食源性致病菌快速檢測方法研究進展

李春梅 陶小春

廣西鹿寨縣疾病預防控制中心 545600

食品安全直接關(guān)系到人們的生命健康及環(huán)境安全，已成為全球各地區(qū)公共衛(wèi)生的熱點問題。食源性致病菌所致的食源性疾病是威脅食品安全的重要原因。傳統(tǒng)食源性致病菌檢測方法主要為分離培養(yǎng)、生化鑒定等，但這些方法存在特異性及靈敏度低、操作復雜費時、不能實時監(jiān)控等缺點［1］，因此探索特異性靈敏度高、簡捷且能實時監(jiān)測與控制的檢測方法成為廣大研究者追求的目標。本文就近年來有關(guān)食源性致病菌快速檢測方法的進展作一綜述。

1 電阻抗技術(shù)

主要是通過微生物在培養(yǎng)基中生長代謝產(chǎn)生的活性底物，增加培養(yǎng)基的電導性，降低培養(yǎng)物阻抗，從而產(chǎn)生特征性阻抗曲線，不同細菌具有不同的阻抗曲線，因此有利于鑒定細菌。該技術(shù)特異性及靈敏性較高、操作簡單、反應快，目前主要用于檢測食品細菌總數(shù)、大腸桿菌、酵母菌、沙門氏菌、霉菌。有研究者［2］采用電阻抗技術(shù)檢測桶裝礦泉水的細菌和真菌總數(shù)，并與國標法比較，細菌檢測時間由48h縮短至14.5h，真菌則有5d縮短至44h，細菌和真菌總數(shù)相符率分別為94.7%和90.4%，檢測時間隨樣品污染程度加重而縮短。

2 微熱量技術(shù)

該技術(shù)通過測定細菌生長產(chǎn)生熱量的變化來判斷是否存在細菌和鑒別其種類。通過微熱量計測定細菌生長產(chǎn)生的熱量等數(shù)據(jù)，并經(jīng)過計算機處理后在記錄器上繪制出熱量－時間曲線圖。將試驗所得的熱量－時間曲線圖與已知細菌的熱量－時間曲線圖比較來判斷細菌種類及數(shù)量。有報道稱［3］用微熱量技術(shù)通過測定痢疾桿菌產(chǎn)生的熱量變化以評估鈷化合物新藥對痢疾桿菌的抑制作用，認為該方法具有較高的特異性和靈敏性，簡單實用。

3 放射測量法

該法通過培養(yǎng)基中加入14C標記的碳水化合物或鹽類的底物，細菌利用這些底物生長繁殖，代謝產(chǎn)生14CO2，然后用放射測量儀測量14CO2含量變化以確定有無細菌。如已加入14C標記的葡萄糖的培養(yǎng)基中樣品存在細菌感染時，含14C的葡萄糖可被細菌攝取吸收并代謝產(chǎn)生14CO2，14CO2以兩種形式存在：（1）在細菌體內(nèi)被標記，可用放射測量儀測定14C的放射性及其強弱，確定樣本中存在細菌及數(shù)量；（2）以氣態(tài)14CO2釋放出細菌體外，可用氫氧化季銨鹽與14CO2反應獲得固態(tài)或液態(tài)14C，再測定14C的放射性及其強弱以確定樣本中存在細菌及數(shù)量。該法主要應用在檢測血培養(yǎng)基中微生物。有研究者［4］使用放射測量法定量測定大腸埃希菌，其特異性敏感性均較傳統(tǒng)方法高。

4 ELISA法

該法通過將酶系統(tǒng)的高效催化作用與抗原抗體免疫反應的特異性相結(jié)合的一種檢測技術(shù)，可定性、定量測定抗體或抗原?？捎糜谑称分写竽c埃希菌0157、軍團菌、沙門氏菌等微生物的檢測。該法具有較強的特異性及較高的靈敏度，快速而穩(wěn)定，容易操作等特點。韓志輝等［5］應用ELISA法測定腸炎沙門氏菌感染樣本，并與國標法對照，發(fā)現(xiàn)兩種方法符合率為97.14%。有研究者［6］通過ELISA檢測系統(tǒng)測定生雞肉和飼料細菌總數(shù)，用時小于27h，該法檢測限為2×103cfu／25g；而傳統(tǒng)的方法需72～96h。黃韜睿等［7］采用ELISA法測定食品中的細菌，檢測限為103～104cfu／ml，整個檢測時間為52h，較傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法檢測時間明顯縮短。

5 PCR技術(shù)

又稱聚合酶鏈式反應，是一種DNA體外擴增技術(shù)，目前已廣泛應用于生命科學各領(lǐng)域。近年來，PCR技術(shù)逐漸應用于食品中致病菌的檢測。其原理是在PCR體系下細菌的核酸序列經(jīng)高溫、低溫、適溫循環(huán)被以2的指數(shù)大量復制擴增過程。李盛豐等［8］運用實時熒光實時PCR技術(shù)檢測食品中單核細胞增生李斯特菌，結(jié)果表明該法檢測單核細胞增生李斯特菌特異性敏感性高，簡單快速。譚炳乾等［9］采用多重PCR檢測食品中單核細胞增生李斯特菌，結(jié)果顯示無1例假陽性。李琳等［10］采用PCR技術(shù)，以SEA－SEJ基因設(shè)計引物，對金黃色葡萄球菌進行腸毒素分型，并與傳統(tǒng)的生化及免疫學檢測法對照，結(jié)果顯示PCR檢測法檢出率明顯高于免疫學法，但與生化檢測法相當，但PCR法檢測時間較短僅需3h，生化檢測法需5d，因此認為，PCR檢測法具有速度快，可靠性高，樣品量小且可以分型等優(yōu)點。楊軍等［11］采用多重PCR技術(shù)檢測腸毒素A～E，檢測僅需3～4h即可完成，且與標準的免疫檢測法符合率達99%。PCR檢測亦可用于水與食品痢疾桿菌的檢測。目前國內(nèi)外多以ipaH基因設(shè)計引物建立 PCR 檢測痢疾桿菌［12，13］。

PCR檢測法雖然簡單、快捷、特異性高、靈敏度強，但也存在某些不足：樣品純化處理時間較長，若被少量外源性DNA污染，就可能使結(jié)果失真；選擇的靶序列及引物設(shè)計不當均可降低PCR法的特異性和靈敏度；若實驗條件控制不當極易使多對引物同時擴增失敗或產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。

6 基因芯片技術(shù)

也稱DNA芯片、DNA微陣列，通過原位合成的方法在支持物表面固化大量DNA探針，并與標記的樣品進行雜交，通過對雜交信號的檢測分析快速的鑒定生物樣品［14］。該技術(shù)是一種簡單快捷、敏感性高的高通量檢測方法，且結(jié)果可采用自動化分析，防止因人工操作產(chǎn)生錯誤的結(jié)果，這為食品安全提供更可靠的技術(shù)支持。有研究者［15］用基因芯片與多重PCR中已生物素化的dUTP探針雜交，然后檢測雜交信號鑒別出4種大腸埃希菌血清型。國外有報道［16］通過設(shè)計Ecoli 30個耐藥性基因用于監(jiān)測Ecoli的耐藥性。Jack等［17］采用基因芯片技術(shù)聯(lián)合免疫磁珠分離法檢測食品中的Ecoli O157∶H7，檢測限達103cfu／ml。李秀萍等［18］建立基因芯片鑒定金黃色葡萄球菌可鑒定tsst－1、sea等致病因子和mecA、aacA－aphD等抗藥性決定簇，在運用PCR技術(shù)可將金黃色葡萄球菌從陰性葡萄球菌及革蘭陰性菌中鑒別出來，檢測時間僅需24h。AI－Khaldi等［19］采用產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素（etx）、腸毒素（epe）、β毒素（cpb）等基因編碼建立基因芯片運用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測。Peng等［20］采用特異性基因芯片結(jié)合多重PCR檢測貝類樣品的致病性弧菌，其特異性達100%，靈敏度為102～103cfu／ml，該法能較快速準確的檢測貝類食品中的致病性弧菌使用基因芯片可檢測食品微生物種類和豐度，基因芯片主要為16S rRNA基因、23SrRNA基因。這兩種基因功能保守，進化緩慢，分子含有保守和可變兩種序列，可用于研究生物系統(tǒng)發(fā)育的進化過程。在16SrRNA或23SrRNA基因保守區(qū)設(shè)計PCR引物，可用多對引物擴增出多種細菌目標片斷，再在可變區(qū)建立檢測基因芯片，通過檢測其雜交信號，從而得出樣品微生物的種類和豐度。畢可然等［21］以16SrRNA、23S rRNA基因為靶序列建立基因芯片，檢測大腸埃希氏菌、沙門氏菌等細菌，結(jié)果顯示該芯片具有較高的特異性和靈敏度，但檢測金黃色葡萄球菌特異性及靈敏性較差。李鵬等［22］以16SrRNA、23SrRNA基因序列設(shè)計基因芯片，可鑒別臨床常見的病原菌。Moiler等［23］利用16SrRNA、23SrRNA 基因 芯 片技術(shù)檢測水中常見致病菌，并與傳統(tǒng)方法比較，兩者相符率達95%。Ulbegi－Mohyla等［24］采用以16S rRNA、23SrRNA基因為靶分子的基因芯片檢測不同貯存條件下色拉蔬菜中的致病菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該芯片可準確檢測非培養(yǎng)方式下復雜致病菌的組成。雖然基因芯片有很多優(yōu)點，但由于該技術(shù)剛剛興起，還存在許多不足，如樣品目標物放大時易引起樣品污染，使檢測信噪比受到影響，降低了靈敏度；需要專門的檢測設(shè)備，價格較貴；樣品制備和標記無統(tǒng)一標準，導致不同人檢測的結(jié)果可能不同。

7 生物傳感器技術(shù)

該技術(shù)通過生物活性材料與待測微生物發(fā)生生物學反應，通過換能器將其中的反應信號轉(zhuǎn)換成可定向處理的電信號，經(jīng)放大器放大輸出，從而獲得待測微生物的濃度信息。生物傳感器主要包括微生物傳感器、酶傳感器、組織傳感器、免疫傳感器、細胞器傳感器等。該技術(shù)檢測具有特異性強、靈敏度高、簡單、快速便于攜帶等優(yōu)點。一項研究［25］報道，用一種電化學生物傳感器可快速而有效的測定乳制品中細菌含量。Liu Nan等［26］研制了一種雙層脂質(zhì)膜生物傳感器結(jié)合基因芯片技術(shù)，檢測金黃色葡萄球菌seb基因，靈敏度為20ng／ml。

食品安全問題與人們生命健康及社會經(jīng)濟發(fā)作密切相關(guān)，因此對食品中致病菌的檢測有著重要的意義。隨著科學技術(shù)的進步，致病菌檢測方法逐漸向特異性強、靈敏度高、簡單易用、經(jīng)濟等的方向發(fā)展，尤其是近年來出現(xiàn)的基因芯片及生物傳感器技術(shù)，已成為微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點。

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