant，2013，1(2):1000105

［7］ Nejak Bowen K N，Orr A V，Bowen WCJr，et al.Gliotoxin-induced changes in rat liver regeneration after partial hepatectomy［J］.Liver Int，2013，33(7):1044-1055.

［8］ Liu S，Wierod L，Skarpen E，et al.EGF activates autocrine TGFalpha to induce prolonged egf receptor signaling and hepatocyte proliferation［J］.Cell Physiol Biochem，2013，32(3):511-522.

［9］ Jiang Y，Zhao M，An W.Increased hepatic apoptosis in high-fat diet-induced NASH in rats may be associated with downregulation of hepatic stimulator substance［J］.J Mol Med(Berl)，2011，89(12):1207-1217.

［10］Xie Z，Chen G，Huang Y，et al.Study on immune activity of shark liver extracts［J］.Zhongguo Sheng Hua Yao Wu Za Zhi，1999，20(3):126.

［11］ Huang F J，Wu WT.Purification and characterization of a new peptides(S-8300)from shark liver［J］.JFood Biochemistry，2010，34(5):962-970.

［12］Zhou F，Wang Y，Guan Y，et al.Construction and characterization of a cDNA library from shark regenerated hepatic tissue［J］.Fish Shellfish Immunol，2011，30(4-5):1170-1177.

［13］ Shimizu T，Togo S，Kumamoto T，et al.Gene expression during liver regeneration after partial hepatectomy in mice lacking type 1 tumor necrosis factor receptor［J］.J Surgical Research，2009，152(2):178-188.

［14］Wang Y，Chen B，Ke Y，et al.Molecular characterization and expression analysis of the complement factor I(CpFI)in the whitespotted bamboo shark(Chiloscyllium plagiosum)［J］.Fish Shellfish Immunol，2014，40(2):414-423.

［15］Wang Y，Zhang M，Wang C，et al.Molecular cloning of the alpha subunit of complement component C8(CpC8alpha)of whitespotted bamboo shark(Chiloscyllium plagiosum)［J］.Fish Shellfish Immunol，2013，35(6):1993-2000.

［16］Shin D H，Webb B M，Nakao M，et al.Characterization of shark complement factor I gene(s):genomic analysis of a novel shark-specific sequence［J］.Mol Immunol，2009，46(11-12):2299-2308.

［17］梁婕，畢穗磊.影響醫(yī)學(xué)實驗動物麻醉的幾個因素［J］.中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2011，8(8 下):19.

［18］ Liang P，Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction［J］.Science，1992，257(5072):967-971.

［19］于建春，陸明霞，于濤，等.用DDRT-PCR技術(shù)分析快速老化膜型鼠衰老相關(guān)基因的差異表達(dá)及針刺的作用［J］.中醫(yī)雜志，2002，43(6):431-432.

［20］張春，劉軍，蔣宏傳，等.乳腺癌相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選及分析［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，34(1):1-5.

［21］李佩國，張艷英，賈青輝，等.雞柔嫩艾美耳球蟲石家莊多重耐藥蟲株差異基因的表達(dá)［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33(9):1373-1377.