細胞自噬與卵巢癌的關(guān)系

武 玉(綜述)，賈雪梅，戴輝華(審校)

(江蘇省人民醫(yī)院河西分院/江蘇省婦幼保健院婦科，南京 210000)

卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌和肺癌是女性相關(guān)癌癥的主要死亡原因[1]。卵巢癌是女性婦科疾病中高致死性的腫瘤，是危害女性生命健康的重要殺手，目前對于卵巢癌患者首選的治療方法為腫瘤細胞減滅術(shù)以及術(shù)后以紫杉醇和卡鉑為主的輔助性化療[2]。然而,由于早期診斷困難、腫瘤細胞耐藥而復(fù)發(fā)，使卵巢癌成為高致死性腫瘤[3]。近幾年的研究表明，自噬在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥中起著非常重要的作用，該文對自噬與卵巢癌關(guān)系的研究予以綜述。

1 自噬的發(fā)生機制

1.1自噬的介紹 1962年，Ashford等[4]在細胞中發(fā)現(xiàn)了溶酶體降解細胞自身成分的現(xiàn)象，因此提出自噬的概念。自噬是細胞為了維持細胞內(nèi)平衡、減輕代謝應(yīng)激而將細胞質(zhì)和細胞內(nèi)需要降解的細胞器、蛋白質(zhì)、RNA等形成自噬體，并被自噬溶酶體所降解的過程。自噬普遍存在于所有真核生物體內(nèi)，它是生理性的細胞死亡過程，被稱為Ⅱ型程序性死亡。根據(jù)物質(zhì)進入溶酶體的方式不同，自噬被分為3種類型，即巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[5]。自噬是生理性的細胞死亡過程，其異常與許多疾病的發(fā)病機制有關(guān)，如肌肉病變[6]、神經(jīng)退行性變[7]、微生物感染[8]、炎癥性腸病[9]、衰老[10]和許多癌癥[11]。哪些蛋白或基因參與了自噬的發(fā)生過程？當(dāng)自噬發(fā)生時，細胞內(nèi)形成雙層膜，隔離、包裹細胞內(nèi)需要降解的細胞器和蛋白質(zhì)等形成初始自噬泡，當(dāng)初始自噬泡成熟時,溶酶體與之融合形成自噬溶酶體，降解其中需要降解的物質(zhì)，以維持細胞內(nèi)的平衡。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC-3)存在于自噬泡前體和自噬泡膜表面，參與自噬的發(fā)生過程，它有Ⅰ型和Ⅱ型之分，Ⅰ型LC-3為可溶性的，常規(guī)的表達于細胞中，當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ經(jīng)過加工修飾，與磷脂酰乙胺醇結(jié)合，形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ位于自噬體膜表面，與自噬泡的數(shù)量成正比，并且LC-3Ⅱ含量的多少代表了自噬發(fā)生的程度。已有實驗研究表明，自噬基因1(Beclin-1)也參與了自噬的發(fā)生過程，Beclin-1定位于染色體17q21上，編碼一種450個氨基酸序列、相對分子質(zhì)量為60的蛋白質(zhì)，它參與自噬形成的初級階段，Beclin-1不僅參與自噬的發(fā)生，并且在自噬的發(fā)生、發(fā)展中可能起到了調(diào)控的作用[12]。

1.2自噬的調(diào)節(jié) 在自噬的調(diào)節(jié)中，一個至關(guān)重要的扮演者是雷帕霉素的靶點蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)，它在自噬的調(diào)節(jié)中起著樞紐的作用[13]。當(dāng)氧缺乏、饑餓或其他不利因素存在時，自噬的作用增強，反之，自噬受到抑制。調(diào)節(jié)自噬的信號通路主要有磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)-AKT-mTOR通路、絲氨酸-蘇氨酸激酶11-腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)-mTOR通路、p53通路、Beclin-1途徑以及Bcl-2途徑[14]。

PI3K-AKT-mTOR通路：PI3K激活下游信號物質(zhì)AKT，進而激活mTOR從而抑制自噬，因此如果PI3K-AKT通路被抑制，則增加了自噬，從而不利于腫瘤細胞的存活[15]。絲氨酸-蘇氨酸激酶11-AMPK-mTOR通路：當(dāng)處于饑餓或乏氧狀態(tài)時，絲氨酸-蘇氨酸激酶11，即絲氨酸/色氨酸激酶可激活蛋白激酶AMPK，抑制mTOR從而開啟自噬，因此抑制PI3K-AKT通路可抑制自噬從而有利于腫瘤細胞的存活[16]。p53通路：p53是一種抑癌基因，它自身可抑制自噬，同時通過抑制AMPK，激活mTOR從而也可抑制自噬。Beclin-1途徑：Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因Atg6的哺乳細胞同源基因，因此它也稱為Atg6，它是自噬初始階段所必須的。Beclin-1等位基因的缺失在人類的卵巢癌、前列腺癌以及乳腺癌中是比較常見的[17]。Bcl-2途徑：Bcl-2為凋亡抑制因子，它可通過與Beclin-1的相互作用從而抑制自噬。

2 自噬與腫瘤

自噬不僅在生理狀態(tài)下可以出現(xiàn)，在許多病理狀態(tài)仍然可以看到自噬的存在，自噬與腫瘤之間有緊密的聯(lián)系，自噬不僅參與腫瘤的形成，而且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也扮演著極其復(fù)雜的角色。自噬對腫瘤的作用是雙重的，不僅具有保護作用，同時也存在抑制作用。Paglin等[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小劑量放療作用于結(jié)腸癌、乳腺癌及前列腺癌細胞時，自噬泡增多，出現(xiàn)了保護照射后細胞的現(xiàn)象。Salem等[19]研究表明，下調(diào)乳腺癌Ⅰ型基因增加了自噬的發(fā)生，從而誘導(dǎo)了乳腺癌細胞的生長；與此相反，許多實驗也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)自噬功能的缺失與腫瘤的發(fā)展存在相關(guān)性。Beclin-1是參與自噬初始階段的重要物質(zhì)，也是哺乳動物中第一個腫瘤抑制物[12]。已有實驗證實,Beclin-1等位基因的缺失在人類50%的乳腺癌及40%的前列腺癌中是常見的，同時Beclin-1的表達改變在結(jié)腸癌、腦癌和肝細胞癌等多種腫瘤細胞中也能夠被觀察到。Beclin-1的缺失及其功能的改變使乳腺癌、卵巢癌及其前列腺癌的發(fā)生更加容易。

3 自噬與卵巢癌

自噬在腫瘤中的角色是復(fù)雜的，已有很多研究結(jié)果表明，正常的卵巢組織中其自噬的活性比卵巢惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤和交界性腫瘤都高，表明細胞的自噬可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系[20]。進一步研究也證實，在卵巢良性腫瘤與交界性腫瘤的組織中，LC-3和自噬基因Beclin-1所調(diào)節(jié)的蛋白表達顯著高于上皮性卵巢癌，而且LC-3和Beclin-1表達的水平與上皮性卵巢癌患者的國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期存在相關(guān)性，說明Beclin-1的不同表達可能與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。年齡和組織分型之間沒有明顯的聯(lián)系，LC-3和Beclin-1之間也沒有相關(guān)性。因此，自噬蛋白含量的減少可能與腫瘤的形成和上皮性卵巢癌的發(fā)展有關(guān)。

3.1自噬、凋亡與卵巢癌 自噬相關(guān)基因Beclin-1在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要的角色，但是它對腫瘤預(yù)后意義和抗凋亡基因Bcl-xL的表達仍然是未知的。Lin等[21]通過使用蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組織化學(xué)法觀察了Beclin-1和抗凋亡基因Bcl-xL在新鮮的卵巢組織和石蠟包埋的上皮性卵巢癌組織的表達，發(fā)現(xiàn)Beclin-1在正常的卵巢組織中比交界性卵巢腫瘤和卵巢惡性腫瘤中都高，交界性卵巢腫瘤中Beclin-1的表達高于卵巢惡性腫瘤，并且因腫瘤的不同分級Beclin-1的表達不同。在單因素分析中表明，Beclin-1的低表達和卵巢癌患者縮短的生存期緊密相關(guān)，而且Beclin-1的表達是獨立的預(yù)后因素[21]。除此之外，低表達的Beclin-1和Bcl-xL的表達是相反的，進一步的綜合分析表明，低表達的Beclin-1和高表達的Bcl-xL有最低的生存率[21]。由此可以得出結(jié)論，Beclin-1在判斷卵巢癌患者的預(yù)后中可以作為一個額外的工具，Bcl-xL的高表達可以預(yù)估卵巢癌患者的生存期。Guo等[22]研究描述了運用傳統(tǒng)鉑類藥物化療的卵巢癌患者，凋亡機制的失調(diào)是導(dǎo)致化療耐藥的主要機制，因此對于化療中出現(xiàn)凋亡耐藥的患者，尋找出另外一種誘導(dǎo)細胞死亡的方法是至關(guān)重要的，單鉑藥物可誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬性的細胞死亡，它有以下幾個特性：可以引起細胞質(zhì)中空泡形成；形成獨立的半胱氨酸天冬酶，不形成細胞核斷裂和染色質(zhì)的積聚，不形成凋亡小體。以上特征均表明，單鉑藥物在卵巢癌細胞Caov-3中可以引起非凋亡的細胞死亡，而且運用了單鉑藥物的細胞在潛伏期時可以產(chǎn)生越來越多的點狀分布的LC-3，并且LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的比值也增加；通過電子顯微鏡的觀察也發(fā)現(xiàn)單鉑藥物可以引起自噬泡的形成；同時，通過多種方法驗證了單鉑藥物引起的自噬性細胞死亡，如剔除自噬基因Beclin-1和Atg-7發(fā)現(xiàn)自噬被明顯抑制；或者使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤、氯喹、洛霉素-A。由此可見，對于耐凋亡的卵巢癌細胞，單鉑藥物可以引起自噬性的細胞死亡，從而發(fā)揮抗癌作用。自噬與凋亡也能夠相互協(xié)同發(fā)揮作用。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷和依維莫司協(xié)同誘導(dǎo)了卵巢癌細胞的細胞毒作用，而且發(fā)現(xiàn)增強的細胞毒作用的機制是所誘導(dǎo)的自噬和凋亡的協(xié)同作用。這個增強的細胞毒作用和下降的p-AKT水平的表達、ATG5和ATG12結(jié)合的上調(diào)以及LC-3Ⅱ的上調(diào)同時存在。以上研究表明，可以加強并且擴大現(xiàn)有的定向治療卵巢癌的藥物通過同時誘導(dǎo)自噬和凋亡來引起卵巢癌細胞的死亡。

3.2自噬、缺氧與卵巢癌 自噬既存在于生理狀態(tài)下，也存在于病理狀態(tài)下。缺氧時，自噬增強。Gibson[24]的研究發(fā)現(xiàn)，由于腫瘤的過快生長，往往需要更多的血供來支持它生長，如果沒有足夠的血管形成，則會形成缺氧的環(huán)境，從而造成腫瘤細胞的死亡，然而，其中的一些細胞將會在缺氧的環(huán)境中通過自分泌生長因子、增加浸潤和侵襲的范圍及誘導(dǎo)自噬而存活，從而造成腫瘤對于化療的耐藥，人類卵巢透明細胞癌對于傳統(tǒng)的鉑類藥物的化療是耐藥的，與其他類型的卵巢癌相比，有更差的預(yù)后和更短的生存期，在缺氧的環(huán)境中，LC-3的表達水平是增加的，通過對LC-3的檢測表明，在缺氧的環(huán)境下卵巢的透明細胞癌會發(fā)生更強的自噬誘導(dǎo)。Spowart等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢透明細胞癌的組織分型展示出了它與缺氧耐受、葡萄糖缺乏所引起自噬的代謝特征，這個代謝特征表明卵巢的透明細胞癌和其他上皮性卵巢癌典型的生存機制不同；微管相關(guān)蛋白輕鏈-LC3A是一個自噬的標(biāo)志，在透明細胞癌中，與缺氧、不良的預(yù)后有關(guān)，在485例卵巢腫瘤的患者中，發(fā)現(xiàn)LC3A表達量的多少明顯和疾病的無進展相關(guān)，在患有透明細胞卵巢癌的患者中，LC3A可以是疾病特有、判斷預(yù)后的標(biāo)志，通過LC3A染色也發(fā)現(xiàn)了自噬和缺氧之間強烈的關(guān)系，它反映了缺氧相關(guān)蛋白-Ⅸ和低氧誘導(dǎo)因子1α的正結(jié)合；同時讓透明細胞癌和高分化的卵巢漿液性細胞株經(jīng)歷缺氧和葡萄糖缺乏，最終發(fā)現(xiàn)卵巢的透明細胞癌有更強的自噬誘導(dǎo)，隨后對于自噬的抑制更加的敏感，低氧誘導(dǎo)的自噬對于透明細胞癌的臨床病理是非常關(guān)鍵的，并且可以解釋透明細胞癌的組織分型。在Matrone等[26]研究中，使卵巢癌細胞OVCAR-3、A2780和卵巢上皮性癌細胞SKOV3表達p38，再分別用p38α和p38β處理這些細胞，通過對它們形態(tài)學(xué)的改變、增殖和生存分析得出結(jié)論，p38α阻止了細胞內(nèi)自噬體的形成，降低了腫瘤細胞的增長，減弱了它的生存能力。

3.3自噬、微RNA與卵巢癌 微核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)在腫瘤微環(huán)境的動態(tài)改變中會有更加復(fù)雜的表達水平。卵巢癌不同時期的miRN的表達也不同，到目前為止，miRNA介導(dǎo)的自噬調(diào)控仍然不完全明確，然而根據(jù)現(xiàn)有的可利用的信息依舊可以推測出部分miRNA的表達對自噬的調(diào)控。例如在復(fù)發(fā)的Ⅰ期卵巢癌患者的樣本中發(fā)現(xiàn)，miR-30a是下調(diào)的，然而miR-30a可以下調(diào)Beclin-1的表達；與正常的組織相比，卵巢癌中miR-101是下調(diào)的，然而miR-101可以抑制自噬蛋白Atg4的表達。miR-101的mRNA還有重組人微管解聚蛋白1和兔單克隆抗體。特別注意的是，純化的過度表達和卵巢癌患者不良的預(yù)后有非常重要的聯(lián)系，并且Rab5A在卵巢癌中促進了細胞的增殖。miR-214和miR-21分別與耐藥的表型和卵巢癌潛在的轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，它們的目的蛋白是人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，這是一個已知的抑癌基因，能夠正調(diào)控自噬，在大多數(shù)的卵巢癌中都被刪除或者突變。miR-30d是miR-30 miRNA家族中的一員，miR-30家族大范圍的調(diào)節(jié)正常細胞和癌癥中生理性(包括發(fā)展、新陳代謝、凋亡、衰老、增殖和分化)的過程，有報道在超過30%的多種人上皮性卵巢癌中miR-30d的作用被放大了，表明miR-30d在腫瘤的發(fā)展和體內(nèi)平衡中是一個新的致癌基因，并且是一個潛在的生物標(biāo)記[27]。Yang等[27]通過轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-30d的mimic進入卵巢癌細胞A2780、OVCAR10和2008，并且通過實時定量PCR檢測了目的基因miRNA的表達水平，得出結(jié)論，與對照組相比，轉(zhuǎn)染了miR-30d mimic的實驗組中ATG2B、ATG5、ATG12、BECN1和BNIP3L被明顯抑制，并且通過蛋白質(zhì)免疫印跡證實，轉(zhuǎn)染了miR-30d mimic的實驗組中自噬相關(guān)基因ATG2B、ATG5、ATG12、BECN1和抑癌基因BNIP3L的蛋白表達水平降低，證明了miR-30d在miRNA和蛋白水平抑制了這些基因的表達。

4 自噬在卵巢癌中診斷及治療中的作用

Le等[28]研究發(fā)現(xiàn)，達沙替尼是Src/Abl家族激酶的抑制劑，能夠抑制許多實體腫瘤的生長，他們首先通過吖啶橙染色確定了達沙替尼可以誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，繼而通過使用Western blotting中自噬相關(guān)蛋白LC-3表達的增加進一步驗證了自噬的存在，最后在達沙替尼誘導(dǎo)的自噬和生長抑制中，通過小干擾RNA沉默或者上調(diào)目的基因發(fā)現(xiàn)，達沙替尼誘導(dǎo)細胞發(fā)生小部分凋亡，在卵巢癌細胞SKOv3和HEY中出現(xiàn)了大部分自噬，在體內(nèi)實驗中，已經(jīng)知道達沙替尼抑制了腫瘤的生長，將卵巢癌細胞HEY種植于大鼠體內(nèi)，觀察到達沙替尼誘導(dǎo)了自噬和凋亡。將自噬基因Beclin-1、Atg-12和他們各自的siRNA沉默，觀察到達沙替尼誘導(dǎo)的自噬減少，然而剔除p27Kip1卻沒有減少自噬，并且抑制了腫瘤的生長，達沙替尼是通過誘導(dǎo)Akt、mTOR、p70S6K和S6激酶的磷酸化，從而使自噬的作用降低[28]。

Gibson[24]研究發(fā)現(xiàn)，在臨床的環(huán)境中，使用氯喹、羥化氯喹和秋水仙堿的患者會形成自噬性的空泡肌病，如果采用電鏡來診斷則需要很長的時間且費用較高，這時就可以采用免疫組織化學(xué)法來進行診斷，不僅速度更快而且費用較低，因此LC-3的免疫組織化學(xué)著色已經(jīng)在臨床上被用于診斷自噬，并且在卵巢的透明細胞癌缺氧的條件下，自噬的誘導(dǎo)增強，導(dǎo)致卵巢的透明細胞癌對化療的耐藥，出現(xiàn)比較差的預(yù)后和更短的生存期，LC-3的測定不僅可以用來診斷而且可以用來評估預(yù)后。

Guo等[22]通過描述單功能鉑類藥物的作用和機制，最終得出結(jié)論，使用單鉑藥物在耐凋亡的卵巢癌細胞中可以引起自噬性的細胞死亡，從而起到抗癌的作用，這又多出了一個對于抗癌藥物的選擇。

Amaravadi[29]著重講述了抑癌基因ARHI，它是一個腫瘤抑制基因，在體外實驗中導(dǎo)致了卵巢癌細胞發(fā)生自噬性的細胞死亡，它在大多數(shù)的卵巢癌中是被抑制的，但是在癌前病變中是高表達的，因此可以通過調(diào)控ARHI誘導(dǎo)的自噬用于治療。了解自噬在具體腫瘤中所發(fā)揮的作用對腫瘤的治療是非常重要的。紫杉醇是抗有絲分裂的藥物，被廣泛用于卵巢癌的治療中，不僅可以誘導(dǎo)細胞凋亡，也調(diào)節(jié)了腫瘤細胞的自噬，然而自噬如何影響紫杉醇的活性仍然是未知的。Veldhoen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇通過兩條獨特的途徑(依賴于細胞周期)抑制自噬，在有絲分裂的細胞中，紫杉醇抑制了classⅢ磷脂酰肌醇3激酶和Vps34(自噬形成的啟動者)的活性，當(dāng)紫杉醇作用于非有絲分裂的細胞時，自噬體形成了但是它們的移動和成熟被抑制。用化學(xué)或基因的方法阻礙自噬體的形成減小了紫杉醇誘導(dǎo)的細胞凋亡，表明自噬的存在在紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡中是必須的，自噬的存在有助于紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，因此可以通過觀察有絲分裂細胞和非有絲分裂細胞自噬的水平來觀察紫杉醇對于腫瘤細胞的作用，同時可以加以人為的干預(yù)來增強紫杉醇對于腫瘤細胞的毒性作用。

對自噬通路的研究也許是一個新的抗癌治療的選擇。自噬促進劑或者自噬抑制劑通過誘導(dǎo)癌癥細胞的死亡都有可能產(chǎn)生有益的效果。但是在腫瘤的不同階段和不同微環(huán)境中自噬的表達是可變的。事實上，在癌前病變中，自噬的缺失將會促進基因組的不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)展，在進展期的腫瘤中自噬的上調(diào)能夠彌補由于營養(yǎng)供應(yīng)的不足造成的細胞死亡并且可以幫助應(yīng)對遺傳毒性和代謝應(yīng)激。

5 小 結(jié)

自噬在癌癥中的角色是兩面的，自噬的缺失可能增加了細胞致癌性的轉(zhuǎn)變。同時，自噬作為ATP和氨基酸再循環(huán)關(guān)鍵的分解代謝過程，是細胞主要的生存機制。這個過程對于癌癥細胞是尤為重要的。在腫瘤中，高效率的有氧糖酵解和谷氨酰胺酰基化導(dǎo)致了活性氧類的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激，為了生存它通常上調(diào)了它們自己的自噬。癌癥細胞誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激也刺激了自噬的發(fā)生。在快速增長的腫瘤中，常?？捎^察到由于低氧被上調(diào)的自噬和有效的癌基因激活[31]。理解自噬和癌癥細胞新陳代謝在腫瘤發(fā)展中以及它所處具體環(huán)境中錯綜復(fù)雜的角色，不僅將會擴展對于不同患者癌癥動力學(xué)的理解，而且有助于找到新的個體化、更加有效的抗癌方法。因此，還要繼續(xù)投入大量的精力去研究，為改善腫瘤的預(yù)后作貢獻。

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