惡性間皮瘤的分子生物學(xué)研究進展

姚銀麗 徐偉珍 毛偉敏

惡性間皮瘤(malignant mesothelioma，MM)是一種高侵襲性的腫瘤，預(yù)后極差。石棉暴露是目前認(rèn)為與間皮瘤發(fā)生、發(fā)展較為密切的致病因素。由于20世紀(jì)50～70年代石棉材料的廣泛應(yīng)用，我國間皮瘤的發(fā)生率有上升趨勢，為(0.1～0.6)/10萬，由于我國的人口基數(shù)龐大，總的發(fā)病人數(shù)多于其他國家。目前治療惡性間皮瘤的療效不佳，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已無手術(shù)機會。腫瘤的快速進展以及目前尚無明確有效的治療方案使得MM患者的中位生存期只有12個月。雖然距離MM首次報道已經(jīng)過去50多年，但目前仍沒有建立起最優(yōu)治療策略，對MM的診斷、分期以及治療仍然困難重重。近幾年來，對惡性間皮瘤的分子生物學(xué)研究逐漸成為熱點。檢測MM發(fā)生、發(fā)展過程中基因表達改變，抑癌基因和癌基因的變異，以及研究高危人群致癌過程的有效標(biāo)志物，將對MM的診斷、治療及預(yù)后具有重要的意義。本文就惡性間皮瘤流行病學(xué)特征、潛在分子靶點的發(fā)現(xiàn)及研究進展做一綜述。

一、惡性間皮瘤的流行病學(xué)特征

惡性間皮瘤是一種來源于間皮細胞的原發(fā)腫瘤，它可發(fā)生在胸膜、心包膜、腹膜和卵巢上皮細胞，其中惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma，MPM)發(fā)生率約占間皮瘤的70%[1]。在組織病理學(xué)上分為上皮型、肉瘤型、混合型(雙向型)3大類，預(yù)后均極差。石棉暴露是目前認(rèn)為與間皮瘤發(fā)生、發(fā)展較為密切的致病因素。自從1960年，Wagner首次報道石棉接觸與MM的相關(guān)性后，陸續(xù)有研究證實世界上石棉采礦工人MM高發(fā)，有石棉暴露史的人群中MM的發(fā)生率可達到100/(百萬·年)，而正常人群中MM的發(fā)生率只有1/(百萬·年)，且由于職業(yè)因素，男性MM的發(fā)生率遠高于女性。石棉已被國際癌癥研究中心(IARC)確認(rèn)為致癌物。石棉纖維暴露可誘發(fā)間皮細胞內(nèi)DNA損傷及染色體異常[3]。間皮細胞能吞噬石棉纖維，石棉纖維與染色體或紡錘體纏繞，干擾有絲分裂過程，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)異常和間皮細胞內(nèi)非整倍體的形成。石棉纖維能吸收各種蛋白質(zhì)和化學(xué)物質(zhì)于表面，導(dǎo)致有害物質(zhì)的積累，其中包括致癌物。石棉纖維還結(jié)合重要的細胞蛋白，對于正常間皮細胞，這些蛋白的缺失可能是有害的。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，石棉纖維暴露后引發(fā)由大量單核-吞噬細胞組成的炎性反應(yīng)，巨噬細胞吞噬纖維，但不能將其消化，并釋放各種細胞因子和生長因子，從而誘導(dǎo)炎癥和腫瘤的產(chǎn)生[4]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α及NF-κB通路在石棉致間皮瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起了關(guān)鍵作用[5]。接觸石棉到MM的確診有40年的潛伏期[6]。因此，在該潛伏期內(nèi)，防止石棉采礦工人再次接觸石棉，在很大程度上可能降低其發(fā)生率及病死率。雖然許多發(fā)達國家及一些發(fā)展中國家已禁止石棉的生產(chǎn)及銷售，但由于潛伏期的影響，近幾年MM的發(fā)生率及病死率仍呈不斷上升趨勢。作為世界上最大的石棉消費國，不久的將來，中國可能會遭遇MM的發(fā)病高峰。盡管關(guān)于石棉如何致MM發(fā)生的可能機制已被探討，但準(zhǔn)確的發(fā)病機制仍需要進一步探索。除石棉暴露以外，目前還發(fā)現(xiàn)放射線照射、接觸其他礦產(chǎn)纖維如毛沸石、感染SV40病毒以及遺傳易感性也是MM發(fā)生、發(fā)展的可能原因。

二、惡性間皮瘤診斷與治療的潛在分子靶點研究進展

惡性間皮瘤在臨床表現(xiàn)上無特異性，易誤診，大多數(shù)MM患者在確診時已是晚期，失去手術(shù)切除機會，故預(yù)后極差。目前對MM沒有明確有效的治療方法，放療受限于腫瘤體積大，很難達到根治量。作為一線化療方案，培美曲塞與順鉑的聯(lián)合治療提高了部分患者的存活率，但遠期生存率仍較差。因此，尋找惡性間皮瘤診斷與治療的潛在分子靶點具有重要意義。

基于分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，對間皮細胞惡性轉(zhuǎn)化中分子事件的研究逐漸增多。人們通過細胞遺傳學(xué)分析染色體核型、比較基因組雜交技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性分析等方法發(fā)現(xiàn)，惡性間皮瘤中存在雜合子的缺失，且檢測到染色體臂的 1p-、3p-、4p-、4q-、6q-、9p-、13q-、14q-、15q-和 22q-這些區(qū)域發(fā)生頻繁缺失[7]。MM細胞系與人腫瘤組織存在共同的染色體突變區(qū)域。然而一些研究者發(fā)現(xiàn)，由于人腫瘤組織中存在少量的正常組織，結(jié)果顯示MM細胞系在這些染色體區(qū)域突變的頻率要高于人腫瘤組織。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在這些區(qū)域存在著較重要的腫瘤抑制基因，他們包括在染色體17p13上的p53基因、9p21上的p16INK4a/p14ARF基因和位于22q12的神經(jīng)纖維瘤病Ⅱ型(neurofibromatosis type 2，NF2)基因。這些抑癌基因的失活，可能在MM的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

1.p53與間皮瘤:p53基因是一種抑癌基因，定位于人類染色體17p13.1，主要通過抑制細胞的增殖及促進細胞凋亡來穩(wěn)定基因組、抑制突變細胞的產(chǎn)生。p53基因突變可促進細胞進入持續(xù)的分裂狀態(tài)，抑制細胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。在人類惡性腫瘤中普遍存在p53基因的突變，而在MM中，只有20%的患者發(fā)生該基因突變，突變率較其他惡性腫瘤明顯偏低[8]。但進一步研究發(fā)現(xiàn)，其他途徑也可導(dǎo)致p53基因的表達異常。

通過熒光原位雜交(FISH)分析發(fā)現(xiàn)，50%～70%的惡性間皮瘤及培養(yǎng)的MM細胞系中存在純合子p16INK4a/p14ARF的缺失，影響兩條抑癌通路p53和成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)的失活導(dǎo)致惡性胸膜間皮瘤的發(fā)生，并提示預(yù)后不良[9]。INK4a/ARF基因定位于人類染色體 9p21，是重要的細胞周期調(diào)控基因，其表達產(chǎn)物p16INK4a和p14ARF蛋白分別在pRb和p53通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。p16INK4a是細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDK)的抑制劑，通過失活CDK4/CDK6抑制蛋白質(zhì)pRB的磷酸化，減少轉(zhuǎn)錄因子 E2F的釋放，將細胞阻滯于 G1期。而p14ARF是在細胞DNA損傷后通過加速泛素蛋白連接酶(murine double minute 2，MDM2)的降解，導(dǎo)致抑癌基因p53水平升高，抑制細胞異常分裂，并促進細胞凋亡。最近的動物實驗發(fā)現(xiàn)，鼠 p16INK4a/p19ARF，與人p14ARF同源，缺失其中一個基因會對石棉誘導(dǎo)的MM易感，若兩個基因都缺失，則會加速石棉對腫瘤的誘導(dǎo)作用[10]。p16INK4a/p14ARF基因可以用來預(yù)測惡性間皮瘤的發(fā)生。

2.PTEN與間皮瘤:磷酸酶-張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)定位于染色體 10q23，基因全長200kb，編碼5.5kb的mRNA。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在人染色體10q23頻繁缺失，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。約50%～80%的單等位基因突變存在于散發(fā)性腫瘤，30%～50%發(fā)生在乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌，而在子宮內(nèi)膜癌及成膠質(zhì)細胞瘤中純合性缺失更常見，且與較差的預(yù)后和轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。目前有關(guān)PTEN與惡性間皮瘤的報道較少，且存在一定的爭議。

Agarwal等[12]的一項研究收集86例MM標(biāo)本，結(jié)果顯示只有26.7%的標(biāo)本PETN基因表達缺失，而超過26.7%的標(biāo)本顯示PTEN基因低表達。第2項研究用21株MM細胞株進行篩選，發(fā)現(xiàn)只有2株細胞株P(guān)TEN基因表達缺失，而與正常間皮細胞株MET5a相比，7株細胞顯示PETN基因低表達。另一方面，Opitz等[13]納入341例MM患者進行研究，其中發(fā)現(xiàn)62%的患者PTEN表達缺失，并提示較差的存活率。因此，在惡性間皮瘤中PTEN基因表達缺失或低表達，仍需大量研究確認(rèn)。

PI3K/AKT抑制劑:PTEN基因還是人類發(fā)現(xiàn)的第1個具有磷酸化酶功能的抑癌基因。PTEN通過使PIP3脫磷酸化為PIP2，而成為PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要負(fù)調(diào)控因子。PTEN表達的下降，將導(dǎo)致PIP3的過表達，進而活化AKT和3'磷酸肌醇依賴的激酶 1(3'-phosphoinositide-dependent kinasel，PDK1)，PDK1是一個63kDa的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白酶，它是AKT的上游活化激酶。PDK1可在磷酸化AKT的Thr308位點使AKT的活性增加30倍以上，促進細胞異常增殖。因此，通過藥物抑制PI3K/AKT信號通路，可抑制腫瘤的生長。然而1993年研發(fā)的PI3K/AKT抑制劑LY294002被報道特異性差，毒性不良反應(yīng)大。此后，新的PI3K/AKT抑制劑不斷被研發(fā)。目前，新藥哌立福在Ⅲ期臨床試驗中被用于治療多發(fā)性骨髓瘤和大腸癌[14]。臨床上也嘗試用PI3K/AKT抑制劑來治療惡性間皮瘤，但缺少大規(guī)模的臨床試驗。

在核內(nèi)，PTEN能調(diào)節(jié)Rad51的表達，減少自發(fā)性DNA雙鏈斷裂，從而維持染色體的完整性[15]。PTEN還能與p53結(jié)合成復(fù)合體，在DNA損傷時，保持p53的高乙?；癄顟B(tài)，調(diào)節(jié)p53的穩(wěn)定性及活性。而研究發(fā)現(xiàn)，這種機制與上述所講的磷酸化過程完全獨立[16]。此外，AKT通過在Ser166和Ser186位點磷酸化MDM2，使其進入細胞核內(nèi)，從而導(dǎo)致p53的恒定失活。因此，利用PTEN基因負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能夠提高p53的表達及其轉(zhuǎn)錄活性，提高腫瘤細胞對化療的敏感度[17]。盡管我們已知曉PTEN在多種癌癥中起關(guān)鍵作用，但是PTEN在MM中的作用還需進一步探索。

3.NF2基因與間皮瘤:NF2基因是一種腫瘤抑制基因，編碼一個含有FERM區(qū)域的蛋白merlin，該蛋白與細胞的活動與增殖密切相關(guān)。NF2基因定位于22q12.2，由17個外顯子組成。而細胞遺傳學(xué)資料表明，間皮瘤細胞系中第22號染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)改變十分頻繁。相關(guān)研究證實，40%～50%的間皮瘤患者發(fā)生了NF2的突變。由于NF2基因突變，導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)變性，從而喪失了腫瘤抑制作用[9]。

NF2編碼的蛋白merlin與4.1超蛋白家族中保守的埃茲蛋白(ezrin)、根蛋白(moesin)、膜突蛋白(moesin)ERM家族具有高度同源性，EMR蛋白含有一個保守的氨基末端，稱FERM區(qū)，連接著一個α螺旋臂以及一個帶電荷的羧基末端區(qū)域。ERM蛋白的FERM區(qū)域與羧基尾端相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)形成一種閉合式的構(gòu)象，幾個蛋白結(jié)合部位被隱藏，導(dǎo)致ERM處于休眠狀態(tài)。但不同的是merlin的羧基端缺少1個保守的F-肌動蛋白的結(jié)合位點，當(dāng)merlin分子內(nèi)N端和羧基端締合時，雖處于閉合狀態(tài)，但仍具有活性。若merlin的羧基端被磷酸化，抑制分子內(nèi)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有開放狀態(tài)但不具備功能上的活性。Li等[18]使用惡性間皮瘤細胞系和Met-5A永生型細胞系進行實驗研究發(fā)現(xiàn)merlin蛋白的腫瘤抑制活性是由E3泛素化鏈接酶CRL4 DCAF1介導(dǎo)的。當(dāng)merlin處于活化閉合狀態(tài)，能聚集在細胞核內(nèi)，并且能與DCAF1結(jié)合，抑制E3泛素化鏈接酶CRL4 DCAF1的生物活性，使細胞周期停止，抑制腫瘤的發(fā)生。而基質(zhì)的黏附和整合素受體酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的后續(xù)活化能激活絲氨酸-蘇氨酸激酶PAK，使merlin的羧基端磷酸化，導(dǎo)致merlin失活，無法進入核內(nèi)，不能抑制 CRL4 DCAF1的生物活性。CRL4 DCAF1能促進廣泛的致癌基因的表達，如泛素轉(zhuǎn)錄因子，組蛋白，染色質(zhì)重塑酶等，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。而Marrow等[19]發(fā)現(xiàn)merlin失活不僅僅是基突變導(dǎo)致的，其他機制也能使merlin失活。McClatchey等發(fā)現(xiàn)Merlin通過對細胞表面多種受體的調(diào)控來抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而一旦Merlin失活，就會激活多種促有絲分裂的信號通道，導(dǎo)致細胞異常增殖。其中研究較多的是PI3K-AKT-mTOR通路。哺乳動物西羅莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被認(rèn)為是一種雷帕霉素的細胞內(nèi)靶點。細胞外信號分子作用于受體酪氨酸激酶，激活K-ras和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)，后者可使蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)激活，而活化的AKT可直接激活mTOR，也可通過下游信號作用于mTOR。該通路不僅在蛋白合成與細胞增殖中起重要調(diào)節(jié)作用，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。研究顯示，同時有PI3K和mTOR信號通路激活的MM患者預(yù)示更差的存活率。Lopez-Lago等研究發(fā)現(xiàn)merlin失活，能激活mTOR通路，促進MM細胞異常增殖。并且，在Merlin突變的MM細胞中發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑雷帕霉素能選擇性地抑制該細胞的生長。因此，mTOR蛋白可作為惡性間皮瘤潛在的治療靶點。

Suzuki等在對21株MM細胞系進行實驗時，發(fā)現(xiàn)其中13株細胞AKT活性增高，表明惡性間皮瘤發(fā)展過程中存在PI3K-AKT-mTOR通路的激活。通過對MPM組織和細胞系研究證實，磷酸化-mTOR的表達和NF2的表達存在反比關(guān)系。臨床上利用NF2和磷酸化mTOR進行免疫組化來篩選對mTOR抑制劑敏感的MPM患者成為可能。已有研究者根據(jù)這些臨床前研究，用mTOR抑制劑雷帕霉素來治療MPM患者。此外，Brevet等研究發(fā)現(xiàn)，單獨抑制mTOR信號通路可能不足以抑制腫瘤的生長，在MPM細胞系中，由于mTOR信號通路的抑制激活了并行c-MET，表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)和胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)信號通路，可能進一步激活A(yù)KT。隨后Carracedo等研究發(fā)現(xiàn)，單獨抑制mTOR信號通路減輕了PI3K的反饋抑制，從而允許恢復(fù)PI3K的下游AKT信號激活。為了解決mTOR反饋激活A(yù)KT這一問題，雙PI3K/mTOR抑制劑已被廣泛應(yīng)用于臨床。

三、展 望

大量研究表明，石棉暴露與惡性間皮瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，惡性間皮瘤的診斷可直接歸屬于職業(yè)的石棉暴露。西方國家已經(jīng)禁止石棉的生產(chǎn)及銷售，而我國大部分地區(qū)仍在繼續(xù)使用。隨著惡性間皮瘤發(fā)生率的不斷上升，對其建立強制的預(yù)防、診斷及治療措施是必不可少的。同時，隨著對MM細胞遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，許多抑癌基因的突變、缺失會直接影響惡性間皮瘤的發(fā)生、發(fā)展，在其診斷、治療及預(yù)后中具有潛在的生物標(biāo)志物作用。雖然近年來對惡性間皮瘤分子生物學(xué)特別是某些抑癌基因及其蛋白功能的研究取得重大的進展，但仍存在許多疑問，如惡性間皮瘤的發(fā)病機制尚未完全闡述;間皮瘤的潛伏期很長，它的轉(zhuǎn)化過程中是否涉及多個基因的協(xié)同作用。此外，NF2基因的失活及PTEN基因表達的下調(diào)都能活化AKT基因，可見各信號通路互相交織成網(wǎng)，增加了對惡性間皮瘤研究的復(fù)雜性，因而有必要對參與惡性間皮瘤發(fā)生、發(fā)展的信號通路進行更加深入全面的研究，為惡性間皮瘤的個體化靶向治療提供更多的理論依據(jù)。

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