Fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究進(jìn)展

高 翔，李文德

(廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023)

多不飽和脂肪酸(PUFAs)為人體必需脂肪酸，具有很重要的生理功能。其中與人體健康密切相關(guān)的PUFAs主要是n－3和n－6 PUFAs。攝入高水平的n－3 PUFAs伴有較低的n－6 PUFAs可以促進(jìn)嬰幼兒視網(wǎng)膜、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育;降低人體心血管疾病和炎癥的發(fā)生，還可以抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞［1～4］的增生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。這提示n－6/n－3 PUFAs的比例對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常生長(zhǎng)起著關(guān)鍵的作用。世界衛(wèi)生組織建議，人體內(nèi)正常細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞器n－6/n－3 PUFAs理想比例應(yīng)該在1∶1到4∶1。隨著社會(huì)的發(fā)展，大量的加工和養(yǎng)殖產(chǎn)品的出現(xiàn)，人類(lèi)食用非野生動(dòng)植物過(guò)量導(dǎo)致體內(nèi)的脂肪酸比例嚴(yán)重的失去平衡。大部分人體內(nèi)n－6/n－3 PUFAs比例可能達(dá)到10～15∶1［5］。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因主要是哺乳動(dòng)物生物體內(nèi)缺乏合成n－3 PUFAs前體的酶，也缺乏將n－6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n－3 PUFAs的酶，使得n－6/n－3 PUFAs比例失調(diào)。大量的流行病學(xué)資料顯示，飲食中的n－6/n－3 PUFAs比例過(guò)高，特別是n－3 PUFAs的缺乏，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體功能障礙，引發(fā)一系列的疾病的發(fā)生(如心腦血管疾病、癌癥、精神性疾病等)。為了更好地研究n－6/n－3 PUFAs比例對(duì)這類(lèi)疾病的防治作用和相關(guān)機(jī)制，建立一個(gè)能排除飲食等混雜因素的干擾，并有良好的對(duì)照動(dòng)物模型是非常必要的。而fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠模型的出現(xiàn)為研究者們提供了一個(gè)很好無(wú)干擾性因素的實(shí)驗(yàn)工具。

1 Fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠

2004年美國(guó)哈佛大學(xué)麻省總醫(yī)院的康景軒博士實(shí)驗(yàn)室培育出一種能將n－6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n－3 PUFAs的轉(zhuǎn)基因小鼠［6］，此小鼠攜帶來(lái)源于線蟲(chóng)(C.elegans)并表達(dá)n－3脂肪酸去飽和酶的fat－1基因，為了能在小鼠體內(nèi)中表達(dá)的來(lái)自線蟲(chóng)(C.elegans)異源性的n－3脂肪酸去飽和酶，Kang等［7］優(yōu)化了編碼該蛋白質(zhì)的fat－1基因的密碼子并將其耦合到一個(gè)雞的β－肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子中。然后，通過(guò)顯微注射方法將表達(dá)的載體導(dǎo)入受精卵，產(chǎn)生表達(dá)fat－1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，因此，即使在缺少富含n－3的飲食的條件下，小鼠自身也可以將體內(nèi)n－6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n－3 PUFAs，從而使動(dòng)物的組織和器官中富含n－3 PUFAs，并且組織中的n－6/n－3 PUFAs比例趨于均衡。因此，fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠是一個(gè)研究n－3 PUFAs的生物學(xué)功能和探討n－6/n－3 PUFAs比例在各種疾病中的作用的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

當(dāng)fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型小鼠都喂養(yǎng)含有高的n－6 PUFAs(主要是亞油酸，18∶2)和極低的 n－3 PUFAs(約占總脂肪的0.1%)的飲食一段時(shí)間后，兩種小鼠體內(nèi)的脂肪酸分布極不相同。野生型小鼠組織和器官內(nèi)含有的多不飽和脂肪酸絕大多數(shù)為n－6PUFAs的亞油酸(LA，18∶2 n－6)和花生四烯酸(AA，20∶4 n－6)，幾乎不含 n －3 PUFAs，與野生型小鼠比，fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的n－3 PUFAs含量明顯提高，其中主要包含亞麻酸(ALA，18∶3 n－3)、二十碳五烯酸(EPA，20∶5 n －3)、二十二碳五烯酸(DPA，22∶5 n－3)和二十二碳六烯酸(DHA，22∶6 n－3)，同時(shí) n－6 PUFAs中LA和AA的含量下降，但組織的總的脂肪酸的含量不變，這表明fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠可以將體內(nèi)的n－6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n－3 PUFAs，從而使它們的比值從20～50下降到約為1。這種情況可在小鼠的肌肉、母乳、血紅細(xì)胞、心臟、腦、肝臟、腎臟、肺、脾臟等組織和器官中都可被檢測(cè)出。另外研究還發(fā)現(xiàn)fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠不但非常健康，而且在繁育數(shù)代之后，它們后代小鼠的組織和器官內(nèi)n－3 PUFAs高含量的現(xiàn)象仍然得以保留，這就表明轉(zhuǎn)入的fat－1基因具有良好的遺傳性和較高的生物學(xué)活性［7］。

2 Fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠的優(yōu)勢(shì)

與飲食補(bǔ)充的方法相比較，fat－1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法在改變組織中n－6/n－3 PUFAs比例方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它不僅可以增加n－3 PUFAs的含量，而且還可以明顯減低n－6 PUFAs的水平，從而更有效的使n－6/n－3 PUFAs比例趨于均衡，而不改變總體的脂肪酸的含量(如fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型小鼠組織中n－3和n－6 PUFAs總量保持不變，但其比例已發(fā)生改變)。因此，fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠模型是改變組織中n－6/n－3 PUFAs比例的理想方法。

另外，使用fat－1小鼠模型可以減少因長(zhǎng)期喂養(yǎng)(2～3月或更長(zhǎng))不同飼料所帶來(lái)的麻煩，節(jié)省時(shí)間與金錢(qián)。在fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，脂肪酸成分的改變(將n－6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n－3 PUFAs)發(fā)生早在胚胎階段，并持續(xù)于小鼠整個(gè)壽命階段。因此，fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠提供了一個(gè)方便的模型，用以研究在不同的年齡或時(shí)間點(diǎn) n－3 PUFAs的生物學(xué)作用。

此外，fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠可以和現(xiàn)有疾病模型小鼠(轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠，如ob/ob肥胖模型，apoE－/－動(dòng)脈粥樣硬化模型，)進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的子代可用于研究n－3 PUFAs或不同n－6/n－3 PUFAs比例對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的影響。

3 Fat－1轉(zhuǎn)基因鼠模型的研究現(xiàn)狀

3.1 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用 神經(jīng)系統(tǒng)中富含n－3 PUFAs，尤其是二十二碳六烯酸(DHA)。DHA是人的大腦發(fā)育、成長(zhǎng)的重要物質(zhì)之一，是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)及維持的一種主要元素。它在人體大腦皮層中約占磷脂脂肪酸的40%，在神經(jīng)組織中約占脂肪含量的25%。作為腦中的主要脂肪酸成分，DHA可以影響神經(jīng)細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)和功能。因此研究n－3 PUFAs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的保護(hù)機(jī)制有重要的意義。

最近利用fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，增加腦部的DHA可以顯著增加神經(jīng)細(xì)胞增殖數(shù)量，并且通過(guò)增加海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹(shù)突棘密度使海馬區(qū)的軸突數(shù)量增多。與此同時(shí)，在Morris水迷宮測(cè)試中，與同窩野生型小鼠相比，fat－1小鼠表現(xiàn)出更好的空間學(xué)習(xí)能力。在體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明DHA可促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖能力和神經(jīng)分化能力。這些結(jié)果提供了直接的證據(jù)，表明DHA能促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和軸突形成并對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用［8］。另外，Lebbadi等［9］還研究了n－3 PUFAs對(duì)阿爾茨海默病的防治作用。研究者將純合子(ho)的三轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠(3×Tg－AD)和雜合子(he)的fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，結(jié)果顯示在20月齡時(shí)，對(duì)比3×Tg－AD小鼠，3×Tg－AD/fat－1小鼠腦內(nèi)n－6/n－3 PUFAs比值增加了10%，DHA增加了6%。fat－1基因的表達(dá)也使3×Tg－AD/fat－1小鼠腦內(nèi)的可溶性Aβ42減少41%，可溶性磷酸化tau蛋白下降25%，非可溶性磷酸化tau蛋白下降55%，反應(yīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)減少37%。這些結(jié)果表明增加腦內(nèi)的n－6/n－3 PUFAs比例和DHA可改善AD樣的神經(jīng)病理學(xué)病變。同樣，在慢性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病帕金森綜合征的研究中，Bousquet等［10］發(fā)現(xiàn)，fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠雖不足已對(duì)抗1－甲基 －4－苯基 －1，2，3，6－四氫吡啶(MPTP)所造成的神經(jīng)損傷，但是腦皮質(zhì)的較高的DHA與黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元呈正相關(guān)，不僅能增加酪氨酸羥化酶(TH)的陽(yáng)性數(shù)量，也能增加多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DAT)和黑質(zhì)的孤兒核受體(Nurr1)mRNA的表達(dá)。這足以證明DHA對(duì)帕金森的保護(hù)作用。因此，提示n－3 PUFAs是有益于阿爾茨海默病，帕金森病的預(yù)防和治療。

3.2 對(duì)心血管系統(tǒng)的作用 心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)，特別是50歲以上中老年健康的常見(jiàn)病。全世界每年死于心血管疾病的人數(shù)達(dá)到1500萬(wàn)人，居各種死因的首位。目前心血管疾病已經(jīng)成為危害人類(lèi)健康的“頭號(hào)無(wú)聲殺手”［11］。有大量研究證實(shí)n－3 PUFAs有助于預(yù)防心血管疾病的發(fā)生，還能對(duì)某些心血管疾病(特別是動(dòng)脈粥樣硬化)起到治療作用。但是，通過(guò)飲食補(bǔ)充n－3PUFAs來(lái)研究其對(duì)心血管疾病(特別是動(dòng)脈粥樣硬化)的影響，存在著一定干擾因素。因此，Wan等人［12］將模擬動(dòng)脈粥樣硬化apoE－/－模型小鼠和 fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠雜交培育出apoE－/－/fat－1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠。相比較 apoE－/－小鼠，雙轉(zhuǎn)基因小鼠主動(dòng)脈病變面積顯著性地降低了6.32%。但是，除血清中較高的甘油三酯外，雙轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的水平與apoE－/－小鼠沒(méi)有顯著性差異。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，雙轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)前列腺素E2(PGE2)、細(xì)胞間粘附分子－1、單核細(xì)胞趨化蛋白 －1、白細(xì)胞介6(IL－6)和環(huán)氧合酶－2(COX－2)表達(dá)減少。這表明體內(nèi)高含量的n－3 PUFAs有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其作用機(jī)制可能與其抗炎作用密切相關(guān)。

3.3 抗癌作用 研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中n－6/n－3 PUFAs的比值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常水平。體內(nèi)n－6/n－3 PUFAs比例的失調(diào)，會(huì)導(dǎo)致乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等癌癥發(fā)生。目前研究者對(duì)于fat－1基因抗腫瘤的作用有了初步的認(rèn)識(shí)，但是其抗腫瘤的機(jī)制現(xiàn)還不是很清楚。為了探討n－6/n－3 PUFAs比例與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系，Xia等［13］將小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞植入fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型小鼠(wt)體內(nèi)，觀察兩種小鼠的腫瘤的形成和成長(zhǎng)速率，與wt小鼠相比，fat－1小鼠體內(nèi)黑色素瘤形成和發(fā)展都顯著減慢，而且腫瘤和周邊的組織中均含有較高的n－3 PUFAs及其代謝產(chǎn)物PGE3，此外，腫瘤抑制因子PTEN基因也顯著上調(diào)。體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，n－3 PUFAs的抗腫瘤機(jī)制可能是通過(guò)增加PGE3來(lái)激活PTEN通路。另一方面的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織的n－3 PUFAs能有效的預(yù)防結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。Nowak等［14］在用炎癥物質(zhì)(葡聚糖硫酸鈉)和致癌物質(zhì)(氧化偶氮甲烷)誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤發(fā)生的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)率都有所下降，并伴有活性較低的NF－kB、iNOS和較高水平的 TGF－β。Jia等［15］還發(fā)現(xiàn)，n－3 PUFAs可降低CD3+T細(xì)胞，CD4+T輔助細(xì)胞和腸道內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，這表明n－3 PUFAs可通過(guò)降低炎癥來(lái)抑制結(jié)腸癌的發(fā)生。為了確定n－6/n－3 PUFAs比例對(duì)前列腺癌的影響，Berquin等［16］將fat－1小鼠和前列腺特異性Pten基因敲除小鼠(一種前列腺癌模型)雜交培育出Pten基因敲除+fat－1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)相對(duì)Pten基因敲除小鼠，雙轉(zhuǎn)基因小鼠可顯著性的降低腫瘤生長(zhǎng)率和增加小鼠的存活率，而且還可減少磷酸化的細(xì)胞凋亡因子Bad的比例。同樣，在fat－1小鼠中觀察到，n－3 PUFAs可以促進(jìn)乳腺的分化來(lái)降低乳腺癌的發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［17］。還有研究發(fā)現(xiàn)，DHA能上調(diào)配體蛋白聚糖－1(SDC－1)來(lái)抑制MEK/Erk/Bad信號(hào)通路從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡［18］。

3.4 抗骨質(zhì)疏松作用 骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征，以致骨的脆性增高及骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身骨病。OP多發(fā)于老年人群，與其相關(guān)的骨折是導(dǎo)致死亡或喪失活動(dòng)能力的主要原因［19］。個(gè)體骨量是由飲食、身體活動(dòng)、遺傳因素等共同決定的。近年越來(lái)越多的研究提示飲食因素中PUFA對(duì)骨骼健康有重要的影響。其中研究報(bào)道n－3 PUFAs有防治骨丟失中的作用。

Rahman等［20］研究喂養(yǎng)含10%半純化AIN－93M飲食后的fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠、野生型小鼠、去卵巢fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠及去卵巢野生小鼠之間骨密度的差異，發(fā)現(xiàn)，與去卵巢的wt小鼠比較，去卵巢fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠可降低NF－kB配體受體激活因子(RANKL)和血清中的堿性磷酸酶，增加股骨遠(yuǎn)端，脛骨近端，股骨中段的骨密度。體外實(shí)驗(yàn)顯示，去卵巢的wt小鼠，去卵巢fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞在LPS刺激下，后者體內(nèi)的促炎因子 TNF－α、IL－1β、IL－6顯著降低，而抗炎因子IL－10、干擾素－2、NO顯著提高，并且降低了環(huán)氧化酶－2和NF－kB的活性。這提示omega－6/omega－3的低比例可產(chǎn)生抗炎作用來(lái)防治去卵巢小鼠骨密度的丟失。隨后，Banu等［21］也研究了 n－3 PUFAs對(duì)去卵巢小鼠的骨質(zhì)影響情況，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠在去卵巢手術(shù)后，在股骨末梢、股骨頸、近端脛骨及第四腰椎有顯著骨質(zhì)丟失;而去卵巢的fat－1小鼠在上述部位沒(méi)有觀察到明顯的骨質(zhì)丟失。這表明，n－3 PUFAs可以減輕去卵巢術(shù)誘導(dǎo)的多個(gè)部位骨質(zhì)丟失，其中最主要的是減少骨內(nèi)皮質(zhì)表面的骨吸收。

4 展望

n－3 PUFAs具有抗炎，緩解動(dòng)脈粥樣硬化等抗心血管疾病，抑制腫瘤的發(fā)生和癌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖和遷移的作用;還與人類(lèi)多種神經(jīng)性疾病有關(guān)，可改善阿爾茨海默病和帕金森綜合征的癥狀;此外還能預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的骨量的丟失。鑒于n－3 PUFAs對(duì)多種疾病均有防御和治療作用，更深入的研究其與疾病之間的作用機(jī)制顯得更為重要。而fat－1轉(zhuǎn)基因小鼠模型在研究過(guò)程中有著不可替代的先天優(yōu)勢(shì)，該模型小鼠以及它與其他基因改造的各種疾病模型小鼠雜交的后代，將為進(jìn)一步揭示n－3 PUFAs的藥理作用及其分子機(jī)制提供重要基礎(chǔ)平臺(tái)。fat－1小鼠必將更廣泛地應(yīng)用到PUFAs與疾病關(guān)系的研究中。

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