牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷的研究進(jìn)展

陳海聰(綜述)，曾 榮，胡資兵(審校)

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，廣東 湛江 524000)

脊髓損傷后可導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)體功能紊亂甚至癱瘓或死亡，由于中樞神經(jīng)不可再生，該病治療結(jié)果不太理想。隨著干細(xì)胞理論的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植療法在脊髓損傷修復(fù)中具有重大潛能，不僅能減少脊髓細(xì)胞的凋亡，還可促進(jìn)患者損傷后功能的恢復(fù)[1-3]。目前胚胎干細(xì)胞[4]、臍帶血干細(xì)胞[5]、神經(jīng)干細(xì)胞[6]及間充質(zhì)干細(xì)胞[7]等被應(yīng)用于脊髓損傷的細(xì)胞治療，并且取得了一定療效。自2000年以來，牙髓干細(xì)胞逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。牙髓干細(xì)胞同擁有間充質(zhì)干細(xì)胞及神經(jīng)嵴干細(xì)胞的特性，能分化為神經(jīng)細(xì)胞以及其他類型的細(xì)胞，可作為一種新的種子干細(xì)胞用于脊髓損傷的治療。

1 牙髓干細(xì)胞

1.1牙髓干細(xì)胞的定義 干細(xì)胞是一類能自我復(fù)制，并且能夠分化成特定細(xì)胞類型的細(xì)胞[8]。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞[9]。2000年Gronthos等[10]利用酶消化法培養(yǎng)人第三磨牙牙髓組織，得到了有細(xì)胞克隆能力及高度增殖能力的細(xì)胞，通過和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)牙髓細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞極其相似的免疫表型及形成礦化結(jié)節(jié)的能力，同時(shí)還具有分化形成牙本質(zhì)及髓樣復(fù)合物的能力，從而提出了牙髓干細(xì)胞的概念。目前為止，有5種干細(xì)胞被證明存在于牙齒中，分別為牙髓干細(xì)胞[10]、脫落乳牙干細(xì)胞[11]、端突干細(xì)胞[12]、韌帶周圍干細(xì)胞[13]和牙囊祖細(xì)胞[14]。以上5種干細(xì)胞均具有自我更新和多向分化能力，并有較強(qiáng)的克隆能力。

1.2牙髓干細(xì)胞的表面標(biāo)記 明確干細(xì)胞表面分子標(biāo)記是分離鑒定干細(xì)胞的重要手段。對(duì)于牙髓干細(xì)胞，目前仍缺乏特異性標(biāo)記。來自中胚層細(xì)胞的標(biāo)志物基質(zhì)細(xì)胞抗原(STRO-1)及CD146在牙髓干細(xì)胞中均有表達(dá)，它們可用于牙髓干細(xì)胞未分化狀態(tài)的鑒定。多個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有極其相似的細(xì)胞表型[10,15-16]。免疫組織化學(xué)及流式細(xì)胞儀技術(shù)分析表明，牙髓干細(xì)胞可表達(dá)一系列間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物(如CD29、CD90、CD73、CD105)及表達(dá)部分神經(jīng)標(biāo)志物(如巢蛋白、β微管蛋白Ⅲ、神經(jīng)元核抗原、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、S100)，但不表達(dá)內(nèi)皮及造血標(biāo)志物(如CD14、CD34、CD45、CD11b、人白細(xì)胞DR抗原)[11,15]。

1.3牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性

1.3.1自我更新能力 干細(xì)胞的自我更新及增殖能力的重要標(biāo)準(zhǔn)是單一細(xì)胞的克隆形成率[17]。Gronthos等[10]對(duì)牙髓干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的比較發(fā)現(xiàn)，牙髓干細(xì)胞在培養(yǎng)14 d后較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成率。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)獼猴牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)14 d后克隆形成率達(dá)到90%，證明牙髓干細(xì)胞在體外有明顯的更新及增殖能力[18]。

1.3.2多重分化能力 牙髓干細(xì)胞具有多重分化能力，不僅能夠分化成牙質(zhì)細(xì)胞，還能向脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大鼠牙髓干細(xì)胞在一定條件下能夠分化成軟骨細(xì)胞，并且他們通過形態(tài)學(xué)、分子學(xué)及生物化學(xué)也證明了這一點(diǎn)[19]。

1.3.3免疫調(diào)節(jié)能力 如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，牙髓干細(xì)胞擁有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力。Yamaza等[20]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，牙髓干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，移植牙髓干細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性紊亂，它們主要通過抑制輔助性T細(xì)胞17起作用。

2 牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷

2.1牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷的特點(diǎn) 作為臨床應(yīng)用的理想干細(xì)胞來源，應(yīng)當(dāng)滿足一定的標(biāo)準(zhǔn)，如容易獲取、倫理上容易接受、安全的生物學(xué)性能、費(fèi)用合適及具有近期、遠(yuǎn)期治療效果。牙髓干細(xì)胞具有的特點(diǎn)[21]：來源廣泛、容易取得、無創(chuàng)；相對(duì)于其他成體干細(xì)胞，分離提取安全、容易；擁有間充質(zhì)細(xì)胞特性同時(shí)也具有神經(jīng)細(xì)胞特性，可以分化成為功能神經(jīng)元；具有神經(jīng)保護(hù)作用；能夠長(zhǎng)期低溫儲(chǔ)存；倫理上無爭(zhēng)議。

2.2牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷的理論基礎(chǔ)——體外神經(jīng)分化 作為來源于神經(jīng)嵴細(xì)胞的牙髓干細(xì)胞，已被證明能表達(dá)多種神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物，說明其具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能，相對(duì)于其他類型的干細(xì)胞，其具有更加明顯的神經(jīng)分化能力[11,15]。2004年，美國(guó)及瑞典學(xué)者發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)，能夠促進(jìn)多巴胺神經(jīng)的存活，同時(shí)發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞能分化成神經(jīng)細(xì)胞，可應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[22]。2008年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在一定的神經(jīng)誘導(dǎo)條件下，牙髓干細(xì)胞能夠形成神經(jīng)元的形態(tài)，并在基因及蛋白水平下表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物，展現(xiàn)出能夠產(chǎn)生與功能性神經(jīng)細(xì)胞相符合的鈉電流能力，甚至把牙髓干細(xì)胞移植至中腦后也發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)元的形態(tài)及表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物，這些證據(jù)說明牙髓干細(xì)胞具有治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛能[23]。2011年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在一定的生長(zhǎng)因子作用下，免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞很快就表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞早期標(biāo)志物(巢蛋白及β微管蛋白Ⅲ)，隨后表達(dá)中期及成熟神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物，同時(shí)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)各種神經(jīng)標(biāo)志物明顯上調(diào)[24]。干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷主要通過以下途徑：替代受損神經(jīng)細(xì)胞；通過釋放生長(zhǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)再生。以上實(shí)驗(yàn)表明，牙髓干細(xì)胞在一定的作用條件下，能夠分化為功能神經(jīng)細(xì)胞，起到神經(jīng)替代作用，同時(shí)也能分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，激活體內(nèi)處于休眠及受損的神經(jīng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)功能。牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的分子機(jī)制與信號(hào)調(diào)控通路尚不清楚。

2.3牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷的應(yīng)用——?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn) 目前，脊髓損傷修復(fù)的研究主要圍繞以下幾個(gè)方面進(jìn)行[25]：誘導(dǎo)受損的神經(jīng)纖維再生，如直接給予多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)其表達(dá)，為再生軸突提供橋梁；填充空洞和消除瘢痕組織；去除軸突生長(zhǎng)抑制因子、髓磷脂相關(guān)糖蛋白與少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓磷脂糖蛋白等抑制軸突生長(zhǎng)的因素。上述方法的臨床療效尚不理想，近年來隨著干細(xì)胞研究的發(fā)展及進(jìn)步，干細(xì)胞開始應(yīng)用于神經(jīng)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并取得了一定效果。牙髓干細(xì)胞作為新的種子干細(xì)胞也開始被應(yīng)用于脊髓損傷的修復(fù)。

最初，研究者發(fā)現(xiàn)給脊髓半切模型的大鼠移植大鼠牙髓組織，然后通過熒光金標(biāo)記法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變化，發(fā)現(xiàn)移植牙髓組織的大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活量顯著高于對(duì)照組，約增高115%倍，他們還發(fā)現(xiàn)移植的牙髓組織表達(dá)的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子顯著增高，表明移植的牙髓細(xì)胞主要通過分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的存活[26]。從Gronthos發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞的存在以來，經(jīng)過10余年的發(fā)展，牙髓干細(xì)胞的研究愈加深入，已經(jīng)被科學(xué)家應(yīng)用于組織工程研究，如骨缺損修復(fù)、牙齒的修復(fù)，當(dāng)然也包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[27-28]。2011年有科學(xué)家稱，通過移植未分化人脫落乳牙干細(xì)胞能夠促進(jìn)急性脊髓損傷大鼠功能恢復(fù)，發(fā)現(xiàn)移植牙髓干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞分化及增殖[29]。研究人員發(fā)現(xiàn)移植牙髓干細(xì)胞能夠通過多重神經(jīng)再生機(jī)制，促進(jìn)脊髓橫斷大鼠后肢功能的恢復(fù)，作用機(jī)制包括抑制脊髓損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡；通過抑制多重軸突生長(zhǎng)抑制因子的作用促進(jìn)軸突的再生；牙髓干細(xì)胞能夠分化成成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，起到神經(jīng)替代作用[15]。從牙髓組織移植治療脊髓損傷到牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均取得了顯著效果，能夠改善動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力，表明牙髓干細(xì)胞可作為治療脊髓損傷不可或缺的干細(xì)胞來源。在進(jìn)入人體應(yīng)用之前，還需要更多的實(shí)驗(yàn)明確牙髓干細(xì)胞在脊髓修復(fù)中的作用機(jī)制。

3 牙髓干細(xì)胞庫(kù)

牙髓干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建包括三個(gè)步驟：牙齒的收集、牙髓干細(xì)胞的分離及牙髓干細(xì)胞的貯藏。這些步驟簡(jiǎn)單而相對(duì)無創(chuàng)，在低溫貯藏后牙髓干細(xì)胞仍然具有明顯的自我增殖及多向分化能力[30]。乳恒牙替換是一個(gè)正常的生理現(xiàn)象，相對(duì)其他干細(xì)胞的來源，從牙髓中獲取干細(xì)胞能避免倫理學(xué)爭(zhēng)議。從脫落的乳牙牙髓中分離培養(yǎng)干細(xì)胞用于貯藏，構(gòu)建“牙髓干細(xì)胞庫(kù)”是可行的。牙髓干細(xì)胞能分化成多種細(xì)胞，可應(yīng)用于多種疾病的治療，包括神經(jīng)退行性病變、脊髓損傷、糖尿病、心血管疾病、免疫性疾病及骨骼肌肉疾病等。在患者年輕及健康時(shí)，貯藏他們的牙髓干細(xì)胞是必要的。牙髓干細(xì)胞庫(kù)在發(fā)達(dá)國(guó)家應(yīng)運(yùn)而生。

世界上第一家牙髓干細(xì)胞庫(kù)首先出現(xiàn)于美國(guó)，總部設(shè)在奧斯汀的美國(guó)BioEden公司，同時(shí)在英國(guó)及泰國(guó)建立了他們的國(guó)際實(shí)驗(yàn)室，并且向澳大利亞、俄羅斯、印度及中東地區(qū)進(jìn)行推廣。目前，牙髓干細(xì)胞庫(kù)在發(fā)達(dá)國(guó)家開始流行。日本廣島大學(xué)成立了日本首家牙髓干細(xì)胞庫(kù)，緊接著名古屋大學(xué)也成立了他們的牙髓干細(xì)胞庫(kù)。2008年，臺(tái)北醫(yī)科大學(xué)與日本廣島大學(xué)合作成立了臺(tái)灣地區(qū)首家牙髓干細(xì)胞庫(kù)，同年挪威也成立了他們的牙髓干細(xì)胞庫(kù)[31]。目前我國(guó)的牙髓干細(xì)胞庫(kù)正處于開始時(shí)期，有待進(jìn)一步發(fā)展。

4 牙髓干細(xì)胞研究前景

2004年的調(diào)查顯示，全球范圍內(nèi)接近有600萬脊髓損傷患者，每年每100萬人就有15～40新增病例[32]。2009年時(shí)，美國(guó)大概有100萬脊髓損傷患者，每年新增1.2萬病例[33]。2010年加拿大的調(diào)查顯示，整個(gè)國(guó)家約有85萬脊髓損傷患者，每年新增約3700病例[34]。牙髓干細(xì)胞是存在于牙髓組織中的成體干細(xì)胞，可分化形成多種細(xì)胞類型，牙髓干細(xì)胞具有重要的治療潛力。牙髓干細(xì)胞已應(yīng)用于牙齒及顱面細(xì)胞的重建。目前研究認(rèn)為，牙髓干細(xì)胞將有望應(yīng)用到更加廣泛的醫(yī)學(xué)再生領(lǐng)域，尤其是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，包括脊髓損傷。牙髓干細(xì)胞分離、提取方便，保存容易，價(jià)格便宜，許多發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)建立了“牙髓干細(xì)胞庫(kù)”[31]。牙髓干細(xì)胞是臍帶血干細(xì)胞的補(bǔ)充，能夠修復(fù)結(jié)締組織、牙質(zhì)組織、神經(jīng)組織及骨組織。作為一種成體干細(xì)胞，牙髓干細(xì)胞避免了像胚胎干細(xì)胞方面的倫理學(xué)爭(zhēng)論[31]。我國(guó)應(yīng)當(dāng)嘗試建立自己的“牙髓干細(xì)胞庫(kù)”。

相對(duì)于其他干細(xì)胞，目前對(duì)牙髓干細(xì)胞的研究較少，起步較晚，還有許多問題需要解決。首先，目前牙髓干細(xì)胞缺乏明確的標(biāo)志物，其分離鑒定難度大；其次，牙髓干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化機(jī)制尚未明確，還待進(jìn)一步闡明；最后，牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷的時(shí)機(jī)選擇、用量選擇及使用部位選擇等需要進(jìn)一步明確。這些問題還需要深入的探討及解決，只有牙髓干細(xì)胞的研究日趨完善，其應(yīng)用于臨床才能逐漸實(shí)現(xiàn)。

5 小 結(jié)

脊髓損傷治療仍然是世界性難題，干細(xì)胞移植治療帶來了新的希望。作為來源于神經(jīng)嵴細(xì)胞的牙髓干細(xì)胞，更容易分化為神經(jīng)細(xì)胞。多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，牙髓干細(xì)胞能夠在脊髓中遷移并且分化為神經(jīng)細(xì)胞，改善動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能[15,29]。然而，牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)：如何獲取大量性質(zhì)穩(wěn)定的牙髓干細(xì)胞；牙髓干細(xì)胞治療脊髓損傷的機(jī)制；充分的臨床試驗(yàn)。脊髓損傷發(fā)生后其病理生理過程會(huì)出現(xiàn)缺血壞死、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)，最后導(dǎo)致脊髓空洞或者囊腫形成，因此針對(duì)其病理生理特點(diǎn)，牙髓干細(xì)胞聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子或者相關(guān)的細(xì)胞因子治療脊髓損傷可能會(huì)取得更加明顯的效果。

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