Cdk5/p35在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用

張新穎(綜述)，婁 燕※，董長(zhǎng)征(審校)

(河北省人民醫(yī)院 1兒科， 2神經(jīng)外科，石家莊 050051)

癲癇是由腦部神經(jīng)元異常高度同步化放電所致的突然性、反復(fù)性和短暫性的腦功能障礙綜合征，臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)、感覺、意識(shí)、精神等多方面的功能障礙[1]，可以導(dǎo)致智力水平下降，學(xué)習(xí)記憶能力不足等[2-3]，嚴(yán)重影響患者的身心健康及正常生活質(zhì)量。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療較為困難。國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)從突觸可塑性、二次打擊及遺傳學(xué)等方面對(duì)癲癇進(jìn)行了廣泛深入的研究，對(duì)其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制有了一定認(rèn)識(shí)，但尚未取得突破性進(jìn)展。海馬苔蘚纖維出芽(mossy fiber sprouting,MFS)是人類顳葉癲癇及各類癲癇模型中普遍存在的病理現(xiàn)象[4-6]，與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因而MFS機(jī)制也成為癲癇研究的熱點(diǎn)之一[7-8]。研究者最近發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)與其調(diào)節(jié)蛋白p35、p25等能夠通過參與海馬MFS，從而促進(jìn)癲癇的發(fā)生[9]，引起了科學(xué)家們的普遍關(guān)注。

1 Cdk5的發(fā)現(xiàn)

真核細(xì)胞的細(xì)胞分裂周期(cell division cycle,Cdc)受磷酸化/脫磷酸化事件調(diào)控，參與調(diào)控的分子成員由Cdc2同源催化亞單位和屬于細(xì)胞周期蛋白家族成員的調(diào)節(jié)亞單位組成。由于這些激酶需要與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶活性，因此稱為細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,Cdks)。Cdk5從1992年開始被多個(gè)實(shí)驗(yàn)室先后發(fā)現(xiàn)，并被予以不同的命名。Hellmich等[10]從大鼠腦組織cDNA文庫(kù)中克隆出一種細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶，稱為神經(jīng)元Cdc2樣蛋白激酶，其氨基酸序列與小鼠Cdk1同源性為58%，與人類Cdk2同源性為61%。同一時(shí)期，Meyerson等[11]在尋找真核細(xì)胞周期中可能起重要作用的Cdks時(shí)，以對(duì)應(yīng)于Cdc2保守序列的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行海拉細(xì)胞mRNA的熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了Cdk5蛋白激酶。同一年，Lew等[12]在牛的腦組織中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)上與Cdc2相似的分子，稱之為腦脯氨酸-限定性蛋白激酶。而Ishiguro等[13]所發(fā)現(xiàn)的與微管相關(guān)的Tau蛋白激酶Ⅱ亦為同一物質(zhì)。最終在1993年，Kobayashi等[14]將這個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為30×103有活性的蛋白激酶亞單位命名為Cdk5。

2 Cdk5激酶

Cdk5基因被映射到第7號(hào)染色體上。在7q36，它是一個(gè)包含12個(gè)外顯子的3.95 kb(對(duì)應(yīng)于987 bp Cdk5轉(zhuǎn)錄物)的長(zhǎng)DNA。Cdk5蛋白是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為33×103的分子，只有與激活劑結(jié)合后才具有激酶活性?；罨腃dk5能磷酸化毗鄰脯氨酸殘基上游的絲氨酸/蘇氨酸。

Cdk5是Cdks家族成員，在結(jié)構(gòu)上與其他成員相似。像真核生物中的大多數(shù)蛋白激酶一樣，Cdk5也具有與調(diào)節(jié)相關(guān)的催化域。這個(gè)催化域有一個(gè)由β-折疊構(gòu)成的N端區(qū)域和α-螺旋組成的C區(qū)，兩者之間有ATP結(jié)合位點(diǎn)。α-螺旋結(jié)構(gòu)被稱作Cdc2相關(guān)激酶結(jié)構(gòu)，起源于多肽序列。延續(xù)的20個(gè)氨基酸殘基中心位于N和C區(qū)之間，形成一個(gè)能夠進(jìn)行磷酸轉(zhuǎn)移的構(gòu)象，稱為活化環(huán)。盡管結(jié)構(gòu)很相似，但Cdk5的活化方式卻與其他Cdks不盡相同。

Cdk5在多種神經(jīng)元功能中扮演著重要角色，包括神經(jīng)元遷移分化、存活及突觸的發(fā)生、信息傳遞、可塑性[15-16]等，并可能通過下游底物的磷酸化發(fā)揮作用。

3 Cdk5激活劑

3.1p35/p39 p35是Cdk5的調(diào)節(jié)亞基，Cdk5只有與其活性調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，才能表現(xiàn)出催化活性。經(jīng)鑒定p39(神經(jīng)元Cdk5激活劑亞型)與p35有57%的同源序列。突變研究顯示，雖然p39能掩飾p35缺乏，但只能代償p35的部分功能，而并非全部[17]。p35/p39復(fù)合物突變大鼠與Cdk5缺陷大鼠表現(xiàn)型基本相同，暗示在發(fā)育過程中，兩種調(diào)節(jié)因子對(duì)Cdk5的影響是不能被其他分子代替的。Cdk5的這兩個(gè)非細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白與激活其他Cdks的經(jīng)典細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白不存在序列相似性，但三維結(jié)構(gòu)卻與其基序相似。p35/p39主要定位于細(xì)胞膜。Cdk5通常與其激活劑和底物區(qū)域化。但是，F(xiàn)u等[18]的一個(gè)研究顯示p35通過核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白β、核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5和核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白7動(dòng)態(tài)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間，并可以與它們直接交換進(jìn)入細(xì)胞核。

3.2p25 p25，一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為25×103的蛋白，是p35被中性鈣蛋白裂解后產(chǎn)生的C端片段。p35壽命較短(半衰期<30 min)，而p25與p35不同，它不容易降解，半衰期是p35的2～3倍。而且，p25也可以與Cdk5結(jié)合并使其激活，改變它的細(xì)胞定位和底物特異性。因此，裂解片段p25能夠維持Cdk5的過度激活狀態(tài)，而這種過度激活狀態(tài)通常與神經(jīng)毒性相關(guān)。與p35相似，在細(xì)胞內(nèi)也檢測(cè)到了p39的一個(gè)裂解片段p29，亦可導(dǎo)致Cdk5失調(diào)[19]。

4 Cdk5激酶活性調(diào)節(jié)

4.1Cdk5激活機(jī)制 Cdk5是脯氨酸限定性Ser/Thr蛋白激酶，主要在神經(jīng)元中發(fā)揮作用，通過與調(diào)節(jié)亞單位p35，p25(p35的一個(gè)C端片段)或p39結(jié)合激活。在可再生細(xì)胞，大多數(shù)Cdks是在促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮作用的，而Cdk5活性卻主要在有絲分裂后神經(jīng)元被檢測(cè)到。這是因?yàn)殡m然Cdk5本身在許多細(xì)胞和組織廣泛表達(dá)，但Cdk5活化亞單位p35和p39卻主要在分化神經(jīng)元表達(dá)。Cdk5與其他Cdks的氨基酸序列相似性可高達(dá)50%～60%，而且在結(jié)構(gòu)上與Cdk2相似[20]。盡管p35和p39的氨基酸序列與細(xì)胞周期蛋白類不盡相同，卻能激活Cdk5，這主要是因?yàn)镃dk5結(jié)合p35結(jié)構(gòu)域與Cdk2結(jié)合細(xì)胞周期蛋白A的空間結(jié)構(gòu)是相似的[19]。p35和p25與細(xì)胞周期蛋白在結(jié)構(gòu)和序列方面的差別促成了Cdk5-p35的獨(dú)特激活機(jī)制。特別是，磷酸化激活和細(xì)胞膜相關(guān)性是Cdk5的獨(dú)特性質(zhì)。

4.2Cdk5活性被p35合成和降解調(diào)節(jié) 腦組織中Cdk5的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于p35，這個(gè)研究結(jié)果表明Cdk5激酶活性主要是由神經(jīng)元中可利用的p35蛋白量決定的[21]。而p35蛋白量是由合成和降解之間的平衡控制的。用培養(yǎng)的神經(jīng)元和成神經(jīng)瘤細(xì)胞(他們可在體外分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞)研究p35的合成。在培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠刺激p35表達(dá)[22]。在PC12細(xì)胞，神經(jīng)生長(zhǎng)因子能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)p35表達(dá)，Cdk5激酶活性也隨之大大增強(qiáng)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子主要通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑誘導(dǎo)p35合成。相關(guān)研究報(bào)道在皮層發(fā)育過程中p35是轉(zhuǎn)錄因子熱激蛋白2的靶點(diǎn)[23]。在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白作用下，p35的合成也增強(qiáng)，但是相對(duì)緩慢。當(dāng)小腦神經(jīng)元在層黏連蛋白存在條件下培養(yǎng)時(shí)，p35蛋白水平增加，導(dǎo)致Cdk5活性增加。在維甲酸存在時(shí)人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株細(xì)胞分化，層黏連蛋白誘導(dǎo)p35的mRNA和蛋白高水平表達(dá)，隨后Cdk5活性增加。總之，p35的合成能夠被細(xì)胞外信號(hào)包括營(yíng)養(yǎng)因子和基質(zhì)蛋白等誘導(dǎo)，從而導(dǎo)致Cdk5激活。

4.3Cdk5通過蛋白酶體降解p35失活 p35是短效蛋白，半衰期<30 min。在C33A細(xì)胞、Cos7細(xì)胞和神經(jīng)元均檢測(cè)到了p35的泛素化。p35中不包含與細(xì)胞周期蛋白B和A(后期促進(jìn)復(fù)合物/周期小體)破壞作用框相應(yīng)的氨基酸序列。更確切地說，p35的分解可被岡田軟海綿酸(一種蛋白磷酸酶1和2A抑制劑)刺激，被Cdk5在Thr138位點(diǎn)的磷酸化觸發(fā)。而與p35相似的細(xì)胞周期蛋白D和E，是被泛素連接酶家族的一個(gè)成員SCF復(fù)合物(SKP1-CUL1-F-box蛋白)誘導(dǎo)磷酸化后降解。在皮質(zhì)神經(jīng)元谷氨酸鹽能夠?qū)е聀35降解。谷氨酸鹽處理可短暫激活Cdk5-p35并磷酸化p35，導(dǎo)致其泛素化后降解。與之相反，p35的穩(wěn)定性被蛋白激酶Cδ在Ser59、Ser65或Ser124位點(diǎn)的磷酸化調(diào)節(jié)。磷酸化可抑制p35的泛素化，從而抑制了其降解。在腦發(fā)育神經(jīng)元遷移過程中觀察到了這種作用。因此，p35降解是神經(jīng)元活性的一個(gè)重要調(diào)節(jié)機(jī)制。

5 Cdk5/p35在癲癇相關(guān)病理改變中的作用

5.1Cdk5/p35在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用 雖然Cdk5在哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但是由于其主要的調(diào)節(jié)蛋白p35主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，所以Cdk5相關(guān)的蛋白激酶活性也局限在腦內(nèi)。Cdk5/p35具有十分廣泛的生理作用，可以通過對(duì)tau蛋白磷酸化的調(diào)控來(lái)限定神經(jīng)元極性，參與神經(jīng)元遷移過程，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和再生中發(fā)揮作用，還能磷酸化多種含有賴氨酸-絲氨酸-脯氨酸重復(fù)序列的細(xì)胞骨架蛋白，包括神經(jīng)纖維、微管相關(guān)蛋白tau及有絲分裂原激活蛋白等，參與神經(jīng)元骨架中微管的裝配，以提高微管的穩(wěn)定性，在神經(jīng)元可塑性中起著重要作用[15]。

5.2Cdk5/p35在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用

5.2.1MFS在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用 癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致神經(jīng)元軸突出芽及內(nèi)分子層失神經(jīng)傳入，伴隨的MFS能夠阻斷其與靶細(xì)胞之間的聯(lián)系，促使這種異常出芽回返至上顆粒層，并與該層中間神經(jīng)元樹突和密集的顆粒細(xì)胞形成新的突觸聯(lián)系[24]。新建立的突觸聯(lián)系改變了內(nèi)分子層及門區(qū)的局部環(huán)路，形成異常興奮灶，使發(fā)作敏感性增加，誘導(dǎo)癲癇再次發(fā)作，這種惡性循環(huán)致使癲癇反復(fù)復(fù)發(fā)，成為難治性癲癇。有學(xué)者研究顯示，MFS的變化趨勢(shì)與戊四氮點(diǎn)燃效應(yīng)的逐步建立相一致，且在大鼠癲癇發(fā)作前海馬MFS已經(jīng)出現(xiàn)[25]，說明MFS并非僅是癲癇發(fā)生的結(jié)果，MFS所反映的突觸重建在促進(jìn)癲癇發(fā)生和反復(fù)發(fā)作中起著重要作用。

一般認(rèn)為海馬CA3區(qū)神經(jīng)元死亡可以誘發(fā)MFS，但過多的神經(jīng)元丟失也會(huì)使出芽的苔蘚纖維缺乏靶向，不利于在該區(qū)域進(jìn)行突觸重建，而主要投射向齒狀回內(nèi)分子層。在戊四氮點(diǎn)燃過程中，SD大鼠很少出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，海馬CA3區(qū)只有少量神經(jīng)元受到損傷，尚有足夠數(shù)量健存的錐體細(xì)胞，能夠?yàn)楫愇煌渡涞奶μ\纖維提供頂樹突，建立新的突觸聯(lián)系。因此，除神經(jīng)元死亡能夠誘發(fā)MFS外，還可能存在其他的出芽機(jī)制。

5.2.2Cdk5/p35通過參與MFS促進(jìn)癲癇發(fā)生 田發(fā)發(fā)等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在戊四氮點(diǎn)燃大鼠模型，海馬CA3區(qū)MFS的變化趨勢(shì)與Cdk5及其調(diào)節(jié)亞基p35的mRNA及蛋白表達(dá)水平相一致，提示海馬Cdk5/p35可能通過參與苔蘚纖維出芽，從而促進(jìn)癲癇的發(fā)生。

Cdk5是脯氨酸限定性Ser/Thr蛋白激酶，參與神經(jīng)元遷移分化、突觸的生長(zhǎng)及信息傳遞等，是許多細(xì)胞骨架蛋白成分的主要磷酸化酶。Cdk5主要通過與調(diào)節(jié)亞單位p35或p39結(jié)合而被激活，p35主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)梨狀皮質(zhì)、海馬(CA1、CA3、齒狀回)、杏仁核和內(nèi)嗅皮質(zhì)的分化神經(jīng)元中(尤以海馬內(nèi)濃度最高)，是Cdk5主要的調(diào)節(jié)亞基，又被稱為神經(jīng)元Cdk5激活劑。實(shí)驗(yàn)表明，Cdk5與其調(diào)節(jié)蛋白p35在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用[25]。Cdk5/p35共同參與了神經(jīng)元骨架蛋白-tau蛋白的磷酸化過程，導(dǎo)致其磷酸化水平的變化，進(jìn)而誘發(fā)海馬MFS和突觸重建[27]，從而在癲癇的反復(fù)發(fā)作中起重要作用。

Tomizawa等[28]制備電驚厥大鼠癲癇模型，并在點(diǎn)燃過程中觀察Cdk5蛋白激酶活性及其調(diào)節(jié)亞基p35表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)Cdk5激酶活性隨著癲癇發(fā)作級(jí)別的增加先升后降，p35的表達(dá)變化趨勢(shì)與Cdk5激酶活性的變化相一致；外科手術(shù)切除的顳葉癲癇海馬硬化標(biāo)本中Cdk5活性也有顯著升高[29]，提示Cdk5/p35的確參與了癲癇的發(fā)生。與此同時(shí)，在電點(diǎn)燃過程中，非磷酸化tau蛋白呈逐漸下降趨勢(shì)，至5級(jí)發(fā)作時(shí)最低，而磷酸化tau蛋白在各級(jí)癲癇發(fā)作中均有顯著的增高，以3級(jí)發(fā)作時(shí)升高最顯著。Johanna等[30]在劇烈和長(zhǎng)期發(fā)作的癥狀性癲癇患者腦脊液中檢測(cè)到總tau(T-tau)和磷酸化tau(P-tau)水平升高。T-tau和P-tau在戊四氮點(diǎn)燃進(jìn)程中均增加，并且T-tau和P-tau的亞細(xì)胞定位與Cdk5/p35顯示相同的變化規(guī)律[25]。由此可見，Cdk5/p35可能是通過參與tau蛋白過度磷酸化來(lái)影響海馬MFS和突觸重建，進(jìn)一步促進(jìn)癲癇的發(fā)生和發(fā)展。另外，Cdk5還可以通過突觸后致密物(PSD-95)、蛋白磷酸酶抑制劑1等的磷酸化來(lái)參與海馬的MFS過程。

Cdk5和p35的mRNA和蛋白在大鼠海馬廣泛表達(dá)，主要分布于CA3區(qū)和CA1區(qū)的錐體細(xì)胞、門區(qū)神經(jīng)元和齒狀回顆粒細(xì)胞，在CA3區(qū)MFS過程中Cdk5的mRNA和蛋白表達(dá)，2周內(nèi)主要聚集在胞質(zhì)，4～6周主要在胞膜和突起。MFS形成早期，胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的Cdk5，在胞質(zhì)運(yùn)輸中起一定作用，而在MFS高峰期，胞膜和突起中表達(dá)的Cdk5，主要對(duì)突軸運(yùn)輸起作用，由此可推測(cè)Cdk5促進(jìn)MFS過程可能與其在細(xì)胞內(nèi)的分布變化亦有一定關(guān)系。

6 結(jié) 語(yǔ)

Cdk5作為Cdks家族的一個(gè)特殊成員，不參與細(xì)胞周期調(diào)控，而是通過與其調(diào)節(jié)亞單位p35結(jié)合，在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用。其機(jī)制可能是：Cdk5/p35復(fù)合物形成調(diào)節(jié)Cdk5活性，通過使tau蛋白過度磷酸化來(lái)誘發(fā)海馬MFS和突觸重建，形成異常興奮性環(huán)路，從而促進(jìn)癲癇的發(fā)生和發(fā)展。這些研究成果顯示，進(jìn)一步深入研究Cdk5/p35的結(jié)構(gòu)和功能，及其在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用，不僅對(duì)認(rèn)識(shí)癲癇患者的MFS病理改變機(jī)制具有重要的意義，同時(shí)還將為臨床防治癲癇提供一些新的思路。

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