重組蛋白免疫原性的研究進(jìn)展

朱彩云,馮春顏,崔曉陽,吳文權(quán),朱飛,羅國勝

(廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,深圳 518109)

重組蛋白免疫原性的研究進(jìn)展

朱彩云,馮春顏,崔曉陽,吳文權(quán),朱飛,羅國勝

(廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,深圳 518109)

重組蛋白是目前最為常見的生物藥劑之一,但因其具有不同程度的免疫原性,臨床應(yīng)用時存在誘發(fā)免疫反應(yīng)的潛在危險,一定程度上限制其在臨床上的推廣應(yīng)用。該文介紹了目前報道的重組蛋白誘發(fā)免疫反應(yīng)的機(jī)制及其引起免疫原性的原因,并對當(dāng)前評價重組蛋白免疫原性的方法及降低其免疫原性的途徑進(jìn)行綜述。

生物藥劑;重組蛋白;免疫原性

隨著重組DNA技術(shù)的廣泛應(yīng)用,大規(guī)模生產(chǎn)與內(nèi)源蛋白相同或相似的高純度重組蛋白成為可能,如凝血因子Ⅷ、促紅細(xì)胞生成素、干擾素等。研究該技術(shù)的初衷是為了大批量獲得相應(yīng)的產(chǎn)品,在此基礎(chǔ)上盡可能降低免疫原性,確保臨床用藥安全,但無論是異種治療蛋白、人源重組蛋白、人源化重組蛋白都存在不同程度的免疫原性[1],臨床應(yīng)用時有誘發(fā)免疫反應(yīng)的潛在危險。治療蛋白生產(chǎn)過程的復(fù)雜性和其本身內(nèi)在的不穩(wěn)定性是其誘發(fā)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[2]。筆者著重介紹重組蛋白誘發(fā)免疫反應(yīng)的機(jī)制及影響其免疫原性的相關(guān)因素,并對當(dāng)前評價重組蛋白免疫原性的方法及降低其免疫原性的一些策略進(jìn)行簡述。

1 免疫反應(yīng)的機(jī)制

重組蛋白誘發(fā)免疫反應(yīng)的機(jī)制有以下兩方面。一是經(jīng)典的免疫反應(yīng)(即速發(fā)型反應(yīng)),例如某些用于治療先天相關(guān)基因缺陷患者的某些重組蛋白(比如生長激素、凝血因子Ⅷ等),會成為有效的異種蛋白而誘發(fā)經(jīng)典的免疫反應(yīng)。其特點(diǎn)在于用藥一次就可能發(fā)生,且概率較高;一般產(chǎn)生中和性抗體,體內(nèi)持續(xù)時間較長。二是打破免疫耐受——重組蛋白誘發(fā)免疫反應(yīng)的主要機(jī)制。相對于經(jīng)典的免疫反應(yīng),打破免疫耐受是一個相對緩慢的過程,需要幾年的時間才可能有臨床表現(xiàn),概率較低;停止治療或長期治療,抗體可以消失。例如,重組促紅細(xì)胞生成素通過打破免疫耐受誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自我抗體,最終發(fā)展為單純性紅細(xì)胞再生障礙[3]。

2 免疫原性存在的原因

重組蛋白的生產(chǎn)使用過程是引起重組蛋白免疫原性的主要因素,可分為生產(chǎn)相關(guān)因素和治療相關(guān)因素[4]。

2.1 生產(chǎn)相關(guān)因素 生產(chǎn)過程中的不穩(wěn)定性因素(純化、曝光、冷藏運(yùn)輸?shù)?影響重組蛋白的三維結(jié)構(gòu),使其發(fā)生變性(聚集、氧化),從而誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

一方面,免疫原性存在或增強(qiáng)可能與重組蛋白生產(chǎn)過程中聚合形成微粒體有直接的關(guān)系,聚合的蛋白質(zhì)通過暴露新的表位或已有的表位來增加其免疫原性,微量聚合就能明顯增加其免疫原性[5]。歐洲臨床廣泛使用的藥物Eprex(一種促紅細(xì)胞生成素),其使用后會引起的單純性紅細(xì)胞再生障礙,原因在于組分中高濃度的聚山梨醇酯80促進(jìn)重組促紅細(xì)胞生成素形成了聚合的微粒體,誘發(fā)機(jī)體發(fā)生了自我免疫[3]。BRAUN等[5]建立了正常的Balb/c小鼠和轉(zhuǎn)基因免疫耐受小鼠兩個實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠硌芯扛蓴_素(interferon,IFN-α)組分中聚合的蛋白成分和IFN-α免疫原性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)沒有免疫原性IFN-α單體聚合后能轉(zhuǎn)化為有免疫原性的聚合體;將這些聚合體注射到抗原提呈細(xì)胞和處理細(xì)胞相互協(xié)作的微環(huán)境中,會明顯增加誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的機(jī)會。當(dāng)然,也并非所有的分子聚合體都會增強(qiáng)重組蛋白的免疫原性。HERMELING等[6]認(rèn)為聚合分子的大小和免疫原性的強(qiáng)弱沒有明顯的關(guān)系,并不是聚合的分子越大,免疫原性就越強(qiáng),PUROHIT等[7]通過研究熱應(yīng)激得到的聚集的rFⅧ(重組凝血因子Ⅷ),其免疫原性并沒有增加。

另一方面,蛋白質(zhì)的修飾過程、生產(chǎn)過程中的環(huán)境影響(加熱、冷凍干燥等)等均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯誤折疊[8]。蛋白質(zhì)的錯誤折疊是蛋白質(zhì)的一個內(nèi)在性問題,與一些退行性疾病相關(guān)(如阿爾茨海默病),其淀粉樣變的病變組織可以激活免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。MAAS等[9]研究發(fā)現(xiàn)蛋白的折疊錯誤能打破免疫耐受。生物藥劑存在淀粉樣變的內(nèi)在特性,在外界壓力的條件下會增強(qiáng),其誘發(fā)免疫反應(yīng)強(qiáng)度和錯誤折疊程度呈正相關(guān)性,這種量效關(guān)系不僅影響到打破免疫耐受的概率,同時也影響到抗體升高的程度。

此外,產(chǎn)品包裝會潛在地增加蛋白產(chǎn)品的免疫原性。玻璃表面、潤滑劑、塑料和橡乳膠中的鄰苯二甲酸酯會污染產(chǎn)品,增加其免疫原性。因此重組蛋白的批量生產(chǎn)過程中對產(chǎn)品的包裝不可忽視[10]。

2.2 治療相關(guān)因素 用藥劑量和時間、給藥途徑、用藥者的遺傳背景以及并發(fā)的疾病和相伴隨的治療也會影響重組蛋白的免疫原性。一般認(rèn)為,皮下注射給藥較肌內(nèi)注射和靜脈注射易誘發(fā)免疫反應(yīng)。但也有研究認(rèn)為,給藥途徑本身和蛋白的免疫原性無關(guān),但給藥途徑可以增加發(fā)生免疫反應(yīng)的概率[11]。

3 評價免疫原性的方法

傳統(tǒng)的臨床應(yīng)用前評價免疫原性的檢測方法是通過動物實(shí)驗(yàn)來完成,主要檢測嚙齒類和非人類的靈長類血清抗體[12]。韓國柱等[13]曾經(jīng)討論種屬特異性對蛋白多肽藥物的影響,認(rèn)為相同的實(shí)體在不同種屬之間有所不同。這就有可能使一種活性蛋白在不同種屬試驗(yàn)時變得無活性,且成為一種異物而導(dǎo)致免疫原反應(yīng),但是動物實(shí)驗(yàn)雖有不足之處,卻是臨床應(yīng)用前很必要的環(huán)節(jié),對臨床用藥有一定的指導(dǎo)意義[14]。目前動物研究的靈長類和轉(zhuǎn)基因鼠模型是臨床應(yīng)用前評價重組蛋白免疫原性的兩個常用的模型。轉(zhuǎn)基因鼠較靈長類來源較容易,可以特定地表達(dá)人類基因,對轉(zhuǎn)入基因所表達(dá)的特定人源蛋白產(chǎn)生耐受,已用于檢測含有低水平的重組IFNα-2b聚合蛋白質(zhì)[15]。

此外,已有研究者通過檢測免疫細(xì)胞最終分泌的細(xì)胞因子,實(shí)現(xiàn)體外應(yīng)用樹突狀細(xì)胞先與重組的IFN體外共同培養(yǎng),然后加入自體來源的CD+4T細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng),最終用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法和腺苷增殖法進(jìn)行評估來檢測注射液組分的免疫原性,避免了動物與人之間的差異因素[16]。

4 降低免疫原性的策略

重組蛋白誘導(dǎo)免疫反應(yīng)必須和幾種經(jīng)典的免疫細(xì)胞相互反應(yīng),包括抗原提呈細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等。每種細(xì)胞識別獨(dú)特的抗原,阻斷其中任何一個環(huán)節(jié)即可明顯降低臨床發(fā)生免疫原性的概率[14]。

TANGRI等[17]通過重組蛋白——促紅細(xì)胞生成素實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了重組蛋白的免疫原性和若干免疫輔助性T細(xì)胞表位有關(guān),可以通過修飾改變重組蛋白分子表面的這些相關(guān)表位來減弱其與主要組織相容性復(fù)合體分子的結(jié)合力,進(jìn)而降低免疫原性,這一研究表明系統(tǒng)地、有預(yù)測性地降低重組蛋白的免疫原性的可能。TANGRI等[18]描述了一門整合的生物信息學(xué)——Immuno Stealth,解釋了關(guān)于重組蛋白應(yīng)用后發(fā)生免疫反應(yīng)的生物化學(xué)和分子免疫學(xué)途徑?！巴庠础钡募?xì)胞表位通過序列分析和體外高通量的生物化學(xué)方法進(jìn)行評價,然后用分子免疫學(xué)的方法進(jìn)行確認(rèn),進(jìn)而通過修飾改變其與人類白細(xì)胞抗原的結(jié)合力,使其不能被免疫系統(tǒng)識別。該技術(shù)的應(yīng)用,將生產(chǎn)出更安全、更有效、更經(jīng)濟(jì)的重組蛋白。WIM等[19]認(rèn)為應(yīng)著重優(yōu)化重組蛋白的分子設(shè)計及測定方法,以盡量降低其免疫原性的產(chǎn)生。

5 結(jié)束語

重組蛋白是一種極具應(yīng)用前景的生物藥劑,但往往因其存在一定的免疫原性,應(yīng)用受到較大限制。

目前,完全預(yù)測重組蛋白免疫原性較為困難。明確重組蛋白在生產(chǎn)或儲存過程中其免疫原性增加的可能因素,對減少重組蛋白免疫原性引起的副作用,提高生物藥劑的質(zhì)量具有一定的價值。動物模型和耐受人源蛋白的轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn),雖然不可能完全預(yù)測重組蛋白在患者體內(nèi)的免疫原性,但有助于系統(tǒng)研究重組蛋白的物理和化學(xué)變化與免疫原性之間的聯(lián)系,可檢測引起免疫原性的組分和結(jié)構(gòu)變異,為進(jìn)一步優(yōu)化重組蛋白的組分和生產(chǎn)工藝提供基礎(chǔ)。

體外應(yīng)用樹突狀細(xì)胞蛋白產(chǎn)品的免疫原性及有預(yù)見性的設(shè)計與蛋白產(chǎn)品相似的抗原表位,干擾其與抗原提呈細(xì)胞的結(jié)合,從而降低產(chǎn)品的免疫原性,又不影響其本身的治療特性是更有意義的降低免疫原性的辦法。盡管已經(jīng)有許多降低重組蛋白免疫原性的方法,對于所有的重組蛋白而言,臨床試驗(yàn)階段進(jìn)行抗體的檢測,以及售后藥物監(jiān)察仍是一項(xiàng)很重要的任務(wù)[20]。BEE等[21]認(rèn)為將來會有某種特殊的蛋白質(zhì)粒子在降低生物蛋白制劑的免疫原性以及其售后監(jiān)測方面發(fā)揮重要作用。

相信將優(yōu)化重組蛋白產(chǎn)品生產(chǎn)過程,建立正確的動物模型,以及建立體外檢測方法等手段的結(jié)合,重組蛋白產(chǎn)品的免疫原性將會得到很好的預(yù)測,臨床應(yīng)用也會更安全、更廣泛。

[1] HERMELING S,CROMMELIN D J,SCHELLEKENSH,et al.Structure-immunogenicity relationships of therapeutic proteins[J].Pharm Res,2004,2(6):897-903.

[2] SHARMA B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 3:impact of manufacturing changes[J].Biotechnol Adv, 2007,25(3):325-331.

[3] SCHELLEKENSH.Factors influencing the immunogenicity of therapeutic proteins[J].Nephrol Dial Transplant,2005, 20(Suppl6):vi3-vi9.

[4] SHARMA B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 1:Impact of product handling[J].Biotechnol Adv,2007,25(3):310-317.

[5] BRAUN A,KWEE L,LABOW M A,et al.Protein aggregates seem to play a key role among the parameters influencing the antigenicity of interferon alpha(IFN-α)in normal and transgenic mice[J].Pharm Res,1997,14 (10):1472-1478.

[6] HERMELING S,ARANHA L,DAMEN J M A,et al. Structural characterization and immunogenicity in wildtype and immune tolerant mice of degraded recombinant human interferon alpha2b[J].Pharm Res,2005,22(12): 1997-2006.

[7] PUROHITV S,MIDDAUGH CR,BALASUBRAMANIAN S V.Influence of aggregation on immunogenicity of recombinant human factorⅧin hemophilia a mice[J].J Pharm Sci,2006,95(2):358-371.

[8] LYUBCHENKO Y L,SHERMAN S,SHLYAKHTENKO L S,et al.Nanoimaging for protein misfolding and related diseases[J].JCell Biochem,2006,99(1):52-70.

[9] MAAS C,HERMELING S,BOUMA B,et al.A Role for protein misfolding in immunogenicity of biopharmaceuticals [J].JBiol Chem,282(4):2229-2236.

[10] SHARMA B.Immunogenicity of therapeutic proteins.Part 2:impact of container closures[J].Biotechnol Adv,2007, 25(3):318-324.

[11] JEAN-CHARLES R Y F,SCHELLEKENS H.Immunogenicity of rDNA-derived pharmaceuticals[J].Trends Pharmacol Sci,2002,23(6):254-256.

[12] CHIRINO A J,ARY M L,MARSHALL SA.Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics[J].DDT,2004,9 (2):82-90.

[13] 韓國柱,何巍,任開環(huán).蛋白多肽類藥物的藥動學(xué)特點(diǎn)及其影響因素[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2003,22(1):9-11.

[14] HERMELING S,SCHELLEKENSH,MAASC,et al.Antibody response to aggregated human interferon alpha2b in wild-type and transgenic immune tolerantmice depends on type and level of aggregation[J].J Pharm Sci,2006,95 (5):1084-1096.

[15] WIERDA D,SMITH H W,ZWICKL C M.Immunogenicity of biopharmaceuticals in laboratory animals[J].Toxicol, 2001,158(1-2):71-74.

[16] JABER A,BAKER M.Assessment of the immunogenicity of different interferon beta-1αformulations using ex vivo T-cell assays[J].J Pharm Biomed Anal,2007,43(4): 1256-1261.

[17] TANGRI S,MOTHE′B R,EISENBRAUN J,et al.Rationally engineered therapeutic proteins with reduced immunogenicity[J].J Immunol,2005,174(6):3187-3196.

[18] TANGRIS,LICALSIC,SIDNEY J,et al.Rationally engineered proteins or antibodies with absent or reduced immunogenicity[J].Curr Med Chem,2002,9(24):2191-2199.

[19] WIM J,RANDOLPH T W,VOLKIN D B,et al.Protein instability and immunogenicity:roadblocks to clinical application of injectable protein delivery systems for sustained release[J].J Pharm Sci,2012,101(3):946-954.

[20] SCHELLEKENSH.Immunogenicity of therapeutic proteins: clinical implications and future prospects[J].Clin Ther, 2002,24(11):1720-1740.

[21] BEE JS,GOLETZ T J,RAGHEB JA.The future of protein particle characterization and understanding its potential to diminish the immunogenicity of biopharmaceuticals:A shared perspective[J].JPharm Sci,2012,101(10):3580-3585.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.020

R977.6

A

1004-0781(2014)12-1617-03

2013-12-16

2014-02-17

朱彩云(1980-),女,山西長治人,主管檢驗(yàn)師,醫(yī)師,碩士,主要研究方向:免疫學(xué)。電話:(0)13823361983,E-mail:zhucaiyun20051146@126.com。