膜莢黃芪內生真菌的分離與鑒定1)

龔 賀 張雷鳴 任偉超 張艷賀 劉秀波

(黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱，150040)

孔祥軍 佟春香 馬 偉

(齊齊哈爾醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院) (齊齊哈爾中醫(yī)醫(yī)院) (黑龍江中醫(yī)藥大學)

植物內生菌是指生活在健康植物組織和器官內部的真菌或細菌，是與宿主植物在長期共同進化過程中衍生的一類微生物［1］。據內生菌與宿主植物的親和關系，可將其分為專一性和非專一性。內生菌在寄主的科、種以及組織水平上都存在專一性［2－3］。而某些植物內生菌自身或其次生代謝產物中含有和宿主植物相同或相近的活性成分［4－6］，在一定程度上為解決臨床藥物來源以及農作物的生物防治等方面提供了新的思路［7］。藥用植物內生真菌的研究雖然處于起步階段，但其實用價值和社會價值已經受到越來越多的重視，從藥用植物內生真菌次生代謝產物中篩選有效的活性物質或新型化合物以研究新的藥物，將在很大程度上豐富人類醫(yī)藥寶庫，解決自然資源不足，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展［8－9］。

1 研究方法

1.1 分離純化培養(yǎng)基

PDA(A):PDA 粉末與蒸餾水配制而成。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(B):牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、水lL、pH =7.4 ～7.6。LB 固體培養(yǎng)基(C):胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g。高氏I 號培養(yǎng)基(D):可溶性淀粉20.00 g、KNO31.00 g、NaCl 0.50 g、K2HPO40.50 g、MgSO40.50 g、FeSO40.01 g、蒸餾水1 L、瓊脂20.00 g、pH=7.4 ～7.6。孟加拉紅培養(yǎng)基:蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20.0 g、1/3 000 孟加拉紅溶液0.1 L、氯霉素0.1 g、蒸餾水1 L。

1.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH 自然條件。

1.3 內生真菌的分離

采用組織分離法，植物材料取自哈爾濱呼蘭區(qū)7月份膜莢黃芪2年生植株。選擇無病斑的新鮮的黃芪根、葉部分，用無菌水沖洗干凈，用解剖刀把根切成3 cm 的小段保持切口整齊，葉片切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的方塊型小片，在干凈濾紙上吸干水晾干。在無菌條件下，將切好的材料用自來水沖洗干凈，75%的乙醇漂洗5 min，無菌水沖洗3 次(每次2 min)。將處理過的根段和葉在無菌條件下切去兩端，根切成小片，隨即將小片分別種植于PDA、LB、高氏、牛肉膏培養(yǎng)基平板上，每種培養(yǎng)基設3 個平行皿，每皿4 片，置于培養(yǎng)箱中28 ℃倒置培養(yǎng)3 ～7 d。

葉片處理同根處理?？瞻讓φ兆? 種處理:一是空白培養(yǎng)基不接組織塊;二是將培養(yǎng)基內接入消毒時要使用的同等條件下滅菌的無菌水少許;三是在消毒的操作過程中，將培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿開放暴露于超凈臺內。驗證培養(yǎng)基、無菌水和超凈臺滅菌是否徹底。觀察各組織塊在4 種培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，采用無菌接種針在組織塊周圍將剛長出的菌絲邊緣部分移接到新鮮培養(yǎng)基上劃線，隨時觀察培養(yǎng)基變化，挑少許菌絲到平板上和其他3 種培養(yǎng)基上反復進行經典過程純化。

為檢查材料表面消毒是否徹底做如下對照試驗:直接接組織塊，將與上述同樣處理過的根段和葉不做分割，直接種植在4 種培養(yǎng)基平皿上;在相同條件下培養(yǎng)，接洗滌水，將最后一次清洗消毒組織塊的無菌水涂于4 種培養(yǎng)基表面，置于同等條件下培養(yǎng);將與上述同樣處理過的根段和葉直接在4 種培養(yǎng)基表面做印記。

隨時觀察試驗培養(yǎng)皿及對照皿出菌情況及組織片變化，待根組織邊緣和葉邊緣長出菌后，挑取菌絲或菌體，經平板劃線法反復分離、純化，培養(yǎng)觀察菌落的形態(tài)，比較4 種培養(yǎng)基對黃芪內生真菌的分離情況，并轉入相應斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，放入冰箱中4 ℃短期保藏，備用。

1.4 表面消毒的效果檢測

1.4.1 無菌水檢驗法

將表面消毒的樣本在滅過菌的5 mL 無菌水中震蕩，取出樣本，取1 mL 菌懸液涂布在PDA 培養(yǎng)基表面，25 ℃下恒溫培養(yǎng)1 周，觀察記錄是否有真菌長出。

1.4.2 組織塊印跡法

植物樣本經過上述表面消毒流程后，葉片選取整片葉片、根選2 cm 的小段，直接接到PDA 固體培養(yǎng)基上，25 ℃下恒溫培養(yǎng)1 周，觀察記錄是否有真菌生長。再經過改進，上述流程下滅過菌的組織塊在PDA 培養(yǎng)基上輕輕印記，再取出組織塊，將培養(yǎng)基在25 ℃下恒溫培養(yǎng)1 周，并觀察是否有菌落產生。

1.5 內生真菌的形態(tài)鑒定

根據根葉在4 種培養(yǎng)基上的生長狀況，顯微鏡觀測記錄，菌株形態(tài)參考《真菌鑒定手冊》。制成水載片，用光學顯微鏡定期觀察產孢內生真菌菌絲結構、菌落形態(tài)特征等指標鑒定到屬。

手工挑取真菌單孢子顯微操作:選用2 臺普通生物顯微鏡，2 支自制玻璃挑孢針。每次挑取不同內生真菌時需重新使用潔凈的挑孢針，在超凈工作臺上操作。取出待分離的平板培養(yǎng)皿真菌材料，在顯微鏡的物鏡下找到平板中菌落邊緣分散的孢子，將針尖輕輕向視野中間的菌落邊緣單個孢子靠碰，有時一次碰孢子即可粘附到針尖上，更多情形時經過多次靠碰，才能粘附到針尖上。當視野中要碰取的單個孢子消失了，說明已沾到針尖上，此時輕輕抬起針頭，并移離顯微鏡下，將孢子轉移到水載玻片上，加蓋蓋玻片，將載玻片移到顯微鏡觀察孢子的形態(tài)進行鑒定。

2 結果與分析

從膜莢黃芪根、葉各培養(yǎng)基上共分離得到65 株內生真菌，結合菌落形態(tài)和顯微結構特征，最終將膜莢黃芪內生真菌做出了明確的分類。在PDA 培養(yǎng)基上分離得到根中內生真菌55 株(37 株鐮孢屬，10株曲霉屬、8 株青霉屬)。在LB 培養(yǎng)基上得到3 株鐮孢屬根部內生真菌。在高氏培養(yǎng)基上得到1 株鐮孢屬根內生真菌。在PDA 培養(yǎng)基上得到6 株鐮孢屬葉片內生真菌。瘤坐孢科鐮孢屬(Fusarium)47株，菌絲在培養(yǎng)基中擴展呈棉絮狀，常帶有粉紅色、紫紅色，菌株菌絲為純白色絨毛狀表面部分突起，菌絲向外生長，紋飾疏松，邊緣整齊，質地絨毛狀、粉粒狀、棉絮狀，分泌色素有紫褐色、紫紅色、或無色素。大型孢子多細胞，鐮刀形，微彎或兩端尖而小型分生孢子單胞，卵圓形或長圓形，單個孢子有3 個細胞，長圓形或略微彎。從梗孢科青霉屬(Penicillium)10株，菌落綠色、黃綠色、青綠色或淡灰黃色紋飾致密，邊緣整齊、革質狀質地無滲出物。分生孢子梗從菌絲上單個的發(fā)生或不常成束，在頂部附近分支，對稱或不對稱，頂層為小梗，由小梗再生成分生孢子，單個孢子球形、卵圓形。從梗孢科曲霉屬(Aspergillus)8 株，菌落由黃色再變成黃綠色，平坦或放射狀溝紋，反面無色或帶褐色質地絮狀無滲出物紋飾致密。在幼小而獲利旺盛時，菌絲體產生大量的分生孢子梗，分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，一般呈球形。頂囊表面長滿1 層或2 層輻射狀小梗。最上層小梗瓶狀，頂端著生成串的球形分生孢子。孢子多呈綠、黃、褐色。分生孢子梗頂端膨大，分生孢子成串。孢子梗大部無橫隔，光滑、粗糙或有痣點，常在頂部膨大形成棍棒形、橢圓形、半球形或球形的頂囊?？瞻着囵B(yǎng)基、接滅菌水的培養(yǎng)基、印跡法周圍均未有真菌產生，而消毒后切去兩端的組織塊周圍在第5 天有白色菌落長出，此內生真菌明顯從組織內部溢出(圖1)。

圖1 青霉屬、曲霉屬、鐮孢屬及其分生孢子

3 結論與討論

對照平板培養(yǎng)約5 d 均沒有觀察到菌落長出，表明表面消毒徹底。從黃芪根、葉片中分離得到的內生菌共65 株，經顯微形態(tài)觀察、鑒定為半知菌門鐮孢屬、曲霉屬、青霉屬，其中鐮孢屬為優(yōu)勢菌群，且大都無孢子產生。

黃芪內生真菌培養(yǎng)到第5 天，菌落直徑大多可達到9 cm，培養(yǎng)至第8 天時植物內生菌的菌落在PDA上明顯比在牛肉膏、高氏、LB 培養(yǎng)基上菌落大且菌落生長良好。因此，將PDA 培養(yǎng)基作為植物內生真菌固體形態(tài)觀察培養(yǎng)可行，觀察效果良好。不同部位內生真菌差異有待研究，優(yōu)勢種群主要集中在根中分離得到的內生真菌，大多為鐮孢屬內生真菌。

挑孢針的制作及優(yōu)點:2 支玻璃細管在酒精燈上燒紅尖端部，加熱后的玻璃細管前端融化部位接觸粘連后迅速抽拉，拉直并拉成細針尖狀，即得到所需的挑孢針。分離得到單孢子可靠，單孢子分離效率高，實用性好，可分離各種基質上的孢子，可分離不同種類和大小的孢子，可進行特殊需要的操作，比如分離單個孢子囊內的孢子，脫除孢子表面的細菌，工具簡單，可在一般實驗環(huán)境下進行，用少量的材料即可實施單孢分離。大多數(shù)分離出的內生真菌孢子大于5 μm 在10 倍物鏡下清楚可見，可以方便地進行單孢子分離。其中一些內生真菌的孢子微小且顏色較淺時，一般需要40 倍物鏡才能清楚檢視，對于不產孢的菌株，通過適當光照或用挑孢針在菌落表面反復刮擦刺激產孢。

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