刺槐胚性細胞懸浮體系的建立1)

馮 玥 習 洋 陳 串 喻娃亞雄 王少明 徐惠敏 孫宇涵 李 云

(北京林業(yè)大學，北京，100083) (國有洛寧縣呂村林場) (北京林業(yè)大學)

刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又名洋槐，屬豆科刺槐屬的落葉喬木。天然分布于美國東部，并于1877—1878年被首次引種至我國南京，1898年被大范圍引種至青島種植，如今，刺槐在我國已成為一種重要的生態(tài)樹種而被廣泛種植［1］。刺槐生長迅速，木材堅韌、紋理細致、有彈性、耐水濕、抗腐朽，是重要的速生用材樹種。刺槐長有大量根瘤，可以通過其根中的瘤菌固氮增加土壤肥力，在提高林分質量、維持生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用［2］。刺槐的葉片含有大量粗蛋白，是優(yōu)質廉價的家畜飼料資源［3］。刺槐花營養(yǎng)豐富，是人們熟悉的蜜源花，還可用于提取香料等［4］。綜上可知，刺槐具有極高的環(huán)境和經(jīng)濟價值。關于刺槐的離體培養(yǎng)研究始于20 世紀50年代末，80年代以后達到高潮［5］。目前，刺槐通過形成層培養(yǎng)、莖培養(yǎng)、葉片培養(yǎng)、未授粉子房的培養(yǎng)等已獲得了完整的植株，但這些研究都集中在器官發(fā)生途徑，通過體細胞胚發(fā)生及原生質體培養(yǎng)等途徑的研究卻很少。

植物細胞懸浮培養(yǎng)技術是20 世紀80年代之后發(fā)展起來的重要的細胞離體培養(yǎng)技術。由于其分散性好，細胞或細胞團大小均勻，生長迅速，細胞狀態(tài)可以相對保持一致，易于調控等［6］，被廣泛用于遺傳學、生理學、細胞學、生物化學、發(fā)育生物學及分子生物學等多個領域的研究。細胞懸浮培養(yǎng)不僅可以直接用于原生質體分離和培養(yǎng)、細胞雜交、基因轉移、次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等，還可以在細胞水平篩選突變體，因此，細胞懸浮培養(yǎng)已成為生物技術研究開發(fā)的新熱點，并被廣泛應用于植物新品種的培育［7］。

目前，已建立完善的懸浮細胞培養(yǎng)系的木本植物主要有龍眼、紅豆杉、枸杞等，關于刺槐細胞懸浮培養(yǎng)的研究國內(nèi)尚未見報道，而建立起優(yōu)質、快速生長的刺槐胚性細胞懸浮系，可為進一步研究刺槐原生質體培養(yǎng)及體細胞雜交、體細胞胚同步化的研究提供良好的試驗材料。本研究以刺槐胚性愈傷組織為材料，利用正交試驗的方法研究了外植體取材時期、基本培養(yǎng)基、細胞起始密度、2，4－D 質量濃度對懸浮細胞的影響，并建立了刺槐胚性細胞懸浮系，以期為刺槐細胞培養(yǎng)的相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

以北京市延慶米家堡苗圃生長良好的二倍體刺槐實生苗群體為取材資源，選取5 棵生長良好、干型較直、結實率高的成年母樹(間隔大于50 m)，在7—8月間，采集開花后45、55、65、75 d 的刺槐不同發(fā)育階段的合子胚作為外植體試驗材料，每間隔10 d 采集1 次，每次采集500 個莢果。將當天采集的莢果用塑料密封袋密封放入冰盒中帶回實驗室，之后放在冰箱中在4 ℃溫度條件下冷藏備用，1 周內(nèi)接種。

1.1 愈傷組織的誘導與增殖培養(yǎng)

將采集的莢果用水洗凈，從中取出未成熟的種子，在超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3 次，0.1% HgCl2浸泡5 min，無菌水沖洗5 ～6次。在無菌條件下，將未成熟的合子胚從莢果中取出，接種到MS+MES 500 mg·L－1+蔗糖30 g·L－1+0.6%瓊脂+2，4－D 5.0 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1愈傷組織的誘導培養(yǎng)基上，誘導發(fā)生胚性愈傷組織［8］。30 d 繼代1 次，每次繼代時，注意挑選嫩黃綠色、松散易碎、顆粒狀的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)。

1.2 懸浮培養(yǎng)系的建立

選擇嫩黃綠色、顆粒狀、生長較快的胚性愈傷組織，用無菌鑷子輕輕夾散，放入盛有30 mL 液體培養(yǎng)基的150 mL 三角瓶內(nèi)，置于水平旋轉搖床上振蕩培養(yǎng)。接種量分別為1.0、2.0 ～3.0、3.0 ～4.0 g，培養(yǎng)條件為(25 ±1)℃，黑暗，120 r/min 振蕩培養(yǎng)。每隔7 d 繼代1 次，前2 次繼代時，棄去上清液約2/3，補以等量的新鮮培養(yǎng)基;從第3 次繼代開始，將培養(yǎng)物過60 目的細胞篩，將篩上的胚性愈傷組織重新懸浮于新鮮的培養(yǎng)基中。連續(xù)培養(yǎng)5 ～6 代后，得到分散度較好、穩(wěn)定性較強且具有胚性的懸浮培養(yǎng)細胞。懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分見表1。

表1 懸浮培養(yǎng)基成分

1.3 懸浮系質量及其培養(yǎng)物胚性的鑒定

使用精密pH 試紙測定懸浮系的pH 值，并觀察懸浮系是否澄清，有無褐化現(xiàn)象，靜止過夜，觀察懸浮系是否清晰分層等。將懸浮系搖勻，每瓶取2 mL懸浮液，放置在10 000 r/min 的離心機中離心5 min，并棄去上層液體，稱量固體質量。使用SPSS 17.0 進行數(shù)據(jù)分析，每個水平設5 個樣本，每個處理3 個重復。

用吸管吸取懸浮液，將其均勻的接種于表面墊有濾紙的MS+MES 500 mg·L－1+蔗糖30 g·L－1+0.6%瓊脂+2，4－D 5.0 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1固體愈傷組織的誘導培養(yǎng)基上，進行看護培養(yǎng)。每14 d 繼代1 次，培養(yǎng)4 周后將培養(yǎng)物接種到MS+MES 500 mg·L－1+蔗糖30 g·L－1+0.6%瓊脂+NAA 0.5 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1+谷氨酰胺250 mg·L－1+水解酪蛋白500 mg·L－1固體體細胞胚誘導培養(yǎng)基上，觀察經(jīng)懸浮培養(yǎng)得到的單個細胞是否可在固體培養(yǎng)基上增殖產(chǎn)生胚性細胞團。

2 結果與分析

2.1 胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)與胚性保持

在刺槐胚性愈傷組織的繼代過程中，我們發(fā)現(xiàn)，外植體的胚齡對愈傷組織胚性的保持影響很大，隨著外植體胚齡的增大，誘導得到的愈傷組織胚性保持能力逐漸下降，以授粉后55 d 的未成熟合子胚為最佳。授粉后45 d 的外植體因其較為幼嫩，愈傷誘導率約為71%，為4 組外植體中最低，其誘導得到的愈傷組織多為白色透明、生長極為迅速且質地蓬松的非胚性愈傷組織。經(jīng)過3 ～4 次繼代培養(yǎng)，部分愈傷組織轉化為嫩黃綠色、顆粒狀的胚性愈傷組織，但這部分愈傷組織并不穩(wěn)定，隨著繼代次數(shù)的增多，這部分轉化得到的胚性愈傷組織逐漸變成乳白色、生長緩慢、含水量極高的棉花狀愈傷組織，見圖1－A。授粉后65 d 和75 d 的外植體胚性愈傷誘導率分別為84.32%與77.13%，因其接近成熟，在誘導愈傷組織時會出現(xiàn)直接發(fā)芽的情況，得到的愈傷組織，其胚性保持也較為困難，經(jīng)過3 ～4 次繼代培養(yǎng)，大部分胚性愈傷組織會出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象，見圖1－B。試驗中，以授粉后55 d 的未成熟合子胚為外植體胚性愈傷組織的誘導率最高，其愈傷誘導發(fā)生率達93.20%，且經(jīng)過多次繼代，愈傷組織胚性沒有出現(xiàn)明顯的下降，且依然保持旺盛的生長力，見圖1－C。因此，授粉后55 d 的未成熟合子胚是為刺槐細胞懸浮培養(yǎng)提供胚性愈傷組織的最佳起始材料。

2.2 刺槐懸浮培養(yǎng)系的建立

2.2.1 基本培養(yǎng)基對懸浮系建立的影響

在懸浮系建立的過程中發(fā)現(xiàn)，1/2MS 比MS 對懸浮系的建立更為有效。以授粉后55 d 的刺槐未成熟合子胚為外植體誘導得到的胚性愈傷組織為起始材料，接種于MS 液體培養(yǎng)基的愈傷組織懸浮起來較困難，細胞分散性差，顆粒較大，一般在5 mm以上，將培養(yǎng)物輕搖發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)系液體部分較為澄清，見圖1－D。此細胞懸浮系中細胞生長速度緩慢，經(jīng)過3 次繼代后容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，平均每4 瓶中即有1 瓶發(fā)生嚴重褐化。且經(jīng)過過篩處理后懸浮物狀態(tài)變差，部分細胞破碎且胚性降低，見圖1－E。而接種于1/2MS 液體培養(yǎng)基的愈傷組織懸浮起來較容易，細胞分散性良好，生長迅速，且在繼代過程中不易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，過篩處理后細胞分散均勻，長勢良好，見圖1－F。因此，為快速建立刺槐細胞懸浮培養(yǎng)系，應采用1/2MS 作為基本培養(yǎng)基。

圖1 刺槐的胚性愈傷組織及其懸浮系建立

2.2.2 植物生長調節(jié)劑種類和質量濃度水平對細胞懸浮系建立及維持的影響

以授粉后55 d 的刺槐未成熟合子胚為外植體誘導得到的胚性愈傷組織為起始材料，1/2MS 為基本培養(yǎng)基，本試驗研究了植物生長調節(jié)劑種類和水平對懸浮系建立及維持的影響，見表2。試驗中，我們發(fā)現(xiàn)誘導胚性愈傷組織的激素種類和激素質量濃度并不適用于刺槐細胞懸浮培養(yǎng)，當培養(yǎng)基中附加的植物生長調節(jié)劑為2，4－D 5.0 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1時，此植物生長調節(jié)劑組合條件下懸浮細胞培養(yǎng)物的鮮質量增長最為緩慢，見圖2。且有許多月牙形、長條形等不規(guī)則形狀的細胞出現(xiàn)(如圖3－B)，這類細胞的細胞質稀薄，生長緩慢，所得到的細胞懸浮液密度最低?？梢姼哔|量濃度的生長素不利于刺槐懸浮細胞的增殖。在附加了較低質量濃度的生長素NAA 的培養(yǎng)基中，細胞增殖速度明顯加快，且細胞密度顯著高于附加2，4－D 的激素組合，因此，懸浮培養(yǎng)時，NAA 較2，4－D 更利于刺槐細胞的增殖和生長力的保持。當培養(yǎng)基中附加激素為NAA 2.5 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1時，培養(yǎng)液中的細胞多為球形和近球形的細胞或細胞團，細胞質濃厚，具有豐富的顆粒狀內(nèi)含物，生長力旺盛，見圖3－A。試驗發(fā)現(xiàn)，1/2MS +NAA 2.5 mg·L－1+6－BA 0.5 mg·L－1為刺槐細胞懸浮培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。

表2 以1/2MS 作為基本培養(yǎng)基的懸浮系的生長調節(jié)劑組合及其質量濃度水平

圖2 植物生長調節(jié)劑組合對細胞懸浮培養(yǎng)的影響

經(jīng)過3 周的振蕩培養(yǎng)，懸浮細胞生長可達到最佳狀態(tài)，該懸浮系中的胚性細胞團均勻，生長旺盛，呈淡黃色，分散度高，無褐化現(xiàn)象。在顯微鏡下以可直接觀察到:細胞團有幾個至十幾個細胞組成，細胞碎片少且細胞質濃厚，見圖3－C。

圖3 刺槐的胚性細胞與非胚性細胞

2.2.3 細胞懸浮培養(yǎng)液中pH 值的變化

如圖4所示，在生長周期內(nèi)，各起始濃度的懸浮系pH 值均呈現(xiàn)波狀變化動態(tài)，結合刺槐懸浮系細胞生長曲線(圖4)可發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液的pH 值變化與細胞生長速率有一定的相關性，當培養(yǎng)初始階段培養(yǎng)液pH 值發(fā)生顯著降低時，細胞的生長處于相對緩慢狀態(tài)，當培養(yǎng)液pH 值回升時，細胞開始進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)液最適的pH 值范圍在5.0 ～5.7。

圖4 細胞懸浮培養(yǎng)物pH 值的變化

在培養(yǎng)的前7 d，懸浮系的pH 值先下降后上升，之后隨著被培養(yǎng)物質量濃度的增加，pH 值又略微下降。Amino 和Tazawa 曾報道(1998)，在水稻懸浮細胞中早期蔗糖的快速水解會導致培養(yǎng)液的pH值迅速下降，與本試驗結果相符。

2.2.4 懸浮細胞培養(yǎng)系的細胞起始密度與生長速率之間的相互關系

懸浮細胞的生長速率與初始接種時的細胞密度有很大關系，如果接種密度低于最適密度時，細胞生長速度緩慢或不生長;如果接種密度過高，會造成細胞的對數(shù)生長期縮短，懸浮培養(yǎng)物的生長速度早早降低或停止生長［9］。因此，確定適宜的細胞起始密度是快速建立胚性懸浮系的關鍵。

由圖5可知，不同起始干質量的培養(yǎng)體系中的細胞干質量都隨著培養(yǎng)時間的延長有不同程度的增長。從細胞干質量曲線可以看出，起始干質量為2.0 g 的懸浮系統(tǒng)其生長量增速較快，且細胞保持持續(xù)增長;當起始干質量為3.0 g 時，培養(yǎng)16 d 后細胞進入緩慢增長期，且生長量有回落的趨勢，可見起始干質量過高會造成懸浮系的培養(yǎng)周期縮短。分析原因可能是懸浮系中培養(yǎng)物過多，細胞密度過大，細胞出現(xiàn)饑餓狀態(tài)，且分泌出某些有毒物質抑制細胞的生長，部分細胞解體死亡。起始干質量為1.0 g 時，細胞增殖速度非常緩慢，且容易出現(xiàn)褐化死亡的現(xiàn)象。當培養(yǎng)時間超過20 d 后，隨著培養(yǎng)時間的延長，懸浮系產(chǎn)生褐化的趨勢增加，活細胞率迅速降低，且因繼代次數(shù)過多而極易發(fā)生大規(guī)模染菌。

圖5 刺槐懸浮細胞系生長曲線

3 結論與討論

植物細胞懸浮培養(yǎng)目前已經(jīng)成為植物生物技術中最有效的研究手段之一，也是植物細胞生長的微生物化途徑之一［10］，細胞在培養(yǎng)過程中可始終保持著良好的分散狀態(tài)，通過建立穩(wěn)定的胚性細胞懸浮系可快速分離大量優(yōu)質原生質體，促進胚性細胞大量快速增殖，形成均一的小細胞團和單細胞，為生理生化、遺傳和細胞學等研究提供良好的試驗體系。本試驗通過對刺槐未成熟合子胚的誘導以及對胚性細胞懸浮培養(yǎng)條件的探索，建立了刺槐的胚性細胞懸浮培養(yǎng)體系。

懸浮細胞系的建立通常以生長快速的松散胚性愈傷組織為起始材料，對于培養(yǎng)難度較大的木本植物來說，建立懸浮細胞系成功的關鍵在于是否能成功誘導出松散、易碎的高品質胚性愈傷組織。呂冬霞等［11］認為，多數(shù)情況下，單獨使用2，4－D 就可以成功誘導愈傷組織的發(fā)生，而紅艷［11］的研究發(fā)現(xiàn):在胚性愈傷組織的誘導過程中需要有高質量濃度的生長素(2，4－D，0.1 ～3.0 mg·L－1)參與，或補加適量的細胞分裂素(6－BA，0.1 ～1.0 mg·L－1)。習洋等［7］的試驗則發(fā)現(xiàn)在2，4－D 質量濃度為0 ～5.0 mg·L－1的范圍內(nèi)，誘導率與2，4－D 質量濃度成正相關關系，但得到的愈傷組織繼代后易褐化死亡，再生頻率很低，而當高質量濃度的生長素與低質量濃度的分裂素協(xié)同作用時其效果將優(yōu)于只添加生長素的培養(yǎng)基配方。本試驗采用了高質量濃度的2，4－D 與低質量濃度的BA 配合使用的愈傷組織誘導配方，成功誘導出了大量高質量具有胚性的愈傷組織，在短時間內(nèi)建立了理想的胚性細胞懸浮體系，驗證了高質量濃度生長素與低質量濃度分裂素協(xié)同作用是誘導刺槐胚性愈傷組織的理想植物生長調節(jié)劑搭配方式。

懸浮細胞培養(yǎng)體系條件的優(yōu)化是植物細胞懸浮培養(yǎng)研究中的重要內(nèi)容之一。懸浮培養(yǎng)系的基本培養(yǎng)基中大量元素的質量濃度對懸浮培養(yǎng)愈傷組織細胞的存活率具有較大的影響，較高滲透壓的培養(yǎng)基不利于懸浮系的建立。有研究表明［12］:當培養(yǎng)基中大量元素總質量濃度過高時，枸杞(Lycium bararum)懸浮系中活細胞百分率降低，還可看到許多細胞呈皺縮狀態(tài)。梁軍等［13］在印楝的懸浮系建立試驗中發(fā)現(xiàn):B5 較MS 對懸浮系的建立更為有效。接種在MS 培養(yǎng)基上的愈傷組織生長緩慢，在繼代過程中易發(fā)生褐化現(xiàn)象;而接種到B5 培養(yǎng)基上的愈傷組織在培養(yǎng)過程中基本沒有出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，且生長迅速，繼代3 次即可建立起比較均勻的懸浮培養(yǎng)系。本次試驗也得出相似的結論，在MS 培養(yǎng)基與1/2MS 培養(yǎng)基的對照組中，接種在1/2MS 培養(yǎng)基上的愈傷組織更易被懸浮起來，且褐化現(xiàn)象明顯減少。

在多數(shù)植物組織培養(yǎng)中，外源生長素和細胞分裂素是細胞離體培養(yǎng)所必需的激素。兩者不同質量濃度和比例或先后配合的應用不但可誘導細胞分裂和生長、而且能控制細胞分化和形態(tài)建成［14］。根據(jù)喬琦等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，降低2，4－D 的質量濃度或用作用較弱的NAA 代替，可以促進體細胞胚的分化和發(fā)育。在本次試驗的懸浮系建立初期，我們發(fā)現(xiàn)較高質量濃度的2，4－D 不利于刺槐懸浮細胞的增殖，而在附加了調節(jié)功能相比2，4－D 較弱的生長素NAA 的培養(yǎng)基中，細胞增殖速度明顯加快，且體系中細胞質量濃度顯著增大［16－17］。故較低質量濃度的NAA 與BA 組合更有利于刺槐胚性細胞系的建立。

褐化與染菌是植物懸浮細胞系建立過程中的普遍現(xiàn)象，張喜春等［18］在建立軟棗獼猴桃(Actinidia arguta)的懸浮系時曾發(fā)現(xiàn)，隨著生長期增加，細胞褐化發(fā)生的時間越短。本研究所得到的懸浮系最理想培養(yǎng)時間為20 d，當其培養(yǎng)時間超過20 d 時，細胞褐化頻率明顯增加。且懸浮系在建立過程中需通過不斷繼代與濾網(wǎng)篩選以剔除較大的原胚及難以分散的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的增長懸浮系染菌幾率也隨之增大，從而導致懸浮細胞在尚保持良好胚性的狀態(tài)下細胞總質量反而下降的現(xiàn)象出現(xiàn)［19－20］。

對于體細胞胚發(fā)生的調節(jié)方式，人們的了解目前僅限于對胚發(fā)育過程中的影響因子的探索及其調控手段的應用，對于單個體細胞和各細胞團塊在分裂發(fā)育時不同步的作用機制至今仍缺乏了解。雖然在本次試驗過程中，我們可以使體細胞胚停留于胚胎發(fā)育的某一階段，并在一定程度上控制其大小，但對于體細胞胚的質量仍無法高效迅速地進行篩選。在今后的試驗中，應結合分子手段，就體細胞胚發(fā)育不同步的內(nèi)部機制，外部環(huán)境因子與其內(nèi)部生理生化變化關系等方面進行更深入的研究。

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