酶學(xué)檢測(cè)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展

吳開祥(綜述)，孫文平，王學(xué)春(審校)

(泰山醫(yī)學(xué)院病理教研室,山東 泰安 271000)

酶是生物體內(nèi)催化特定化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)、RNA或其復(fù)合體，是機(jī)體在新陳代謝活動(dòng)中不可或缺的催化劑，廣泛參與生命活動(dòng)中物質(zhì)代謝與能量交換等反應(yīng)過程。當(dāng)機(jī)體遭受各種損傷因素，如機(jī)械性損傷、化學(xué)性損傷甚至導(dǎo)致機(jī)體死亡時(shí)，體內(nèi)不同組織細(xì)胞的酶含量和活性均會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化，根據(jù)這一特點(diǎn)，酶學(xué)檢測(cè)可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的檢驗(yàn)鑒定。該文就近年來酶學(xué)檢測(cè)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1 推斷死亡時(shí)間

死亡時(shí)間(postmortem interval，PMI)的推斷始終是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的PMI推斷方法包括尸溫測(cè)量、尸體現(xiàn)象、昆蟲學(xué)數(shù)據(jù)及白骨化等手段。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，有關(guān)PMI推斷的新方法、新技術(shù)逐漸被引入法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如血生化指標(biāo)檢驗(yàn)、玻璃體液分析、酶學(xué)檢測(cè)以及遺傳物質(zhì)的含量變化等。迄今為止，這些方法仍然有其各自的特點(diǎn)和局限性，需要進(jìn)一步的深入研究。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肝細(xì)胞酶活性隨時(shí)間的演變規(guī)律進(jìn)行了深入研究。Gos等[1]通過觀察人死后肝內(nèi)乳酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶的活性變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，兩者可用于晚期PMI推斷。金菊等[2]利用免疫組織化學(xué)和圖像分析技術(shù)研究了在不同PMI和死亡原因下大鼠肝臟組織內(nèi)磷酸果糖激酶2水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種不同死亡原因大鼠肝臟組織內(nèi)該酶含量隨PMI的延長(zhǎng)呈規(guī)律性減弱趨勢(shì)，可以作為推斷PMI的指標(biāo)。閆宜鋒等[3]觀察了不同溫度下大鼠死亡后肝臟內(nèi)5′-核苷酸酶的活性改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠死后21 h內(nèi)5′-核苷酸酶活性與PMI呈明顯負(fù)相關(guān)，故該酶的降解規(guī)律可作為推斷PMI的參考指標(biāo)。

玻璃體液中某些酶活性在死亡后表現(xiàn)出規(guī)律性改變，因此可以作為法醫(yī)學(xué)推斷死亡事件時(shí)間的手段之一。Henke等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)，家兔死亡后玻璃體液中谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶的活性變化與PMI具有一定的相關(guān)性。李興彪等[5]發(fā)現(xiàn)家兔急性胰腺炎死后72 h內(nèi)眼玻璃體液中淀粉酶含量變化可以為早期PMI推斷提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。王偉平等[6]則利用光度法檢測(cè)不同溫度下家兔玻璃體液中膽堿酯酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性降解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)這兩種酶活性變化可以用作推斷死后54 h內(nèi)PMI的較好指標(biāo)。

PMI是表明案件的發(fā)生時(shí)間，對(duì)劃定偵查范圍、確定兇犯和犯罪嫌疑人有非常重要的意義。由于動(dòng)物尸體與人尸體存在很大的差異，而且環(huán)境因素、個(gè)體差異、健康狀況、死因不同及組織細(xì)胞的腐敗自溶等條件均與PMI推斷有關(guān)，因此在實(shí)際檢案工作中，要進(jìn)行綜合分析。

2 推斷損傷時(shí)間

Woertgen等[7]采用撞擊模型研究了大鼠腦損傷后烯醇化酶隨時(shí)間的演變規(guī)律，發(fā)現(xiàn)傷后其血清中烯醇化酶水平逐漸升高，于6 h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性，故認(rèn)為烯醇化酶可用于腦損傷形成時(shí)間的推斷。隨后陳仁輝等[8]采用彌漫性腦損傷模型，證實(shí)了該酶可用于早期法醫(yī)學(xué)鑒定及損傷經(jīng)過時(shí)間的推斷。2010年，焦炎等[9]選取健康體檢者和顱腦損傷者作為研究對(duì)象，證實(shí)腦外傷患者血漿烯醇化酶可作為早期檢測(cè)創(chuàng)傷性顱腦損傷的特異性指標(biāo)，其水平越高，顱腦損傷程度越重。楊靜等[10]建立大鼠腦液壓沖擊傷模型，采用免疫組織化學(xué)與圖像分析技術(shù)檢測(cè)出大鼠腦損傷后半胱天冬酶亞類8的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其傷后30 min開始表達(dá)，隨時(shí)間增加其表達(dá)亦逐漸增加，至24 h達(dá)到高峰后逐漸減少，2周左右基本恢復(fù)正常，這一演變規(guī)律為閉合性腦損傷的早期診斷及損傷時(shí)間推斷提供了依據(jù)。郭曉沖等[11]則通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),大鼠腦挫傷修復(fù)過程中基質(zhì)金屬蛋白酶3的表達(dá)呈時(shí)序性變化規(guī)律，有望用于腦挫傷時(shí)間的推斷。Harter等[12]、蔡紅星等[13]研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液中胱天蛋白酶3(caspase-3)活性誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)變化可以在實(shí)際檢案中作為腦損傷時(shí)間推斷的有效依據(jù)。也有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn),caspase-3的規(guī)律性表達(dá)可用于皮膚切創(chuàng)和骨骼肌挫傷愈合時(shí)間的觀察指標(biāo)[14-15]。Saatman等[16]研究證實(shí),在創(chuàng)傷性軸索損傷后，鈣激活中性蛋白酶在數(shù)小時(shí)內(nèi)短暫激活，傷后4 h可被再次激活。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性腦損傷后，損傷周邊區(qū)的鈣激活中性蛋白酶1和2的表達(dá)隨時(shí)間呈典型的雙峰變化，兩者表達(dá)變化的時(shí)間規(guī)律可以為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中局灶性腦損傷時(shí)間推斷提供相關(guān)的理論依據(jù)[17]。另外，也有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，血紅素加氧酶1可以作為診斷皮下出血時(shí)間進(jìn)程的指標(biāo)[18]。

3 對(duì)致傷(死)原因及機(jī)制的推斷

余榮軍等[19]利用SD大鼠損傷后血清檢測(cè)肌酸激酶及同工酶、乳酸脫氫酶、肌酐、尿素氮等的變化，發(fā)現(xiàn)其血清含量隨打擊力度增加而上升。這些肢體軟組織挫傷造成相關(guān)血清生化指標(biāo)的顯著變化，可為創(chuàng)傷性心肌損害提供理論依據(jù)。在對(duì)急性心肌缺血所致心性猝死的研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)血紅素加氧酶1以及心肌細(xì)胞胞質(zhì)中成纖維細(xì)胞激活蛋白α 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的聯(lián)合表達(dá)檢測(cè)可以作為法醫(yī)尸檢中判斷死因的良好指標(biāo)[20-21]。

Ikegaya等[22]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素C氧化酶可以用于氰化物中毒的診斷指標(biāo)。步建衡等[23]研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)家兔非熱低壓電擊傷后乳酸脫氫酶和羥丁酸脫氫酶活性的變化可為非熱電擊損傷的診斷、損傷時(shí)間推斷提供理論依據(jù)。Nishio等[24]比較了胃促胰酶的含量在過敏性休克與非過敏性休克死者血清中的差異，發(fā)現(xiàn)過敏性休克死者血清胃促胰酶水平顯著升高，認(rèn)為胃促胰酶對(duì)過敏性休克的診斷有一定價(jià)值。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清免疫球蛋白E、類胰蛋白酶含量可對(duì)過敏性猝死的診斷有一定參考價(jià)值[25-26]。

4 體液分析

精子ABO血型的測(cè)定可利用酶標(biāo)記抗體免疫組織化學(xué)法、酶標(biāo)記單克隆抗體法等，經(jīng)實(shí)踐檢驗(yàn)也證明了此類方法靈敏度高，重復(fù)性好，檢材用料少，快速而準(zhǔn)確。Voorhees等[27]則利用纖維素酶消化洗脫法為強(qiáng)奸案中物證的提取提供了良好的途徑。也有學(xué)者通過測(cè)定受害者體內(nèi)精液和前列腺液中酸性磷酸酶活性的變化規(guī)律，為性侵案件的作案時(shí)間提供了良好的線索[28]。

5 種屬鑒別

早在1994年，學(xué)者們就開展了利用酶鑒定昆蟲種屬及其分類的研究。2009年P(guān)ark等[29]利用DNA細(xì)胞色素酶2～6區(qū)序列研究及分類排序成功鑒別韓國(guó)Calliphorinae麗蠅亞科的種屬。王新杰等[30]則利用聚合酶鏈反應(yīng)、電泳等技術(shù)對(duì)中國(guó)的嗜尸性蠅類線粒體編碼細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因進(jìn)行測(cè)序分析，認(rèn)為該序列分析可作為法醫(yī)學(xué)嗜尸性蠅類種屬鑒別的可靠方法。此外，劉牧等[31]應(yīng)用紅細(xì)胞酸性磷酸酶、腺苷脫氨酶、腺苷酸激酶同步電泳分型，從血型遺傳學(xué)角度對(duì)漢族、蒙古族、鄂倫春族等7個(gè)族群血痕中三種酶的表型分布、基因頻率進(jìn)行了調(diào)查，并計(jì)算出識(shí)別能力，與白種人、黑種人比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6 展 望

鑒于酶的獨(dú)有特性，法醫(yī)工作者已經(jīng)將其廣泛應(yīng)用于血型、血痕和精斑鑒定及人和昆蟲物種鑒別等方面，而酶學(xué)檢測(cè)在推斷死因、分析致傷機(jī)制以及損傷和PMI的推斷逐漸成為當(dāng)今法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。今后，如何利用現(xiàn)有的各種檢驗(yàn)技術(shù)，通過簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行活體、尸體以及現(xiàn)場(chǎng)血痕中酶活性、含量等隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)演變規(guī)律進(jìn)行綜合分析，篩選有實(shí)用價(jià)值的檢測(cè)指標(biāo)，成為法醫(yī)工作者今后的研究方向。

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