高原低氧適應(yīng)與EPAS1/HIF-2α及EGLN1/PHD2的相關(guān)性

李雪冰(綜述)，李福祥，肖貞良(審校)

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000； 2.成都軍區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，成都 610083；3.成都軍區(qū)總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，成都 610083)

大氣氧分壓隨著海拔升高而降低，在高原地區(qū)學(xué)習(xí)工作生活的人們必將面對高原低氧環(huán)境所帶來的種種不適。當(dāng)機(jī)體無法完全適應(yīng)時(shí)就可能導(dǎo)致急、慢性高原病的發(fā)生。并非所有居住于高原的人都將發(fā)生高原病。喜馬拉雅山脈的藏族人、安第斯高原的安第斯人已世居高原數(shù)千年，形成了各自的可繼承低氧抵抗策略。藏族作為高原低氧適應(yīng)的代表，被公認(rèn)為能更好的適應(yīng)高海拔環(huán)境。藏族人群表現(xiàn)出較高的一氧化氮水平，較大的靜息狀態(tài)下通氣量和較強(qiáng)的低氧通氣反應(yīng)，較高的出生體質(zhì)量，以及與海平面居住人群相近的血紅蛋白濃度，反映出其對高原環(huán)境獨(dú)特的適應(yīng)性[1-3]。為了揭示潛藏于這種生命現(xiàn)象的遺傳基礎(chǔ)，各國科研工作者展開了對低氧信號相關(guān)通路基因的系列研究。作為當(dāng)前最熱門的高原低氧適應(yīng)的自然選擇候選基因EPAS1(endothelial PAS domain protein 1)/低氧誘導(dǎo)因子2α(hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α)和EGLN1/PHD2(egl-9 family hypoxia-inducible factor 1)成為了研究熱點(diǎn)[4]。

1 EPAS1/HIF-2α基因相關(guān)研究

高原反應(yīng)的本質(zhì)是低氧反應(yīng)，即當(dāng)生活在低海拔地區(qū)的人移居高海拔地區(qū)時(shí)，為適應(yīng)高原低氧而作出的一連串病理生理改變。其中較為突出及重要的環(huán)節(jié)就是為獲得更多氧氣而加速制造的血紅蛋白。與其相比，大多數(shù)世居高原藏族人群卻始終保持著較低的血紅蛋白水平。為了揭示這一遺傳變異，Beall等[5]應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析法對藏族和漢族樣本人群進(jìn)行基因組比較，發(fā)現(xiàn)位于第2號染色體EPAS1/HIF-2α下游366 bp至235 kb之間的8個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)在藏族人群中更普遍，并呈現(xiàn)高度成對的連鎖不平衡(0.23

Simonson等[10]同樣比較了藏族人與低海拔亞洲人的基因數(shù)據(jù)，他們通過掃描挑選Gene Ontology和Panther數(shù)據(jù)庫的活躍的基因片段(之所以掃描這些基因，是因?yàn)樗鼈兌紖⑴c了體內(nèi)氧平衡傳導(dǎo)通路的構(gòu)成，或者參與進(jìn)了其他被疑為在高海拔適應(yīng)中的重要通路)，找到了247個(gè)先驗(yàn)的候選基因，再通過雜交群體擴(kuò)展單體型純合子統(tǒng)計(jì)法及集成單體型評分統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)共有10個(gè)基因片段顯示出與高海拔低氧適應(yīng)相關(guān)，其中包含Beall等[15]所識別的EPAS1/HIF-2α基因，結(jié)果提示，在每一個(gè)基因片段中至少有一種變異可能是因?yàn)楦吆０苇h(huán)境的影響，已經(jīng)歷近代顯著且有利的自然選擇。雖然EPAS1/HIF-2α也位列在這些基因中，但此項(xiàng)研究并未發(fā)現(xiàn)其與藏族人群血紅蛋白水平具有相關(guān)性。因此推測，造成此兩組研究結(jié)果上的差異可能與樣本數(shù)量、影響血紅蛋白水平外界因素及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法的不同有關(guān)。

Bigham等[11]調(diào)查了青藏高原藏族與安第斯山區(qū)人群基因組中近100萬個(gè)SNPs，并且在這兩個(gè)高海拔人群組中進(jìn)行了一連串的基因組范圍內(nèi)的自然選擇測試，在引入低海拔亞洲人群基因數(shù)據(jù)比較后發(fā)現(xiàn)，包含有EPAS1/HIF-2α的基因片段在青藏高原藏族和低海拔亞洲人群之間表現(xiàn)出顯著差異，而與安第斯山人間差異不明顯，從側(cè)面反映了EPAS1/HIF-2α基因中可能存在藏族高海拔適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)。

Yi等[12]對來自青藏高原海拔≥4300 m兩個(gè)村莊的50名相互沒有任何關(guān)系的藏族個(gè)體進(jìn)行了外顯子測序，內(nèi)容包含人類基因92%的編碼序列，在與來自北京的40名漢族個(gè)體(所有漢族個(gè)體幾乎全部來自海拔2000 m以下，為低海拔亞洲人群樣本的一部分)的外顯子數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，人群間許多SNPs在漢族中表現(xiàn)低頻，而在藏族中表現(xiàn)中頻，為了確定究竟哪種人群受到了自然選擇的影響，小組使用藏、漢及丹麥三組之間等位基因頻率成對比較的人口分支統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，估測自藏漢分化后(通過兩人群中同義突變位點(diǎn)的二維頻譜估算人群歷史模型，推測最初漢族可能是藏族的一個(gè)小分支，其分化時(shí)間可能在2750年以前。)頻率的改變主要發(fā)生在藏族人群中，并且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來自EPAS1/HIF-2α基因的自然選擇強(qiáng)信號，恰好位于該基因上游第6外顯子內(nèi)具有顯著頻率差異的SNP?；谌齻€(gè)人群頻率差異，研究小組推測該基因較其他基因更早的存在于藏族人群中。隨后Yi等[12]對該SNP進(jìn)行了關(guān)聯(lián)測試，結(jié)果顯示，其與紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白水平存在相關(guān)性，這又一次提示在藏族高原適應(yīng)中，EPAS1/HIF-2α可能有著非比尋常的作用。另外，盡管Yi等[12]的測序主要以外顯子為標(biāo)靶，但是一些側(cè)翼內(nèi)含子和非編碼區(qū)序列也包含在內(nèi)，在對其進(jìn)行測序時(shí)，在EPAS1/HIF-2α序列中還意外地識別出了一個(gè)最強(qiáng)自然選擇信號，一個(gè)位于EPAS1/HIF-2α基因中的SNP內(nèi)含子，在藏(87%)漢(9%)兩組之間擁有最大的等位基因頻率差異。對于其功能現(xiàn)仍然未知，尚需進(jìn)一步的研究。推測自然選擇可能已直接作用于該變異，或另一聯(lián)結(jié)的非編碼變異來影響EPAS1/HIF-2α的表達(dá)，從而影響基因攜帶者的高海拔適應(yīng)能力。

2 EGLN1/PHD2基因相關(guān)研究

青藏高原并非唯一一個(gè)有人類居住的高原。在世界范圍內(nèi)，還有許許多多高海拔地區(qū)早已遍布人類的足跡。被認(rèn)為同樣能夠較好地適應(yīng)高原環(huán)境的安第斯高原世居人群，卻在高海拔適應(yīng)中表現(xiàn)出與藏族截然相反的血紅蛋白水平[13]。Bingham等[11]在對同屬安第斯高原世居人群的蓋丘亞族人和艾馬拉人的基因進(jìn)行測試，并將結(jié)果與藏族基因數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，雖然安第斯高原世居人群與青藏高原藏族世居人群在不同的基因或基因區(qū)域都表現(xiàn)出了積極的自然選擇證據(jù)，但他們在基因適應(yīng)模式上是不同的，較藏族、安第斯高原世居者中更多的染色體片段表現(xiàn)出對環(huán)境的積極適應(yīng)(37VS34)，且這些片段相互間不存在共享，對一個(gè)預(yù)先知道在細(xì)胞氧感知中有著重要作用的EGLN1/PHD2基因的分析也同樣驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。無論是在安第斯高原人群還是在青藏高原藏族人群中，EGLN1/PHD2都表現(xiàn)出了積極的自然選擇證據(jù)，但其在兩人群間的變異是不同的?？紤]到安第斯高原人群很可能早在兩萬年前就產(chǎn)生了分化，并且在伯尼吉亞和北美平原南部的安第斯高原人群先祖移民中，看起來并不享有與青藏高原藏族共同的高海拔基因。因此推測，兩人群中EGLN1/PHD2的變異在他們最先進(jìn)入高原地區(qū)時(shí)就已經(jīng)各自發(fā)生且保留了下來。支持這一觀點(diǎn)的進(jìn)一步證據(jù)來自于小組的又一發(fā)現(xiàn)，即不同人群在其各自的基因組片段中擁有圍繞于EGLN1/PHD2周圍單一的、獨(dú)特的，且具有主導(dǎo)性的單體型[11,14]。EGLN1/PHD2是否在某種程度上分別參與了安第斯高原人群和青藏高原藏族的高原適應(yīng)策略，是一個(gè)值得探索的問題。

在印度，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)阿育吠陀歷史源遠(yuǎn)流長沿用至今。其關(guān)于體質(zhì)的概念體現(xiàn)了正常個(gè)體間的表型差異，包括對環(huán)境刺激的反應(yīng)以及對疾病的易患性。有關(guān)體質(zhì)的分類主要有三種：瓦塔、皮塔、卡法。在這三種體質(zhì)當(dāng)中，EGLN1/PHD2是251個(gè)區(qū)別表達(dá)基因中的一個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)，EGLN1/PHD2中的普通變異rs479200(C/T)和rs480902(T/C)與高海拔適應(yīng)存在相關(guān)性[15]。如rs479200(C/T)的TT基因型更頻繁的出現(xiàn)在卡法體質(zhì)中，并且與EGLN1/PHD2的高表達(dá)相關(guān)，除此而外與患者患高原肺水腫也有關(guān)系，而這個(gè)基因型卻在皮塔體質(zhì)中表現(xiàn)低頻，并且不存在于高海拔當(dāng)?shù)鼐用癞?dāng)中。另有人類基因組多樣性中心數(shù)據(jù)和印度基因組變異資料分析顯示，在高海拔地區(qū)，不同的基因家系共享一個(gè)同樣先祖的rs480902等位基因(T)，而這個(gè)基因型在皮塔體質(zhì)中有較多的表現(xiàn)，并且在全球范圍內(nèi)這個(gè)基因型與海拔有關(guān)[15]。這些研究都揭示了EGLN1/PHD2基因中可能存在高原適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)。

對我國藏族高海拔基因適應(yīng)的研究中，Simonson等[10]發(fā)現(xiàn)的10個(gè)相關(guān)基因中的EGLN1/PHD2基因，是唯一一個(gè)同時(shí)被雜交群體擴(kuò)展單體型純合子統(tǒng)計(jì)法與集成單體型評分統(tǒng)計(jì)測試識別的。存在于該基因的變異顯示出來的與血紅蛋白水平的關(guān)系，也同樣驗(yàn)證了其可能存在高海拔低氧適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)。

3 關(guān)于EPAS1/HIF-2α與EGLN1/PHD2高海拔適應(yīng)的其他研究

為了識別出藏族基因組中的高海拔適應(yīng)信號，Xu等[16]對存在于藏(46例)漢(92例)兩族基因組中100萬個(gè)SNPs進(jìn)行了等位基因頻率的分析研究，在一個(gè)Fst>0.30的SNPs前0.0001%中識別出了來自EPAS1/HIF-2α的25個(gè)SNPs和來自EGLN1/PHD2的6個(gè)SNPs，這些不同的SNP位于同一區(qū)域之中，顯示出了其較所期望的更大的連鎖不平衡，同時(shí)也減少了單體型的多樣性，這都與占主導(dǎo)地位的單體型和關(guān)于自然選擇范圍的證據(jù)相一致，而對這兩種基因中占主導(dǎo)地位的單體型，較其他種族而言更普遍地存在于藏族中的研究發(fā)現(xiàn)，則更加確信了EPAS1/HIF-2α和EGLN1/PHD2基因在高原適應(yīng)中的作用，在東亞，這兩種基因中占主導(dǎo)地位的單體型頻率與海拔高度也同樣密切相關(guān)。

進(jìn)一步有關(guān)EPAS1/HIF-2α和EGLN1/PHD2基因在藏族高海拔適應(yīng)中扮演重要角色的證據(jù)來自Peng等[17]的研究，對50名隨機(jī)挑選自青藏高原7個(gè)不同藏族人群的藏族人進(jìn)行了SNPs分類，并把所得結(jié)果與人類基因組單體型圖數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)作了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPAS1/HIF-2α基因是藏族中經(jīng)歷了自然選擇后留下的眾多基因中的一個(gè)，并且因?yàn)樗且粋€(gè)較早被識別出的基因，該研究對這50名藏族人中EPAS1/HIF-2α基因進(jìn)行了測序，關(guān)于EPAS1/HIF-2α基因的序列分析顯示，在這個(gè)區(qū)域內(nèi)，超過半數(shù)的SNPs頻率在藏和漢日之間有相當(dāng)?shù)牟町?125個(gè)人類基因組單體型單核苷酸多態(tài)性中，69個(gè)的頻率顯著不同于中國北京/日本東京人群)；另外，研究發(fā)現(xiàn)在1334個(gè)藏族人中存在著來自EPAS1/HIF-2α的三個(gè)SNPs和來自EGLN1/PHD2的三個(gè)SNPs，以及來自PPARA的三個(gè)SNPs；研究還發(fā)現(xiàn)來自EPAS1/HIF-2α的三個(gè)SNPs和來自EGLN1/PHD2的一個(gè)SNP的等位基因頻率顯著不同于中國北京/日本東京人群，進(jìn)一步證實(shí)了在EPAS1/HIF-2α及EGLN1/PHD2中存在顯著的自然選擇，通過序列信息估算出了一個(gè)藏漢間的分歧時(shí)間，這個(gè)時(shí)間是外顯子研究所估計(jì)的6倍。

4 高原低氧適應(yīng)基因研究的未來

盡管綜上研究在高海拔研究領(lǐng)域又前進(jìn)了一步，但還是始終未能找到功能性編碼變異體的證據(jù)。進(jìn)一步的研究應(yīng)把重點(diǎn)放在努力闡述存在于基因序列中的基因及功能基礎(chǔ)上，明確是否存在精確的基因相似點(diǎn)等。研究也將同樣幫助闡明這些基因中的某些變異是否是由于低氧供所致的不適應(yīng)反應(yīng)。這些研究結(jié)果的意義將不僅僅限于高原病范疇，而且與臨床病理學(xué)也有著密切的聯(lián)系[18]。除了高海拔適應(yīng)生理學(xué)及分子學(xué)方面，世居高原人群的基因研究還將為進(jìn)化過程提供有價(jià)值的見解，例如了解自然選擇是怎樣整合協(xié)調(diào)人類生物學(xué)改變以及這種調(diào)整有多少是基于異常的或者顯著的基因突變。自然選擇信號的不同是否反映了人群歷史的多樣性等。

5 小 結(jié)

盡管對藏漢人群在歷史上的分化時(shí)間各執(zhí)一詞，他們?nèi)员徽J(rèn)為擁有一共同的祖先[12,17,19-20]。所以任何兩人群間基因結(jié)構(gòu)的不同更可能來自各自環(huán)境中的自然選擇。通過比較人群間個(gè)體變異頻率或人群間區(qū)域性連鎖不平衡模式及單體型多樣性模式，雖然各項(xiàng)研究在識別這些基因信號時(shí)所使用的技術(shù)方法略有不同，但他們都不約而同地將在高海拔適應(yīng)中扮演重要角色的EPAS1/HIF-2α及鄰近的EGLN1/PHD2識別為自然選擇的候選基因，說明了這些基因中的變異在藏族高原適應(yīng)中的關(guān)鍵作用。

[1] Wu T,Wang X,Wei C,etal.Hemoglobin levels in Qinghai-Tibet:different effects of gender for Tibetans vs.Han[J].J Appl Physiol(1985),2005,98(2):598-604.

[2] Beall CM.Two routes to functional adaptation:Tibetan and Andean high-altitude natives[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104 Suppl 1:8655-8660.

[3] Moore LG.Human genetic adaptation to high altitude[J].High Alt Med Biol,2001,2(2):257-279.

[4] Semenza GL.Involvement of oxygen-sensing pathways in physiologic and pathologic erythropoiesis[J].Blood,2009,114(10):2015-2019.

[5] Beall CM,Cavalleri GL,Deng L,etal.Natural selection on EPAS1(HIF2alpha) associated with low hemoglobin concentration in Tibetan highlanders[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(25):11459-11464.

[6] Gale DP,Harten SK,Reid CD,etal.Autosomal dominant erythrocytosis and pulmonary arterial hypertension associated with an activating HIF2 alpha mutation[J].Blood,2008,112(3):919-921.

[7] Warnecke C,Zaborowska Z,Kurreck J,etal.Differentiating the functional role of hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha and HIF-2alpha(EPAS-1) by the use of RNA interference:erythropoietin is a HIF-2alpha target gene in Hep3B and Kelly cells[J].FASEB J,2004,18(12):1462-1464.

[8] Hickey MM,Lam JC,Bezman NA,etal.von Hippel-Lindau mutation in mice recapitulates Chuvash polycythemia via hypoxia-inducible factor-2alpha signaling and splenic erythropoiesis[J].J Clin Invest,2007,117(12):3879-3889.

[9] Wiesener MS,Jürgensen JS,Rosenberger C,etal.Widespread hypoxia-inducible expression of HIF-2alpha in distinct cell populations of different organs[J].FASEB J,2003,17(2):271-273.

[10] Simonson TS,Yang Y,Huff CD,etal.Genetic evidence for high-altitude adaptation in Tibet[J].Science,2010,329(5987):72-75.

[11] Bigham A,Bauchet M,Pinto D,etal.Identifying signatures of natural selection in Tibetan and Andean populations using dense genome scan data[J].PLoS Genet,2010,6(9):e1001116.

[12] Yi X,Liang Y,Huerta-Sanchez E,etal.Sequencing of 50 human exomes reveals adaptation to high altitude[J].Science,2010,329(5987):75-78.

[13] Beall CM,Brittenham GM,Strohl KP,etal.Hemoglobin concentration of high-altitude Tibetans and Bolivian Aymara[J].Am J Phys Anthropol,1998,106(3):385-400.

[14] Bigham AW,Mao X,Mei R,etal.Identifying positive selection candidate loci for high-altitude adaptation in Andean populations[J].Hum Genomics,2009,4(2):79-90.

[15] Aggarwal S,Negi S,Jha P,etal.EGLN1 involvement in high-altitude adaptation revealed through genetic analysis of extreme constitution types defined in Ayurveda[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(44):18961-18966.

[16] Xu S,Li S,Yang Y,etal.A genome-wide search for signals of high-altitude adaptation in Tibetans[J].Mol Biol Evol,2011,28(2):1003-1011.

[17] Peng Y,Yang Z,Zhang H,etal.Genetic variations in Tibetan populations and high-altitude adaptation at the Himalayas[J].Mol Biol Evol,2011,28(2):1075-1081.

[18] Majmundar AJ,Wong WJ,Simon MC.Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J].Mol Cell,2010,40(2):294-309.

[19] Aldenderfer M.Peopling the Tibetan plateau:insights from archaeology[J].High Alt Med Biol,2011,12(2):141-147.

[20] Brantingham PJ,Rhode D,Madsen DB Archaeology augments Tibet′s genetic history[J].Science,2010,329(5998):1467-1468.