顆粒蛋白前體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進展

陳佳喜 沈 波

一、TNF的簡介

TNF是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，按其存在狀態(tài)分2型:mTNF和 sTNF。膜結(jié)合 TNF(membrane-bound TNF，mTNF)即Ⅱ型跨膜蛋白TNF，在金屬蛋白酶水解作用下可變?yōu)榭扇苄訲NF(soluble TNF，sTNF)。研究發(fā)現(xiàn)，mTNF與sTNF間存在巨大的生物學(xué)功能差異:sTNF是急慢性炎性反應(yīng)過程中的促炎性因子;而mTNF在急慢性炎性反應(yīng)過程中能抑制炎癥的激活，已有研究報道m(xù)TNF能抑制自身免疫性腦脊髓炎、慢性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病[1，2]。

sTNF是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，按其結(jié)構(gòu)分為2型:TNF-α和TNF-β。TNF中發(fā)揮主要生物學(xué)活性的是腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-alpha，TNF-α)，主要由單核 -吞噬細(xì)胞分泌，其他如淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在一定條件下也具有產(chǎn)生和釋放TNF-α的能力。而腫瘤壞死因子 -β(tumor necrosisfactor-alpha，TNF-β)主要由活化的自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。TNF-α是一種促炎性細(xì)胞因子，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，有細(xì)胞毒和細(xì)胞溶解作用，并與其他細(xì)胞因子一起形成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)影響細(xì)胞的生長分化。

二、TNFR的簡介

TNF-α通過細(xì)胞膜上的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)發(fā)揮生物學(xué)活性，TNFR按相對分子質(zhì)量分為兩類，TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b)。它們的胞外區(qū)都含有4個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich-domain，CRD)，每個CRD由6個半胱氨酸組成，形成3對二硫鍵，CRD獨特的結(jié)構(gòu)決定TNF-α與TNFR之間的特異性結(jié)合，與TNF-α結(jié)合部位是CRD2和CRD3。TNFR1和TNFR2與各自配體結(jié)合，激活特異信號通路，參與不同的效應(yīng)。一般來說，TNFR1表達很廣泛，主要促進炎性反應(yīng)[3]。而TNFR2主要表達在淋巴細(xì)胞上，能刺激淋巴細(xì)胞的激活，此外它還能抑制Treg細(xì)胞的激活及其免疫抑制功能[4]。

三、TNF-TNFR信號通路簡介

TNFR1主要激活強烈的NF-κB信號通路從而介導(dǎo)胞內(nèi)死亡區(qū)域有效激活caspases通路，而TNFR2與TNFR1轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號通路相反:TNFR2缺乏死亡區(qū)域，只能通過經(jīng)典或非經(jīng)典的NF-κB信號通路激活細(xì)胞保護功能，抑制壞死通路介導(dǎo)細(xì)胞的死亡[5]。因此，TNFR2能抑制 TNFR1介導(dǎo)的促炎性反應(yīng)，在不同疾病動物模型中發(fā)揮神經(jīng)保護、組織修復(fù)功能[6]。

TNFR2在抗原激活、增生、生存中均發(fā)揮中要作用。最近，TNFR2信號通路還被證明能選擇性促進Treg細(xì)胞增生及其細(xì)胞功能的發(fā)揮[7]。mTNF致耐受性作用也被歸納為是通過TNFR2發(fā)揮。因此，免疫反應(yīng)中TNFR1與TNFR2介導(dǎo)不同的重要信號通路提示可通過靶向抗TNF-α治療。

四、PGRN的生物學(xué)效應(yīng)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)就能與TNFR2強烈結(jié)合，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療過程中起著重要的作用[8]。人PGRN蛋白由染色體17q21上 PGRN基因編碼，相對分子質(zhì)量為88kDa，含有7個半富含絲氨酸的串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(CX5-6CX5CC X8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5-6C)，該前體被蛋白酶水解后，生成7.5個高度保守、具有生物學(xué)活性的多肽片段，稱為顆粒蛋白[9]。目前，PGRN生物學(xué)效應(yīng)主要歸于促發(fā)育生長的作用和炎癥調(diào)控作用兩個方面。

1.促發(fā)育生長的作用:PGRN能夠調(diào)節(jié)健康組織的生長、維持、修復(fù)。在損傷的皮膚組織中，PGRN直接作用于成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，增加中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的聚集，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增生、分化和遷移，形成新生血管，加速傷口愈合。而在未損傷的組織中，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中均檢測不到 PGRN[10]。PGRN還參與腫瘤的形成和增生。遺傳性PGRN缺陷會導(dǎo)致癡呆和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，但PGRN增多也會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，如在乳腺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤患者外周血液中均發(fā)現(xiàn)PGRN的高水平表達，且可作為預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)、觀察療效的生物標(biāo)志物[11～14]。

2.炎癥調(diào)控作用:PGRN具有重要的抗炎作用，是TNF-α的潛在抑制劑。在動脈粥樣硬化患者頸動脈內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞標(biāo)本中存在PGRN表達，提示PGRN參與動脈粥樣硬化形成這一慢性炎癥過程，過表達PGRN或加入外源性重組PGRN均可減少平滑肌細(xì)胞IL-8的分泌，而PGRN基因敲除的細(xì)胞中IL-8水平明顯上升[15]。PGRN在控制自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的進程中也起到關(guān)鍵作用。已發(fā)現(xiàn)局部注射重組PGRN可使多種關(guān)節(jié)炎模型小鼠體內(nèi)中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)被抑制，提示PGRN是重要的炎性抑制因子。而且PGRN在關(guān)節(jié)炎性動物模型中可與TNF受體選擇性結(jié)合并抑制下游炎性通路信號，顯示出良好的抗炎治療效果[8]。最新多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的患者血清PGRN水平明顯高于正常人群，其高表達的機制可能提示機體慢性炎癥、免疫紊亂狀態(tài)[16～19]。

五、PGRN與TNFR2結(jié)合可抑制TNF-α的作用

鑒定PGRN與TNFR2特異性結(jié)合拮抗TNF-α信號可深入了解PGRN的作用及其作用機制，可為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等由TNF-α信號介導(dǎo)的疾病提供更好的治療方案。

通過全基因掃描后發(fā)現(xiàn)TNFR2確實是PGRN特異性受體[8]。TNF- α、PGRN 均可與 TNFR1、TNFR2結(jié)合，但 TNF-α與 TNFR1有更高的親和力，而PGRN與TNFR2有更高的親和力。因此PGRN可通過干擾TNF-α與TNFR受體結(jié)合拮抗TNF-α的信號通路。已報道，加入PGRN能抑制TNF-α介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞的激活、軟骨的降解。而且去除PGRN能顯著增加嗜中性粒細(xì)胞釋放H2O2，及骨髓來源的巨噬細(xì)胞釋放NO，加劇TNF-α介導(dǎo)的軟骨的破壞。

六、PGRN與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進展

為深入了解PGRN在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)的作用，實驗將小鼠體內(nèi)PGRN基因敲除，發(fā)現(xiàn)PGRN-/-缺陷小鼠在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)后能引發(fā)更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為100%的發(fā)生率，炎癥得分比PGRN基因不敲除的同種小鼠更高，骨、關(guān)節(jié)的破壞也更嚴(yán)重，而應(yīng)用重組的PGRN后能完全逆轉(zhuǎn)疾病的進展[8]。提示體內(nèi)PGRN表達缺失將更容易誘發(fā)關(guān)節(jié)炎，但可運用重組的PGRN逆轉(zhuǎn)。

為深入了解PGRN體內(nèi)抗炎作用是否通過抑制TNF-α信號介導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)TNF轉(zhuǎn)基因小鼠去除PGRN基因后將自發(fā)關(guān)節(jié)炎、去除PGRN基因后顯著加重已發(fā)的關(guān)節(jié)炎。雖然TNF轉(zhuǎn)基因小鼠能自發(fā)輕度癥狀的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，但相對TNF-Tg PGRN+/+12周齡的小鼠，TNF-Tg/PGRN-/-和TNF-Tg/PGRN+/-小鼠關(guān)節(jié)腫脹畸形嚴(yán)重影響活動(其滑膜炎癥、血管翳形成、關(guān)節(jié)破壞、軟骨基質(zhì)破壞明顯)。用重組的PGRN治療TNF-Tg小鼠能消除肉眼可見的關(guān)節(jié)炎和顯著降低炎癥得分，而停用重組的PGRN治療7天后又發(fā)展出肉眼可見的炎癥及增加炎癥得分[8]。

雖然PGRN有強烈的抗炎作用，但多種不良反應(yīng)限制了它在臨床的直接運用，如強致癌阻礙它的臨床應(yīng)用。因此研究人員設(shè)計了一種新型蛋白-拮抗TNFR受體抑制TNF/TNFR信號通路(antagonist of TNF/TNFR signaling via targeting to TNF receptors，Atsttrin)，簡稱為Atsttrin。這種蛋白由3個PGRN片段組成，具有選擇性的TNFR結(jié)合特性，之后他們利用Atsttrin和PGRN分別進行動物實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atsttrin具有更強的抑制關(guān)節(jié)炎的活性。并且Atsttrin有更少的不良反應(yīng)。事實已證明，運用高劑量的Atsttrin對橫紋肌肉瘤細(xì)胞株A673/6幾乎沒有細(xì)胞毒作用，而DBA1/J小鼠每天注射高劑量的Atsttrin，對其心、肺、胃、脾、胰腺、小腸、結(jié)腸均未觀察到不良反應(yīng)。

PGRN與TNF都是TNFR的配體，兩者存在競爭關(guān)系，它們之間的平衡能更好地解釋炎癥及腫瘤間的關(guān)系，例如TNF活性增加會增加RA等自身免疫性疾病的發(fā)生。反之，PGRN活性增加會增加細(xì)胞的過度增生甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?，F(xiàn)如今的TNF抑制劑大多與TNF結(jié)合，從而抑制TNF介導(dǎo)的炎性發(fā)生。但此治療過程必定會增強PGRN與TNFR的結(jié)合，而增強的PGRN活性將導(dǎo)致細(xì)胞的過度增生，最終可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。而Atsttrin能直接與TNFR結(jié)合，既能抑制TNF的作用，降低RA等自身免疫性疾病的發(fā)生，也能抑制PGRN的作用，降低細(xì)胞的過度增生甚至抑制腫瘤的發(fā)生[20]。

七、PGRN激活TNFR2信號通路

越來越多的研究已證實PGRN與Atsttrin通過TNFR2信號通路保護RA關(guān)節(jié)侵蝕的機制:①可通過拮抗TNF-α抑制炎性反應(yīng)，已證實PGRN與TNFR2的結(jié)合能力是TNF-α的600倍，因此PGRN與TNFR2的結(jié)合后可抑制炎癥的進展[20];②可通過刺激Treg細(xì)胞分化，已證實PGRN能促使原始細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化;③可通過TNFR2信號通路調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞功能，因為Treg細(xì)胞只能表達TNFR2，而不能表達TNFR1，因此能預(yù)防多種自身免疫性疾病，而且PGRN能保護Treg細(xì)胞免受TNF-α介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[7]。

八、展 望

PGRN是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性蛋白，同時也是TNFR2的一種配體，可作為TNF-α信號途徑的拮抗劑，從而擾亂TNF-α/TNFR1相互作用。已證明PGRN在小鼠炎癥關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)生過程中扮演了重要的角色。發(fā)明的Atsttrin作為PGRN的衍生物，不良反應(yīng)更少，且能更強地抑制RA的發(fā)病及炎癥進展。因為很多疾病都涉及TNF/TNFR信號通路，因此，拮抗此信號通路將能治療多種疾病，但目前針對PGRN的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍不完全清楚，對其細(xì)胞信號通路的深入研究，可架起連接二者的橋梁，加深對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的理解，將成為今后相關(guān)疾病的早期診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 Apostolaki M，Armaka M，Victoratos P，et al.Cellular mechanisms of TNF function in models of inflammation and autoimmunity[J].Curr Dir Autoimmun，2010，11:1-26

2 Alexopoulou L，Kranidioti K，Xanthoulea S，et al.Transmembrane TNF protects mutant mice against intracellular bacterial infections，chronic inflammation and autoimmunity[J].Eur J Immunol，2006，36(10):2768-2780

3 Locksley RM，Killeen N，Lenardo MJ，et al.The TNF and TNF receptor superfamilies:integrating mammalian biology[J].Cell，2001，104(4):487-501

4 Valencia X，Stephens G，Goldbach-Mansky R，et al.TNF downmodulates the function of human CD4+CD25hi T-regulatory cells[J].Blood，2006，108(1):253-261

5 Rauert H，Wicovsky A，Müller N，et al.Membrane tumor necrosis factor(TNF)induces p100 processing via TNF receptor-2(TNFR2)[J].J Biol Chem，2010，285(10):7394-7404

6 Nijholt IM，Granic I，Luiten PG，et al.TNFR2:target for therapeutics against neurodegenerative diseases?[J].Adv Exp Med Biol，2011，691:567-573

7 Chen X，Oppenheim JJ.Contrasting effects of TNF and anti-TNF on the activation of effector T cells and regulatory T cells in autoimmunity[J].FEBS Lett，2011，585(23):3611-3618

8 Tang W，Lu Y，Tian QY，et al.The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice[J].Science，2011，332:478-484

9 He Z，Bateman A.Progranulin(granulin-epithelin precursor，PC-cell-derived growth factor，acrogranin)mediates tissue repair and tumorigenesis[J].Journal of Molecular Medicine，2003，81(10):600-612

10 He Z，Ong CHP，Halper J，et al.Progranulin is a mediator of the wound response[J].Nature Medicine，2003，9(2):225-229

11 Tangkeangsirisin W，Serrero G.PC cell-derived growth factor(PCDGF/GP88，progranulin)stimulates migration，invasiveness and VEGF expression in breast cancer cells[J].Carcinogenesis，2004，25(9):1587-1592

12 Monami G，Gonzalez EM，Hellman M，et al.Proepithelin promotes migration and invasion of 5637 bladder cancer cells through the activation of ERK1/2 and the formation of a paxillin/FAK/ERK complex[J].Cancer Research，2006，66(14):7103-7110

13 Ren J，Li W，Yan L，et al.Expression of CIP2A in renal cell carcinomas correlates with tumour invasion metastasis and patients'survival[J].Br J Cancer，2011，105(12):1905-1911

14 Niemeri M，Kauko O，Sihto H，et al.CIP2A signature reveals the MYC dependency of CIP2A-regulated phenotypes and its clinical association with breast cancer subtypes[J].Oncogene，2012，31(39):4266-4278

15 Kojima Y，Ono K，Inoue K，et al.Progranulin expression in advanced human atherosclerotic plaque[J].Atherosclerosis，2009，206(1):102-108

16 Yamamoto Y，Takemura M，Serrero G，et al.Increased Serum GP88(Progranulin)Concentrations in Rheumatoid Arthritis[J].Inflammation，2014，[Epub ahead of print]

17 Tanaka A，Tsukamoto H，Mitoma H，et al.Serum progranulin levels are elevated in patients with systemic lupus erythematosus，reflecting disease activity[J].Arthritis Res Ther，2012，14(6):R244

18 Qu H，Deng H，Hu Z.Plasma progranulin concentrations are increased in patients with type 2 diabetes and obesity and correlated with insulin resistance[J].Mediators of Inflammation，2013，2013:360190

19 Thurner L，St?ger E，F(xiàn)adle N.Proinflammatory progranulin antibodies in inflammatory bowel diseases[J].Dig Dis Sci，2014，59(8):1733-1742

20 Chuan-ju Liu.Progranulin:a promising therapeutic target for rheumatoid arthritis[J].FEBS Lett，2011，585(23):3675-3680