植物病原真菌拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及活性成分分析1)

任建軍 師光祿 高美娟 王有年

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (北京農(nóng)學(xué)院) (農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室(北京農(nóng)學(xué)院))

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，每年因植物病害造成的減產(chǎn)量為總產(chǎn)量的10% ～15%［1］。目前，植物病害的防治方法主要是利用化學(xué)農(nóng)藥防治。隨著人們對(duì)環(huán)保和健康關(guān)注程度的提高，使用化學(xué)合成農(nóng)藥帶來(lái)的毒性、污染、殘留、生態(tài)破壞等問(wèn)題日益受到關(guān)注。因此，以高效、低毒、低殘留的環(huán)境友好型生物農(nóng)藥逐步替代傳統(tǒng)的高毒化學(xué)農(nóng)藥是農(nóng)藥發(fā)展的一種必然趨勢(shì)［2］，而安全性高、綠色環(huán)保的微生物農(nóng)藥則成為一種新興的替代方法［3］。近年來(lái)，利用土壤中有益微生物控制病害的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道［4－5］，其中拮抗細(xì)菌在植物病害防治中起到非常重要的作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)在植物根圍區(qū)系中存在大量微生物，許多微生物及其代謝產(chǎn)物能夠抑制植物病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育，因此從土壤中篩選植物病原菌的拮抗菌反施于土壤，可人為增加有益微生物類(lèi)群，限制有害微生物生長(zhǎng)，減少化學(xué)農(nóng)藥可能帶來(lái)的環(huán)境污染，又解決了抗病品種篩選周期長(zhǎng)、抗病單一的缺點(diǎn)［7－11］。獲得高效拮抗菌株是進(jìn)行生物防治研究的基礎(chǔ)。本研究以篩選廣譜拮抗菌株為目標(biāo)，以園藝生產(chǎn)中常見(jiàn)的10 種植物病菌為指示菌，對(duì)采自北京市昌平區(qū)和懷柔區(qū)的農(nóng)田土樣中分離的103 株細(xì)菌菌株進(jìn)行抑菌篩選。對(duì)拮抗效果好的細(xì)菌進(jìn)行生理生化測(cè)定及16 S rRNA 序列分析，以鑒定細(xì)菌種類(lèi)，并對(duì)活性菌株產(chǎn)生的抑菌蛋白進(jìn)行提取及生物測(cè)定。旨在為植物病原菌的新型生防殺菌劑的研究和開(kāi)發(fā)提供新的生防材料，為利用拮抗菌防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中各種病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生防細(xì)菌:2010年7月于北京市昌平區(qū)南口鎮(zhèn)和懷柔區(qū)橋梓鎮(zhèn)農(nóng)田采集的土樣中分離獲得。放入冰箱中4 ℃保存。

供試病原菌:棉花紅腐病菌(Fusarium moniliforme Sheld.)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum gloesporioides (Syd.)Butl.)、茄子黃萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)、馬鈴薯干腐病菌(Fusarium solani(Mart.)Sacc.)、玉米青枯病菌(Ralstonia solanacearum Schw.)、辣椒根腐病菌(Fusarium vasinfectum Atk.)、黃瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis (Berk.et Curt.)Rostov.)、李干腐病菌(Poloporus hirsutus Sacc.)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa(Aderh.et Ruhl.)Honey)，以上菌株由北京農(nóng)學(xué)院都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 土壤細(xì)菌的分離與純化

稱(chēng)取10 g 土樣，在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌條件下置于含有90 mL 磷酸緩沖液的三角瓶中，封口，用搖床160 r/min 振蕩30 min，靜置5 min，然后吸取上清液稀釋至10－2～10－8倍，取10－5至10－8倍的稀釋液0.1 mL 均勻涂滿(mǎn)LB 培養(yǎng)基平板。37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行觀(guān)察，挑取不同形態(tài)單菌落，分離純化后將其編號(hào)為RN－01，RN－01，RN－03……并于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆茫?2］。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

采用傳統(tǒng)的對(duì)峙培養(yǎng)法初篩，將實(shí)驗(yàn)室冰箱中保存的病原菌從斜面轉(zhuǎn)接到PDA 平板中，27 ℃培養(yǎng)3 ～5 d，待病原菌長(zhǎng)滿(mǎn)平板后，用直徑為0.4 cm 的打孔器在病原菌邊緣打取菌碟備用。然后在PDA 培養(yǎng)基平板中央接入病原真菌菌餅，在距離菌餅左右2.5 cm 處，用沾有細(xì)菌的接菌環(huán)劃兩條平行線(xiàn)，27℃培養(yǎng)，3 ～5 d 后測(cè)量細(xì)菌與病原真菌之間抑菌帶的寬度，重復(fù)上述歩驟3 次，對(duì)所分離細(xì)菌的拮抗性進(jìn)行初步篩選。根據(jù)拮抗細(xì)菌與病原真菌之間的拮抗直徑采用分級(jí)方法統(tǒng)計(jì)拮抗效果:1 級(jí)，0 ～3 mm;2 級(jí)，3 ～6 mm;3 級(jí)，＞6 mm。

1.2.3 細(xì)菌發(fā)酵后無(wú)菌濾液的抗菌譜活性測(cè)定

將初選的拮抗作用強(qiáng)的菌株轉(zhuǎn)接至LB 培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)12 h 后，接種至LB 液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，在37 ℃、180 r/min 條件下，振蕩培養(yǎng)24 h，然后在無(wú)菌條件下將菌體發(fā)酵液10 000 r/min離心15 min，取上清液在0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾器中過(guò)濾，即得到無(wú)菌濾液。然后將濾液與LB 培養(yǎng)基以體積比1∶ 9 混合。以不加濾液的培養(yǎng)基為對(duì)照，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定其抑菌譜。按公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.4 活性菌株的鑒定

形態(tài)特征的觀(guān)察及生理生化測(cè)試:將活性菌株分別在LB 上劃線(xiàn)和混入LB 培養(yǎng)基，于37 ℃下培養(yǎng)12 h 后觀(guān)察單菌落形態(tài)特征，并將斜面培養(yǎng)24 h的待測(cè)菌接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2 d，觀(guān)察培養(yǎng)液的變化。對(duì)抑菌效果穩(wěn)定的菌株進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察及革蘭氏染色和芽孢染色初步鑒定其種屬。參照文獻(xiàn)［13］、［14］對(duì)活性菌株進(jìn)行糖醇類(lèi)發(fā)酵－產(chǎn)酸、運(yùn)動(dòng)性、耐鹽性和需鹽性、硝酸鹽還原反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、乙酞甲基甲醇試驗(yàn)(V－ P 試驗(yàn))、淀粉水解反應(yīng)、檸檬酸鹽利用、明膠液化反應(yīng)測(cè)定。

分子生物學(xué)(16 S rRNA)鑒定:采用CTAB 法提取細(xì)菌基因組DNA［15］，根據(jù)原核生物16 S rDNA 保守序列，采用上海英駿生物科技有限公司測(cè)定細(xì)菌16 S rRNA 的通用引物對(duì)DNA 模版進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，F(xiàn)(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')(Invitrogen);R(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3')(Invitrogen)。擴(kuò)增反應(yīng)在25 μL 的16 S rRNA 擴(kuò)增反應(yīng)體系中進(jìn)行。95 ℃下預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32 個(gè)循環(huán);然后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物放于4 ℃保存。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠在70 V 電壓下電泳45 min，以DL5000 為Marker 進(jìn)行分析。將PCR 回收產(chǎn)物送至上海英駿生物工程技術(shù)公司測(cè)序，將獲得的序列用GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST 程序進(jìn)行分析并與己報(bào)道的序列進(jìn)行同源性比較(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，確定各菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.2.5 RN－61 蛋白質(zhì)提取及抑菌活性測(cè)定

（4）有利于提高物流園區(qū)建設(shè)質(zhì)量。基于EPC的智慧物流園區(qū)總包業(yè)務(wù)，設(shè)計(jì)發(fā)揮主導(dǎo)決定作用，可以及時(shí)便捷的向采購(gòu)和實(shí)施提供技術(shù)支持和引導(dǎo)，將智慧物流園區(qū)的規(guī)劃和設(shè)計(jì)方案貫穿整個(gè)總包項(xiàng)目中，實(shí)現(xiàn)園區(qū)建設(shè)質(zhì)量的提升。

將拮抗菌株RN－61 培養(yǎng)于LB 液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃的條件下震蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)液在4 ℃下置于離心機(jī)上10 000 r/min 離心15 min，取離心后上清液各500 mL 分別溶于不同飽和度的(NH4)2SO4溶液(60%、70%、80%、90%、100%)各500 mL 中。然后將該混合液放于冰箱中4 ℃靜置48 h，將發(fā)酵液中的蛋白絮凝沉淀析出，再次以4℃，10 000 r/min 離心15 min，棄去上清液。用PBS緩沖液進(jìn)行懸浮，并用與懸浮液相同濃度的PBS 透析(透析袋規(guī)格:25 KD)去除鹽分，并稀釋每種析出物到不同體積，測(cè)定提取物對(duì)桃褐腐病菌的抑菌活性，確定析出蛋白所需(NH4)2SO4的最適飽和度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用DPS 軟件Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中拮抗細(xì)菌的分離與篩選

從采集的土樣中共分獲103 株細(xì)菌。用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中10 種常見(jiàn)病原真菌做平板對(duì)峙試驗(yàn)，進(jìn)行初步篩選。研究發(fā)現(xiàn)一部分菌株對(duì)所有供試病原菌均有抑制效果，這些菌株對(duì)多數(shù)病原菌有強(qiáng)拮抗活性。從表1中可以看出，對(duì)棉花紅腐病菌、辣椒炭疽病菌、茄子黃萎病菌、玉米青枯病菌、辣椒根腐病菌、黃瓜霜霉病菌、李干腐病菌、草莓灰霉病菌、馬鈴薯干腐病菌具有抑菌活性的菌株分別為23、28、7、32、35、32、36、15、43、30 株，占分離得到菌株總數(shù)22.3%、27.3%、6.79%、31.06%、33.98%、31.67%、34.95%、14.56%、41.74%、30.09%。103 株野生菌株中對(duì)桃褐腐病菌有拮抗作用的菌株數(shù)最多，對(duì)茄子黃萎病菌有拮抗活性的菌株最少。對(duì)這些菌株的抑制難度前5 位為:茄子黃萎病菌、草莓灰霉病菌、棉花紅腐病菌、辣椒炭疽病菌、馬鈴薯干腐病菌。對(duì)辣椒炭疽病菌和茄子黃萎病菌拮抗活性最強(qiáng)的僅為1 株，為難抑制病原菌，對(duì)黃瓜霜霉病菌有強(qiáng)抑制效果的菌株最多，為10 株。其中對(duì)10 種病原真菌均有抑制效果，而且拮抗活性多數(shù)為三級(jí)的菌株為RN－61 和RN－88。

圖1為菌株RN－61 對(duì)10 種病原真菌的抑制效果圖?？梢钥闯觯诰闞N－61 的菌落周?chē)写笮〔坏鹊囊志鷰?，真菌無(wú)法生長(zhǎng)。由此可以推斷，該菌在生長(zhǎng)過(guò)程中有拮抗活性物質(zhì)代謝并于培養(yǎng)基內(nèi)滲透。其中RN－61 對(duì)辣椒炭疽病菌和玉米青枯病菌的抑菌效果相對(duì)其他病原菌略差，對(duì)桃褐腐病菌和草莓灰霉病菌的效果最明顯。但可以確定該菌株為一株對(duì)各供試菌株均有抑制效果的廣譜拮抗菌株。

2.2 活性菌抑菌譜的測(cè)定

用生長(zhǎng)速率法測(cè)定篩選出的拮抗活性最好的2株菌株RN－61 和RN－88 的離體菌液抑菌活性，如表2所示。結(jié)果表明，2 菌株發(fā)酵后的無(wú)菌濾液對(duì)10 種供試病原真菌均表現(xiàn)出了不同程度的抑制生長(zhǎng)作用。對(duì)桃褐腐病菌的抑制率都在80%以上;對(duì)棉花紅腐病菌、辣椒炭疽病菌的抑制率較小，但也達(dá)到了在25%以上;對(duì)草莓灰霉病菌的抑制率也比較大，RN－61 達(dá)到79.12%，RN－88 菌株達(dá)到了73.68%;另外，RN－61 菌株的無(wú)菌濾液除了對(duì)玉米青枯病菌效果稍差以外，對(duì)茄子黃萎病菌、馬鈴薯干腐病菌、辣椒根腐病菌、黃瓜霜霉病菌、李干腐病菌的抑制率也都達(dá)到了50%以上。用肉眼可看到2 種菌株對(duì)所有指示菌都有拮抗效果，在其周?chē)加写笮〔坏鹊囊志鷰Мa(chǎn)生。

表2 菌株RN－61 和RN－88 無(wú)菌濾液的抑菌譜

2.3 RN－61 和RN－88 菌落形態(tài)及菌株的生理生化特征

對(duì)分離到的2 種具有廣譜效果的拮抗菌的形態(tài)觀(guān)察和生理生化測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。分離菌株RN－61 在LB 上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)24 h 后菌落中型，為圓形或近似圓形，乳白色，不透明，表面不光滑，無(wú)光澤，不產(chǎn)色素，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，菌落變干，邊緣突起，菌落上有褶皺及突起，亞甲基蘭染色后光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察到菌體呈桿狀，大小為(1.2 ～1.4)μm ×(0.6 ～0.8)μm，菌體周生鞭毛，芽孢橢圓形;分離純化后的菌株RN－88，桿狀，革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，能運(yùn)動(dòng)。在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 h 后可形成菌落，菌落呈圓形，表面凸起，光滑，有光澤，較粘稠，為膿狀物，邊緣整齊。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》所列的細(xì)菌菌株形態(tài)學(xué)和生理生化性狀與表4描述的菌株RN－61 和RN－88的特征進(jìn)行對(duì)比，初步判定這2 株菌株分別為枯草芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌。

2.4 分離拮抗菌株的分子生物學(xué)(16 S rRNA)鑒定

2.4.1 16 S rRNA 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)克隆將RN－61 號(hào)細(xì)菌與RN－88 號(hào)細(xì)菌的16 S rRNA，并進(jìn)行測(cè)序分析，來(lái)確定它們?cè)诩?xì)菌分類(lèi)中的地位。測(cè)序結(jié)果可以看出，RN－61 的16 S rRNA 序列長(zhǎng)度為1 440 bp，RN－88 的16 S rRNA 序列長(zhǎng)度為1 412 bp。表明針對(duì)細(xì)菌設(shè)計(jì)的引物序列比較準(zhǔn)確，能夠擴(kuò)增出特異性片斷。

圖1 拮抗真菌RN－61 對(duì)10 種病原真菌的拮抗活性

將RN－61 16 S rRNA 序列通過(guò)BLAST 程序與GeneBank 中收集的核苷酸序列比對(duì)，結(jié)果表明，相似性在99%以上的有20 個(gè)菌株核酸序列，主要是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，以及一些未確定的芽孢桿菌(Bacillu ssp.)。與地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)相似度為98%。與蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和專(zhuān)性嗜堿性芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus)相似度均為94%。由此可見(jiàn)，分離純化的菌株RN－61 應(yīng)為枯草芽孢桿菌屬的一個(gè)菌株。該菌株的16 S rRNA 基因序列已收錄于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的GeneBank 里，登錄號(hào)為KC840668。由于其與已知數(shù)據(jù)庫(kù)中各菌株的最大相似度為99%，所以認(rèn)為該菌株為一個(gè)新菌株，暫命名為Bacillus subtilis RN－61。這是由同種細(xì)菌的種內(nèi)差異造成的，同屬于枯草芽孢桿菌，但地理分布不同的菌株之間在遺傳上存在的微小差異可以通過(guò)16 S rRNA 序列上的差異反映出來(lái)。

菌株RN－88 測(cè)序后與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有菌株同源性比較的結(jié)果顯示與該菌株相似度最大的是假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens F113)和丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)，相似度均為99%，與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)的相似度為97%。初步確定菌株RN－88 為假單胞菌屬(Pseudomonas)。因此再結(jié)合菌株RN－88 的形態(tài)和生理生化的測(cè)定結(jié)果，可以鑒定該菌株熒光假單胞桿菌。

表3 菌株RN－61 和RN－88 形態(tài)及主要生化特征

2.4.3 RN－61 抗菌蛋白的提取及活性

由表4和圖3可知，用飽和度為80% 的(NH4)2SO4析出的粗蛋白的抗菌能力最強(qiáng)，菌落直徑為29.0 mm(P ＜0.05)。用飽和度為70%與90%的(NH4)2SO4提取的蛋白拮抗性相似，與80%飽和度下提取的蛋白相比，其抑菌活性相對(duì)較小。當(dāng)飽和度在60%和100%時(shí)，抑菌活性大致相同，與其它飽和度相比最差(P ＜0.05)。不同的蛋白在不同的鹽濃度下有著不同的溶解度，隨著鹽濃度的升高溶解度會(huì)有下降，因此，不同溶解度的蛋白會(huì)相繼析出。

蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小各有不同，對(duì)水的親和程度也不同，因此，不同飽和度的(NH4)2SO4可以析出不同的蛋白。通過(guò)調(diào)節(jié)(NH4)2SO4的飽和度可使不同蛋白分別析出。由此可知，抑菌活性蛋白在飽和度為80%的(NH4)2SO4溶液中溶解度最小。

表4 不同飽和度(NH4)2SO4 沉淀蛋白的抑菌效果

圖2 RN－88 與RN－61 16 S rRNA 基因克隆

圖3 (NH4)2SO4 不同飽和度下沉淀蛋白的抑菌效果

3 結(jié)論與討論

從北京不同農(nóng)田區(qū)土壤中共分離得到103 株細(xì)菌，以10 種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)病菌為指示菌用對(duì)峙培養(yǎng)篩選法篩選具有廣譜抑菌活性的拮抗細(xì)菌，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。結(jié)果表明，編號(hào)為RN－61 和RN－88 的細(xì)菌菌株分別對(duì)指示病原菌具有強(qiáng)抑菌活性，鑒定其分別為枯草芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌。經(jīng)過(guò)不同飽和度(NH4)2SO4提取菌株RN－61 抑菌蛋白，并比較其抑菌效果，得出飽和度為80%的(NH4)2SO4析出的蛋白抗菌活性最好。

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中存在植物根周?chē)亩喾N微生物與植物之間形成緊密聯(lián)系，一部分細(xì)菌能夠很好抑制植物病原菌的生長(zhǎng)和繁殖［16］。大量研究表明，拮抗細(xì)菌通過(guò)同植物競(jìng)爭(zhēng)空間和營(yíng)養(yǎng)的作用或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等作用機(jī)制防治植物細(xì)菌性病害傳播。目前，關(guān)于生防芽孢桿菌應(yīng)用研究的報(bào)道很多［3］。國(guó)內(nèi)外有研究者研究表明，從根際土壤中篩選到的生防細(xì)菌較多的是芽胞桿菌、假單胞菌等［17－18］。本試驗(yàn)研究結(jié)果與前人所做研究的成果一致。目前蛋白質(zhì)的分離和純化技術(shù)相對(duì)成熟，國(guó)內(nèi)外均有有關(guān)枯草芽孢桿菌的抗菌蛋白質(zhì)的分離和純化報(bào)道。謝棟等［19］從枯草芽飽桿菌BS－98 中分離到抗菌蛋白質(zhì)對(duì)黃曲霉菌都有明顯抑制作用;Lee等［20］從Bacillus subtilis SC－8 菌株的培養(yǎng)物中分析檢測(cè)到一種對(duì)臘狀芽孢桿菌有明顯拮抗活性的物質(zhì)。但對(duì)枯草芽孢桿菌RN－61 的抗菌蛋白質(zhì)并不清楚。本研究根據(jù)前人研究方法，對(duì)粗分離拮抗菌株的抑菌蛋白進(jìn)行研究，并確定了該類(lèi)抑菌蛋白的最適(NH4)2SO4提取飽和濃度，為菌株蛋白的進(jìn)一步研發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

利用細(xì)菌的抑菌作用研制出針對(duì)真菌所引起的植物病蟲(chóng)害的農(nóng)藥，可以很好的保護(hù)土壤環(huán)境，而且還能保證食物安全。新型的生物殺菌劑的研發(fā)和使用，在無(wú)公害生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用前景。篩選對(duì)病原菌有拮抗作用的細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌等微生物，是采用生物防治手段控制土傳病害的基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者積極致力于生防微生物篩選［21－23］。王彩霞等［24］在對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病拮抗細(xì)菌菌株BJ－1 的鑒定及其抑菌作用的研究中，以蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌為指示菌，篩選出拮抗細(xì)菌菌株BJ－1 對(duì)常見(jiàn)的8 株果樹(shù)病原真菌表現(xiàn)顯著的拮抗作用。本研究以廣譜高效作為拮抗細(xì)菌篩選指標(biāo)，對(duì)初歩篩選的對(duì)10 種病原菌抑菌效果較好的菌株RN－66 和RN－88 進(jìn)行活性測(cè)定，菌株的無(wú)菌發(fā)酵液同樣可以有效防治10 種病原真菌，顯著抑制菌絲生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了抑菌活性物質(zhì)，在對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌蛋白活性進(jìn)行了初步分離及活性測(cè)試，效果顯著。由此可見(jiàn)，該菌株有潛在的生防應(yīng)用價(jià)值。之前關(guān)于篩選拮抗細(xì)菌的研究中所選指示細(xì)菌數(shù)目較少，指標(biāo)單一，篩選得到的拮抗細(xì)菌可能不具有廣譜性，該試驗(yàn)將為廣譜菌株的篩選提供理論基礎(chǔ)，篩選出的菌株也將為廣譜殺菌劑的研發(fā)提供新的材料。

植物根系周?chē)寥乐猩钪罅坎煌N類(lèi)的細(xì)菌，大量研究表明不同生防菌提高植物抗耐病性的機(jī)制不同，有的是由某種機(jī)制單獨(dú)起作用，有的是多種機(jī)制共同發(fā)揮作用［25－26］。此外，生防微生物多為活菌制劑，進(jìn)行田間施用時(shí)，常受到溫度、濕度、土壤、pH 值及土壤中其它細(xì)菌等外界因素的影響，生防菌株的生防能力和室內(nèi)試驗(yàn)相比會(huì)有所變化［27］。本試驗(yàn)僅對(duì)篩選出的拮抗細(xì)菌的抗菌性進(jìn)行了研究。因此，對(duì)篩選出的拮抗細(xì)菌拮抗蛋白的活性成分的鑒定、抑制機(jī)理和田間防治作用還需要在后續(xù)做進(jìn)一步研究。

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