植物病原真菌拮抗細菌的篩選鑒定及活性成分分析1)

任建軍 師光祿 高美娟 王有年

(北京林業(yè)大學，北京，100083) (北京農(nóng)學院) (農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點開放實驗室(北京農(nóng)學院))

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，每年因植物病害造成的減產(chǎn)量為總產(chǎn)量的10% ～15%［1］。目前，植物病害的防治方法主要是利用化學農(nóng)藥防治。隨著人們對環(huán)保和健康關注程度的提高，使用化學合成農(nóng)藥帶來的毒性、污染、殘留、生態(tài)破壞等問題日益受到關注。因此，以高效、低毒、低殘留的環(huán)境友好型生物農(nóng)藥逐步替代傳統(tǒng)的高毒化學農(nóng)藥是農(nóng)藥發(fā)展的一種必然趨勢［2］，而安全性高、綠色環(huán)保的微生物農(nóng)藥則成為一種新興的替代方法［3］。近年來，利用土壤中有益微生物控制病害的研究國內(nèi)外均有報道［4－5］，其中拮抗細菌在植物病害防治中起到非常重要的作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)在植物根圍區(qū)系中存在大量微生物，許多微生物及其代謝產(chǎn)物能夠抑制植物病原菌的生長發(fā)育，因此從土壤中篩選植物病原菌的拮抗菌反施于土壤，可人為增加有益微生物類群，限制有害微生物生長，減少化學農(nóng)藥可能帶來的環(huán)境污染，又解決了抗病品種篩選周期長、抗病單一的缺點［7－11］。獲得高效拮抗菌株是進行生物防治研究的基礎。本研究以篩選廣譜拮抗菌株為目標，以園藝生產(chǎn)中常見的10 種植物病菌為指示菌，對采自北京市昌平區(qū)和懷柔區(qū)的農(nóng)田土樣中分離的103 株細菌菌株進行抑菌篩選。對拮抗效果好的細菌進行生理生化測定及16 S rRNA 序列分析，以鑒定細菌種類，并對活性菌株產(chǎn)生的抑菌蛋白進行提取及生物測定。旨在為植物病原菌的新型生防殺菌劑的研究和開發(fā)提供新的生防材料，為利用拮抗菌防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中各種病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生防細菌:2010年7月于北京市昌平區(qū)南口鎮(zhèn)和懷柔區(qū)橋梓鎮(zhèn)農(nóng)田采集的土樣中分離獲得。放入冰箱中4 ℃保存。

供試病原菌:棉花紅腐病菌(Fusarium moniliforme Sheld.)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum gloesporioides (Syd.)Butl.)、茄子黃萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)、馬鈴薯干腐病菌(Fusarium solani(Mart.)Sacc.)、玉米青枯病菌(Ralstonia solanacearum Schw.)、辣椒根腐病菌(Fusarium vasinfectum Atk.)、黃瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis (Berk.et Curt.)Rostov.)、李干腐病菌(Poloporus hirsutus Sacc.)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa(Aderh.et Ruhl.)Honey)，以上菌株由北京農(nóng)學院都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室分離鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 土壤細菌的分離與純化

稱取10 g 土樣，在超凈工作臺中無菌條件下置于含有90 mL 磷酸緩沖液的三角瓶中，封口，用搖床160 r/min 振蕩30 min，靜置5 min，然后吸取上清液稀釋至10－2～10－8倍，取10－5至10－8倍的稀釋液0.1 mL 均勻涂滿LB 培養(yǎng)基平板。37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后進行觀察，挑取不同形態(tài)單菌落，分離純化后將其編號為RN－01，RN－01，RN－03……并于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆茫?2］。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

采用傳統(tǒng)的對峙培養(yǎng)法初篩，將實驗室冰箱中保存的病原菌從斜面轉(zhuǎn)接到PDA 平板中，27 ℃培養(yǎng)3 ～5 d，待病原菌長滿平板后，用直徑為0.4 cm 的打孔器在病原菌邊緣打取菌碟備用。然后在PDA 培養(yǎng)基平板中央接入病原真菌菌餅，在距離菌餅左右2.5 cm 處，用沾有細菌的接菌環(huán)劃兩條平行線，27℃培養(yǎng)，3 ～5 d 后測量細菌與病原真菌之間抑菌帶的寬度，重復上述歩驟3 次，對所分離細菌的拮抗性進行初步篩選。根據(jù)拮抗細菌與病原真菌之間的拮抗直徑采用分級方法統(tǒng)計拮抗效果:1 級，0 ～3 mm;2 級，3 ～6 mm;3 級，＞6 mm。

1.2.3 細菌發(fā)酵后無菌濾液的抗菌譜活性測定

將初選的拮抗作用強的菌株轉(zhuǎn)接至LB 培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)12 h 后，接種至LB 液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，在37 ℃、180 r/min 條件下，振蕩培養(yǎng)24 h，然后在無菌條件下將菌體發(fā)酵液10 000 r/min離心15 min，取上清液在0.45 μm 微孔濾膜過濾器中過濾，即得到無菌濾液。然后將濾液與LB 培養(yǎng)基以體積比1∶ 9 混合。以不加濾液的培養(yǎng)基為對照，采用生長速率法測定其抑菌譜。按公式計算菌絲生長抑制率。生長抑制率=(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

1.2.4 活性菌株的鑒定

形態(tài)特征的觀察及生理生化測試:將活性菌株分別在LB 上劃線和混入LB 培養(yǎng)基，于37 ℃下培養(yǎng)12 h 后觀察單菌落形態(tài)特征，并將斜面培養(yǎng)24 h的待測菌接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2 d，觀察培養(yǎng)液的變化。對抑菌效果穩(wěn)定的菌株進行形態(tài)觀察及革蘭氏染色和芽孢染色初步鑒定其種屬。參照文獻［13］、［14］對活性菌株進行糖醇類發(fā)酵－產(chǎn)酸、運動性、耐鹽性和需鹽性、硝酸鹽還原反應、接觸酶反應、乙酞甲基甲醇試驗(V－ P 試驗)、淀粉水解反應、檸檬酸鹽利用、明膠液化反應測定。

分子生物學(16 S rRNA)鑒定:采用CTAB 法提取細菌基因組DNA［15］，根據(jù)原核生物16 S rDNA 保守序列，采用上海英駿生物科技有限公司測定細菌16 S rRNA 的通用引物對DNA 模版進行PCR 擴增，F(xiàn)(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')(Invitrogen);R(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3')(Invitrogen)。擴增反應在25 μL 的16 S rRNA 擴增反應體系中進行。95 ℃下預變性5 min;95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32 個循環(huán);然后72 ℃延伸5 min。反應結束后產(chǎn)物放于4 ℃保存。取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠在70 V 電壓下電泳45 min，以DL5000 為Marker 進行分析。將PCR 回收產(chǎn)物送至上海英駿生物工程技術公司測序，將獲得的序列用GeneBank 數(shù)據(jù)庫中BLAST 程序進行分析并與己報道的序列進行同源性比較(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，確定各菌株的系統(tǒng)發(fā)育學地位。

1.2.5 RN－61 蛋白質(zhì)提取及抑菌活性測定

（4）有利于提高物流園區(qū)建設質(zhì)量?；贓PC的智慧物流園區(qū)總包業(yè)務，設計發(fā)揮主導決定作用，可以及時便捷的向采購和實施提供技術支持和引導，將智慧物流園區(qū)的規(guī)劃和設計方案貫穿整個總包項目中，實現(xiàn)園區(qū)建設質(zhì)量的提升。

將拮抗菌株RN－61 培養(yǎng)于LB 液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃的條件下震蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)液在4 ℃下置于離心機上10 000 r/min 離心15 min，取離心后上清液各500 mL 分別溶于不同飽和度的(NH4)2SO4溶液(60%、70%、80%、90%、100%)各500 mL 中。然后將該混合液放于冰箱中4 ℃靜置48 h，將發(fā)酵液中的蛋白絮凝沉淀析出，再次以4℃，10 000 r/min 離心15 min，棄去上清液。用PBS緩沖液進行懸浮，并用與懸浮液相同濃度的PBS 透析(透析袋規(guī)格:25 KD)去除鹽分，并稀釋每種析出物到不同體積，測定提取物對桃褐腐病菌的抑菌活性，確定析出蛋白所需(NH4)2SO4的最適飽和度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應用DPS 軟件Duncan’s 新復極差法進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 土壤中拮抗細菌的分離與篩選

從采集的土樣中共分獲103 株細菌。用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中10 種常見病原真菌做平板對峙試驗，進行初步篩選。研究發(fā)現(xiàn)一部分菌株對所有供試病原菌均有抑制效果，這些菌株對多數(shù)病原菌有強拮抗活性。從表1中可以看出，對棉花紅腐病菌、辣椒炭疽病菌、茄子黃萎病菌、玉米青枯病菌、辣椒根腐病菌、黃瓜霜霉病菌、李干腐病菌、草莓灰霉病菌、馬鈴薯干腐病菌具有抑菌活性的菌株分別為23、28、7、32、35、32、36、15、43、30 株，占分離得到菌株總數(shù)22.3%、27.3%、6.79%、31.06%、33.98%、31.67%、34.95%、14.56%、41.74%、30.09%。103 株野生菌株中對桃褐腐病菌有拮抗作用的菌株數(shù)最多，對茄子黃萎病菌有拮抗活性的菌株最少。對這些菌株的抑制難度前5 位為:茄子黃萎病菌、草莓灰霉病菌、棉花紅腐病菌、辣椒炭疽病菌、馬鈴薯干腐病菌。對辣椒炭疽病菌和茄子黃萎病菌拮抗活性最強的僅為1 株，為難抑制病原菌，對黃瓜霜霉病菌有強抑制效果的菌株最多，為10 株。其中對10 種病原真菌均有抑制效果，而且拮抗活性多數(shù)為三級的菌株為RN－61 和RN－88。

圖1為菌株RN－61 對10 種病原真菌的抑制效果圖?？梢钥闯觯诰闞N－61 的菌落周圍有大小不等的抑菌帶，真菌無法生長。由此可以推斷，該菌在生長過程中有拮抗活性物質(zhì)代謝并于培養(yǎng)基內(nèi)滲透。其中RN－61 對辣椒炭疽病菌和玉米青枯病菌的抑菌效果相對其他病原菌略差，對桃褐腐病菌和草莓灰霉病菌的效果最明顯。但可以確定該菌株為一株對各供試菌株均有抑制效果的廣譜拮抗菌株。

2.2 活性菌抑菌譜的測定

用生長速率法測定篩選出的拮抗活性最好的2株菌株RN－61 和RN－88 的離體菌液抑菌活性，如表2所示。結果表明，2 菌株發(fā)酵后的無菌濾液對10 種供試病原真菌均表現(xiàn)出了不同程度的抑制生長作用。對桃褐腐病菌的抑制率都在80%以上;對棉花紅腐病菌、辣椒炭疽病菌的抑制率較小，但也達到了在25%以上;對草莓灰霉病菌的抑制率也比較大，RN－61 達到79.12%，RN－88 菌株達到了73.68%;另外，RN－61 菌株的無菌濾液除了對玉米青枯病菌效果稍差以外，對茄子黃萎病菌、馬鈴薯干腐病菌、辣椒根腐病菌、黃瓜霜霉病菌、李干腐病菌的抑制率也都達到了50%以上。用肉眼可看到2 種菌株對所有指示菌都有拮抗效果，在其周圍都有大小不等的抑菌帶產(chǎn)生。

表2 菌株RN－61 和RN－88 無菌濾液的抑菌譜

2.3 RN－61 和RN－88 菌落形態(tài)及菌株的生理生化特征

對分離到的2 種具有廣譜效果的拮抗菌的形態(tài)觀察和生理生化測定結果見表3。分離菌株RN－61 在LB 上生長良好，培養(yǎng)24 h 后菌落中型，為圓形或近似圓形，乳白色，不透明，表面不光滑，無光澤，不產(chǎn)色素，隨著培養(yǎng)時間延長，菌落變干，邊緣突起，菌落上有褶皺及突起，亞甲基蘭染色后光學顯微鏡下觀察到菌體呈桿狀，大小為(1.2 ～1.4)μm ×(0.6 ～0.8)μm，菌體周生鞭毛，芽孢橢圓形;分離純化后的菌株RN－88，桿狀，革蘭氏染色陰性，無芽孢，能運動。在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 h 后可形成菌落，菌落呈圓形，表面凸起，光滑，有光澤，較粘稠，為膿狀物，邊緣整齊。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及《伯杰細菌鑒定手冊》所列的細菌菌株形態(tài)學和生理生化性狀與表4描述的菌株RN－61 和RN－88的特征進行對比，初步判定這2 株菌株分別為枯草芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌。

2.4 分離拮抗菌株的分子生物學(16 S rRNA)鑒定

2.4.1 16 S rRNA 的PCR 擴增結果

通過克隆將RN－61 號細菌與RN－88 號細菌的16 S rRNA，并進行測序分析，來確定它們在細菌分類中的地位。測序結果可以看出，RN－61 的16 S rRNA 序列長度為1 440 bp，RN－88 的16 S rRNA 序列長度為1 412 bp。表明針對細菌設計的引物序列比較準確，能夠擴增出特異性片斷。

圖1 拮抗真菌RN－61 對10 種病原真菌的拮抗活性

將RN－61 16 S rRNA 序列通過BLAST 程序與GeneBank 中收集的核苷酸序列比對，結果表明，相似性在99%以上的有20 個菌株核酸序列，主要是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，以及一些未確定的芽孢桿菌(Bacillu ssp.)。與地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)相似度為98%。與蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和專性嗜堿性芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus)相似度均為94%。由此可見，分離純化的菌株RN－61 應為枯草芽孢桿菌屬的一個菌株。該菌株的16 S rRNA 基因序列已收錄于NCBI 數(shù)據(jù)庫的GeneBank 里，登錄號為KC840668。由于其與已知數(shù)據(jù)庫中各菌株的最大相似度為99%，所以認為該菌株為一個新菌株，暫命名為Bacillus subtilis RN－61。這是由同種細菌的種內(nèi)差異造成的，同屬于枯草芽孢桿菌，但地理分布不同的菌株之間在遺傳上存在的微小差異可以通過16 S rRNA 序列上的差異反映出來。

菌株RN－88 測序后與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已有菌株同源性比較的結果顯示與該菌株相似度最大的是假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens F113)和丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)，相似度均為99%，與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)的相似度為97%。初步確定菌株RN－88 為假單胞菌屬(Pseudomonas)。因此再結合菌株RN－88 的形態(tài)和生理生化的測定結果，可以鑒定該菌株熒光假單胞桿菌。

表3 菌株RN－61 和RN－88 形態(tài)及主要生化特征

2.4.3 RN－61 抗菌蛋白的提取及活性

由表4和圖3可知，用飽和度為80% 的(NH4)2SO4析出的粗蛋白的抗菌能力最強，菌落直徑為29.0 mm(P ＜0.05)。用飽和度為70%與90%的(NH4)2SO4提取的蛋白拮抗性相似，與80%飽和度下提取的蛋白相比，其抑菌活性相對較小。當飽和度在60%和100%時，抑菌活性大致相同，與其它飽和度相比最差(P ＜0.05)。不同的蛋白在不同的鹽濃度下有著不同的溶解度，隨著鹽濃度的升高溶解度會有下降，因此，不同溶解度的蛋白會相繼析出。

蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小各有不同，對水的親和程度也不同，因此，不同飽和度的(NH4)2SO4可以析出不同的蛋白。通過調(diào)節(jié)(NH4)2SO4的飽和度可使不同蛋白分別析出。由此可知，抑菌活性蛋白在飽和度為80%的(NH4)2SO4溶液中溶解度最小。

表4 不同飽和度(NH4)2SO4 沉淀蛋白的抑菌效果

圖2 RN－88 與RN－61 16 S rRNA 基因克隆

圖3 (NH4)2SO4 不同飽和度下沉淀蛋白的抑菌效果

3 結論與討論

從北京不同農(nóng)田區(qū)土壤中共分離得到103 株細菌，以10 種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見病菌為指示菌用對峙培養(yǎng)篩選法篩選具有廣譜抑菌活性的拮抗細菌，并對其發(fā)酵產(chǎn)物進行抑菌活性測定。結果表明，編號為RN－61 和RN－88 的細菌菌株分別對指示病原菌具有強抑菌活性，鑒定其分別為枯草芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌。經(jīng)過不同飽和度(NH4)2SO4提取菌株RN－61 抑菌蛋白，并比較其抑菌效果，得出飽和度為80%的(NH4)2SO4析出的蛋白抗菌活性最好。

在長期的進化過程中存在植物根周圍的多種微生物與植物之間形成緊密聯(lián)系，一部分細菌能夠很好抑制植物病原菌的生長和繁殖［16］。大量研究表明，拮抗細菌通過同植物競爭空間和營養(yǎng)的作用或誘導植物產(chǎn)生抗病性等作用機制防治植物細菌性病害傳播。目前，關于生防芽孢桿菌應用研究的報道很多［3］。國內(nèi)外有研究者研究表明，從根際土壤中篩選到的生防細菌較多的是芽胞桿菌、假單胞菌等［17－18］。本試驗研究結果與前人所做研究的成果一致。目前蛋白質(zhì)的分離和純化技術相對成熟，國內(nèi)外均有有關枯草芽孢桿菌的抗菌蛋白質(zhì)的分離和純化報道。謝棟等［19］從枯草芽飽桿菌BS－98 中分離到抗菌蛋白質(zhì)對黃曲霉菌都有明顯抑制作用;Lee等［20］從Bacillus subtilis SC－8 菌株的培養(yǎng)物中分析檢測到一種對臘狀芽孢桿菌有明顯拮抗活性的物質(zhì)。但對枯草芽孢桿菌RN－61 的抗菌蛋白質(zhì)并不清楚。本研究根據(jù)前人研究方法，對粗分離拮抗菌株的抑菌蛋白進行研究，并確定了該類抑菌蛋白的最適(NH4)2SO4提取飽和濃度，為菌株蛋白的進一步研發(fā)應用奠定了基礎。

利用細菌的抑菌作用研制出針對真菌所引起的植物病蟲害的農(nóng)藥，可以很好的保護土壤環(huán)境，而且還能保證食物安全。新型的生物殺菌劑的研發(fā)和使用，在無公害生產(chǎn)中具有重要應用前景。篩選對病原菌有拮抗作用的細菌、真菌、放線菌等微生物，是采用生物防治手段控制土傳病害的基礎，國內(nèi)外學者積極致力于生防微生物篩選［21－23］。王彩霞等［24］在對蘋果樹腐爛病拮抗細菌菌株BJ－1 的鑒定及其抑菌作用的研究中，以蘋果樹腐爛病菌為指示菌，篩選出拮抗細菌菌株BJ－1 對常見的8 株果樹病原真菌表現(xiàn)顯著的拮抗作用。本研究以廣譜高效作為拮抗細菌篩選指標，對初歩篩選的對10 種病原菌抑菌效果較好的菌株RN－66 和RN－88 進行活性測定，菌株的無菌發(fā)酵液同樣可以有效防治10 種病原真菌，顯著抑制菌絲生長，說明菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了抑菌活性物質(zhì)，在對發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌蛋白活性進行了初步分離及活性測試，效果顯著。由此可見，該菌株有潛在的生防應用價值。之前關于篩選拮抗細菌的研究中所選指示細菌數(shù)目較少，指標單一，篩選得到的拮抗細菌可能不具有廣譜性，該試驗將為廣譜菌株的篩選提供理論基礎，篩選出的菌株也將為廣譜殺菌劑的研發(fā)提供新的材料。

植物根系周圍土壤中生活著大量不同種類的細菌，大量研究表明不同生防菌提高植物抗耐病性的機制不同，有的是由某種機制單獨起作用，有的是多種機制共同發(fā)揮作用［25－26］。此外，生防微生物多為活菌制劑，進行田間施用時，常受到溫度、濕度、土壤、pH 值及土壤中其它細菌等外界因素的影響，生防菌株的生防能力和室內(nèi)試驗相比會有所變化［27］。本試驗僅對篩選出的拮抗細菌的抗菌性進行了研究。因此，對篩選出的拮抗細菌拮抗蛋白的活性成分的鑒定、抑制機理和田間防治作用還需要在后續(xù)做進一步研究。

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