臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合UM171對(duì)臍血源CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增效果研究

李猛盛宏霞劉陽廖麗田寵孫鵬張斌陳虎

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合UM171對(duì)臍血源CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增效果研究

李猛1盛宏霞1劉陽2廖麗1田寵1孫鵬1張斌1陳虎1

目的 研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合UM171對(duì)臍血來源CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增效果。方法 臍血來源CD34+細(xì)胞及臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞分為以下4組進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)10 d：對(duì)照組、UM171培養(yǎng)組、間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)組、UM171聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)組，采用方差分析比較不同組別間細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)及流式表型和集落培養(yǎng)情況。結(jié)果 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞CD105，CD73，CD90，不表達(dá)CD14，CD34，CD19，CD45，HLA-DR，經(jīng)過誘導(dǎo)可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化。CD34+細(xì)胞在不同條件下體外培養(yǎng)10 d后，UM171培養(yǎng)組總有核細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增14倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增13.5倍；MSCs共培養(yǎng)組總有核細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增11倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增10倍；聯(lián)合培養(yǎng)組總有核細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增達(dá)22倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增21倍。聯(lián)合培養(yǎng)組擴(kuò)增后細(xì)胞CD34+CD38-比例達(dá)（91.49±2.67）﹪，較間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)組（78.11±2.35）﹪及UM171培養(yǎng)組（91.49±2.68）﹪相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.01）。擴(kuò)增后細(xì)胞集落培養(yǎng)14 d后，各系集落形成良好，UM171擴(kuò)增組細(xì)胞較MSCs擴(kuò)增組在紅系及粒系形成能力方面存在優(yōu)勢(shì)。結(jié)論 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞作為細(xì)胞滋養(yǎng)層可提高CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增效果，UM171在擴(kuò)增過程中可較好的保持細(xì)胞干性，二者聯(lián)合應(yīng)用擴(kuò)增效果最佳，建立的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合UM171對(duì)臍血源CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增方法可用于CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)。

間質(zhì)干細(xì)胞； CD34+； 造血干細(xì)胞； 臍血

自1989[1]年第1例臍帶血移植開展以來，臍帶血作為造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的重要來源一直備受關(guān)注，臍帶血移植的優(yōu)勢(shì)在于其不需要嚴(yán)格的人類白細(xì)胞主要抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型，對(duì)供者無傷害且不存在倫理問題，感染風(fēng)險(xiǎn)小，可冷凍保存使用便捷[2-3]等。制約其在臨床中大量應(yīng)用的最主要障礙在于臍帶血中HSCs的數(shù)量有限，移植后會(huì)導(dǎo)致造血恢復(fù)延遲，感染風(fēng)險(xiǎn)增加等問題[4]。而雙份臍帶血移植則會(huì)增加移植的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致植入延遲等問題出現(xiàn)，且會(huì)增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。近年來國內(nèi)外一直嘗試對(duì)臍帶血來源造血干祖細(xì)胞（hematopoietic stemprogenitorcells，HSPCs）進(jìn)行體外擴(kuò)增，以解決其細(xì)胞數(shù)量不足的問題。目前HSPCs擴(kuò)增技術(shù)主要有細(xì)胞因子擴(kuò)增技術(shù)，化學(xué)分子擴(kuò)增技術(shù)，聯(lián)合培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)以及三維培養(yǎng)系統(tǒng)的應(yīng)用[6]。涉及臍血源HSPCs擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，并證實(shí)了擴(kuò)增后HSPCs的安全性及有效性[7]，但最佳的擴(kuò)增條件至今尚沒有明確的共識(shí)。

造血微環(huán)境在HSCs的成長(zhǎng)分化過程中扮演重要角色，體外培養(yǎng)過程中能否更有效的模擬造血微環(huán)境，是決定HSPCs體外擴(kuò)增效果的重要先決條件。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchyma stem cells，MSCs）作為造血微環(huán)境的重要組成部分，可以分泌造血生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，為HSPCs的增殖提供信號(hào)，研究表明其與HSPCs共培養(yǎng)可以顯著提高擴(kuò)增效率[8]。UM171是造血干細(xì)胞龕中篩選出的選擇性的人HSCs再生激動(dòng)劑，可以選擇性的增加長(zhǎng)期HSPCs的再生[9]。鑒于以上結(jié)果，為更有效的模擬造血微環(huán)境，本研究采用與臍血同源的MSCs與UM171聯(lián)合應(yīng)用于臍血HSPCs的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，取得了較好的效果，截至本文發(fā)稿前該方法在國內(nèi)外均無相關(guān)報(bào)道。

材料與方法

一、材料

1.標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)用臍帶及臍血均源自307醫(yī)院產(chǎn)科，報(bào)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)KY-2016-8-36）并征得產(chǎn)婦及家屬同意。健康足月順產(chǎn)產(chǎn)婦娩出胎盤后，無菌剪刀采集臍帶30 cm，并收集于相應(yīng)臍血儲(chǔ)存于臍血采集袋中。

2.實(shí)驗(yàn)用試劑：UM171（美國Selleck公司）；無血清擴(kuò)增培養(yǎng)基（StemSpanTMSFEMⅡ，美國StemCell公司）、甲基纖維素培養(yǎng)基（MethoCultTM，美國StemCell公司）；干細(xì)胞因子（SCF，美國R&D Systems）、促血小板生成素（TPO，美國R&D Systems）、fms樣酪氨酸激3（FLT3，美國R&D Systems）；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（美國GE醫(yī)療集團(tuán)）；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Gibco公司）、雙抗（美國Gibco公司）、DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司）、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；CD34 MicroBead Kit UltraPure（德國MACS公司）；

二、方法

（一）實(shí)驗(yàn)分組

依據(jù)是否與MSCs共培養(yǎng)及是否添加UM171將實(shí)驗(yàn)分為以下4組：對(duì)照組、UM171培養(yǎng)組、MSCs共培養(yǎng)組、UM171及MSCs共培養(yǎng)組。每次培養(yǎng)設(shè)3個(gè)副孔，重復(fù)6次。

（二）細(xì)胞制備

1.MSCs制備：采集的臍帶在無菌條件下應(yīng)用含1﹪雙抗的生理鹽水反復(fù)沖洗，手術(shù)剪剪至1 mm3小塊，轉(zhuǎn)移至含有0.2﹪Ⅱ型膠原酶的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃震蕩消化1 h，得到的消化液分別過100目及50目濾網(wǎng)，濾液900×g離心15 min洗滌2遍，棄上清液后重懸于培養(yǎng)基中（包含20﹪ FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1﹪雙抗及DMEM/F12培養(yǎng)基）。

2.臍血CD34+細(xì)胞制備：臍血與PBS按1 ： 2稀釋，50 ml離心管中加入20 ml Ficoll密度梯度淋巴分離液，傾斜離心管，緩慢加入30 ml稀釋后各血樣至分離液上層。4 ℃下400×g離心30 min，吸取中層灰白色單個(gè)核細(xì)胞層至50 ml離心管中，加入5倍體積PBS混勻后400×g離心10 min清洗2次，加入MACS緩沖液300 μl重懸并計(jì)數(shù)。采用德國美天尼公司CD34磁珠分選技術(shù)，將上述單個(gè)核細(xì)胞懸液分別加入100 μl FcR Blocking reagent和CD34 MicroBeads UltraPure混勻后置于4 ℃冰箱孵育30 min。孵育完成后加入10 ml MACS緩沖液500×g離心10 min，棄上清液加入MACS緩沖液500 μl重懸。500 μl MACS緩沖液預(yù)濕分選柱，將上述懸液過柱子后，500 μl MACS緩沖液清洗3次，將分選柱移出磁場(chǎng)，加入2 ml MACS緩沖液，迅速用配套活塞推出液體至15 ml離心管中，計(jì)數(shù)備用。

（三）細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)

1.對(duì)照組：對(duì)照組采用StemSpanⅡ無血清培養(yǎng)基，添加100 ng/ml SCF，100 ng/ml FLT3，50 ng/ml TPO六孔板中細(xì)胞接種密度為1×105個(gè)/孔，置于37 ℃ 5﹪CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。

2.UM171擴(kuò)增組：采用StemSpanⅡ無血清培養(yǎng)基，添加100 ng/ml UM171，以及100 ng/ml SCF，100 ng/ml FLT3，50 ng/ml TPO，取適量培養(yǎng)基于六孔板中，分選的CD34+細(xì)胞接種密度為1×105個(gè)/孔，置于37 ℃ 5﹪ CO2培養(yǎng)箱中，間隔3 ～ 4 d換液，培養(yǎng)10 d后行指標(biāo)檢測(cè)。

3.臍帶MSCs共培養(yǎng)組：分離到的臍帶MSCs貼壁培養(yǎng)48 h后去除未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，間隔3 ～ 4 d換液1次。待細(xì)胞90﹪融合后，0.25﹪胰蛋白酶消化并傳代，3次傳代后以5×104個(gè)/孔濃度鋪于6孔板中，加入MSCs培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁90﹪融合后采用GWXJ80型60Co照射，總劑量為10 Gy，去除培養(yǎng)基，加入StemSpanⅡ無血清培養(yǎng)基，并添加100 ng/ml SCF，100 ng/ml FLT3，50 ng/ml TPO，按1×105個(gè)/孔密度接種分選的CD34+細(xì)胞，置于37 ℃ 5﹪CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，間隔3 ～ 4 d換液。

4.UM171及MSCs共培養(yǎng)組：參照臍帶MSCs共培養(yǎng)組培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基中額外添加100 ng/ml UM171。

（四）流式檢測(cè)

采用BD FACSCalibur流式檢測(cè)儀，取培養(yǎng)前及培養(yǎng)后細(xì)胞懸液20 μl均分為2個(gè)管，1管加入FITC標(biāo)記的抗體CD34，PE標(biāo)記的抗體CD133，APC標(biāo)記的抗體CD38；2管加入1管對(duì)應(yīng)同型對(duì)照抗體FITC標(biāo)記的抗體Mouse IgG2a，PE標(biāo)記的抗體Mouse IgG1，APC標(biāo)記的抗體Mouse IgG2a。各管渦旋震蕩后室溫下避光孵育15 min，加入適量PBS，500×g室溫水平離心5 min，棄上清液，加入PBS 100 μl上機(jī)測(cè)定。

（五）MSCs誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

臍帶MSCs貼壁培養(yǎng)至第3代，融合70﹪，去除培養(yǎng)基，分別添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，間隔3 ～ 4 d換液，培養(yǎng)21 d固定后分別行堿性磷酸酶染色、油紅O染色和阿爾新藍(lán)染色。

（六）集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

采用MethoCuhTmGF（H4434）培養(yǎng)體系，六孔板中加入培養(yǎng)基1 ml/孔，CD34+細(xì)胞接種密度為1 000個(gè)/孔，置于37 ℃ 5﹪ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，計(jì)數(shù)各系集落數(shù)目。

（七）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

采用BDAnnexin V PE Apoptosis kit 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，分別取各組培養(yǎng)后細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌離心后采用緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，取100 μl細(xì)胞液至5 ml離心管中，加入5 μl PE膜聯(lián)蛋白以及5 μl 7-ADD，室溫避光反應(yīng)15 min，加入400 μl緩沖液后行流式測(cè)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，擴(kuò)增后細(xì)胞數(shù)量及流式測(cè)量細(xì)胞百分比均以±s表示，組間細(xì)胞擴(kuò)增后數(shù)量、細(xì)胞流式表型比例以及各系集落培養(yǎng)結(jié)果比較采用方差分析，兩組之間上述數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MSCs表型測(cè)定

MSCs置于37 ℃ 5﹪CO2培養(yǎng)箱體外培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天可見成克隆增長(zhǎng)的梭形貼壁細(xì)胞，傳代后1周細(xì)胞融合可達(dá)90﹪（圖1），取第3代細(xì)胞胰酶消化后流式測(cè)定CD105，HLA-DR，CD73，CD90，CD14，CD34，CD19，CD45及 SSEA-4等細(xì)胞表型（圖2）。結(jié)果可見未分化MSCs高表達(dá)CD105，CD73，CD90，表達(dá)率均高于99﹪，不表達(dá)CD14，CD34，CD19，CD45，HLA-DR，表達(dá)效率均低于1﹪，MSCs標(biāo)志物SSEA-4表達(dá)率在（0.98±0.51）﹪。MSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化可形成成骨細(xì)胞（圖3a），脂肪細(xì)胞（圖3b），和軟骨細(xì)胞（圖3c），證明其具多譜系分化潛能。

二、磁珠分選效果

CD34+細(xì)胞的純度和活力分別采用流式細(xì)胞儀和臺(tái)盼藍(lán)染色分析，經(jīng)檢驗(yàn)分離得到細(xì)胞的純度和存活率分別為（96.46±2.92）﹪和（92.63±3.56）﹪。

三、擴(kuò)增效果比較

對(duì)照組CD34+細(xì)胞10 d培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增3.7倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增3.5倍；UM171組經(jīng)10 d培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增14倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增13.5倍（圖1）；MSCs共培養(yǎng)組細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增11倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增10倍；聯(lián)合培養(yǎng)組細(xì)胞總數(shù)在第10天擴(kuò)增達(dá)22倍，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增21倍，擴(kuò)增后3組細(xì)胞總數(shù)及CD34+及CD133+差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.01）。各組細(xì)胞培養(yǎng)情況見圖4，各組培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)、CD34+及CD133+細(xì)胞數(shù)（表1）。

四、流式檢測(cè)結(jié)果

各組培養(yǎng)10 d后收獲細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果顯示UM171聯(lián)合MSCs組得到CD34+CD38-細(xì)胞比例為（91.49±2.67）﹪，較MSCs及UM171組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01），含UM171培養(yǎng)體系CD133細(xì)胞比例較單獨(dú)MSCs培養(yǎng)組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。各組細(xì)胞培養(yǎng)后流式檢測(cè)情況見表2。

（一）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

圖1 倒置顯微鏡下觀察 MSCs及CD34+細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)

圖2 流式細(xì)胞儀對(duì)MSCs表面抗原檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡比例約為1.5﹪晚期凋亡比例為1﹪，死亡細(xì)胞約3﹪；其余3組細(xì)胞早期凋亡比例約為1﹪，晚期凋亡比例約為1﹪，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

（二）集落培養(yǎng)效果

分別對(duì)未擴(kuò)增臍血及3組擴(kuò)增后CD34+行集落培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天可見集落形成，擴(kuò)增后細(xì)胞經(jīng)甲基纖維素培養(yǎng)14 d后集落形成良好（圖7），各組集落計(jì)數(shù)見表3。數(shù)據(jù)分析顯示，MSCs擴(kuò)增組集落形成能力較其他各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在紅系及粒系形成能力方面差異較為明顯，擴(kuò)增體系中包含UM171的兩組與臍血對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 培養(yǎng)后各組細(xì)胞總數(shù)、CD34+及CD133+細(xì)胞數(shù)比較（×105，±s）

表1 培養(yǎng)后各組細(xì)胞總數(shù)、CD34+及CD133+細(xì)胞數(shù)比較（×105，±s）

分組 例數(shù) 細(xì)胞總數(shù) CD34+ CD133+（×105）對(duì)照組 6 3.76±0.43 3.57±0.36 0.28±0.07 UM171組 6 14.33±0.68 13.50±0.92 5.47±1.03 MSCs組 6 11.69±1.52 10.27±1.28 2.73±0.42 UM171及MSC共培養(yǎng)組 6 21.91±1.39 21.17±1.43 8.38±3.11 F值 274.38 272.43 26.82 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表2 培養(yǎng)后各組細(xì)胞流式表型比較（﹪，±s）

表2 培養(yǎng)后各組細(xì)胞流式表型比較（﹪，±s）

分組 例數(shù) CD34+CD38- CD34+CD38+ CD34-CD38+ CD34-CD38- CD133+對(duì)照組 6 72.44±12.47 22.70±1.88 2.88±0.39 1.91±0.37 7.61± 1.62 UM171組 6 87.67± 1.48 6.44±3.23 0.99±0.58 4.84±2.57 38.40± 8.24 MSCs組 6 78.11± 2.35 9.83±1.43 2.88±0.73 2.44±0.79 23.46± 3.29 UM171及MSC共培養(yǎng)組 6 91.49± 2.68 5.12±1.66 0.95±0.42 5.52±3.28 38.55±15.07 F值 86.87 82.48 24.35 35.13 16.90 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察MSCs分化誘導(dǎo)成像（×200）

圖4 各組培養(yǎng)過程不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總數(shù)變化情況

討 論

臍血來源HSPCs體外擴(kuò)增體系較多，從最初的添加細(xì)胞因子向多種手段聯(lián)合應(yīng)用發(fā)展，以期獲得更好的擴(kuò)增效果，但長(zhǎng)期體外培養(yǎng)對(duì)HSPCs干性損傷較大，研究表明體外培養(yǎng)時(shí)間控制在2周以內(nèi)可以更好地保留擴(kuò)增后細(xì)胞干細(xì)胞特性。造血微環(huán)境是能夠支持造血干細(xì)胞定居、自我更新以及繁殖分化的特殊生理環(huán)境，造血組織中的非造血細(xì)胞對(duì)造血增值分化發(fā)揮著特殊作用，目前的擴(kuò)增體系也大都基于模擬造血微環(huán)境對(duì)HSPCs行體外擴(kuò)增。體外培養(yǎng)過程中造血微環(huán)境對(duì)干性保持起著重要作用，MSCs作為造血微環(huán)境的重要組份，其作為飼養(yǎng)層與CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)，可通過分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和黏附分子細(xì)胞支持HSPCs的生長(zhǎng)和增殖，提高其生存率和自我更新能力[10]。既往研究表明MSCs經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞因子分泌能力有所下降[11]。實(shí)驗(yàn)中采用與臍血同源的第3代MSCs，其流式表型及誘導(dǎo)分化能力較為穩(wěn)定。

圖5 各組細(xì)胞培養(yǎng)后流式檢測(cè)情況

表3 擴(kuò)增前后各組細(xì)胞集落培養(yǎng)結(jié)果比較（±s）

表3 擴(kuò)增前后各組細(xì)胞集落培養(yǎng)結(jié)果比較（±s）

分組 例數(shù) CFU-E CFU-GM CFU-GEMM未擴(kuò)增臍血組 6 28.33±4.32 84.17± 9.87 10.33±3.72 UM171組 6 35.17±7.99 73.83±16.58 13.00±2.83 MSCs組 6 19.17±3.60 51.00± 9.69 7.00±2.35 UM171及MSC共培養(yǎng)組 6 35.33±6.38 82.50± 7.87 13.50±3.83 F值 10.25 10.59 4.36 P值 ＜ 0.01 0.02 ＜ 0.01

圖6 細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)

添加細(xì)胞因子作為HSPCs體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)方法，其在調(diào)節(jié)HSPCs增殖、分化、生存中發(fā)揮重要作用[12]，應(yīng)用于HSPCs擴(kuò)增的細(xì)胞因子及其組合方式很多，但一般均包含以下3個(gè)細(xì)胞因子：SCF、TPO以及FLT3，該組合可有效提高細(xì)胞存活率、細(xì)胞端粒長(zhǎng)度、黏附因子表達(dá)及干細(xì)胞擴(kuò)增[13-14]。

在造血干細(xì)胞龕中通過高通量篩選出小分子化學(xué)物質(zhì)在HSPCs擴(kuò)增應(yīng)用越來越廣泛，其特點(diǎn)就是在提高擴(kuò)增效率的同時(shí)可以較好的保持細(xì)胞干性。UM729是存在于造血干細(xì)胞龕中的小分子化合物，它能夠增加人的CD34+CD45RA-外周血細(xì)胞比例。UM171是UM729的類似合成物，研究表明其擴(kuò)增能力是UM729的10 ～ 20倍，經(jīng)UM171擴(kuò)增后CD34+細(xì)胞在獼猴體內(nèi)植入效率可以提高約3倍。UM171對(duì)有絲分裂和表型上原始種群的分裂速度沒有影響。此外，UM171與StemRegenin（SR1）協(xié)作可以增加短期性祖細(xì)胞的擴(kuò)張。而UM171自身可以顯著擴(kuò)大長(zhǎng)期正常的造血干細(xì)胞[8]。本實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)添加UM171的培養(yǎng)體系在HSPCs擴(kuò)增中可有效提高CD34+CD38-及CD133細(xì)胞比例。

試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞因子聯(lián)合MSCs或UM171均可對(duì)HSPCs進(jìn)行有效擴(kuò)增，二者聯(lián)合應(yīng)用在提高擴(kuò)增效率同時(shí)可以更有效對(duì)CD34+CD38-進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增效率可達(dá)20倍，凋亡實(shí)驗(yàn)顯示MSCs聯(lián)合UM171在增加擴(kuò)增效率同時(shí)并未增加細(xì)胞凋亡比例，集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明該方法擴(kuò)增后細(xì)胞較MSCs擴(kuò)增組的紅系及粒系形成能力存在優(yōu)勢(shì)。

造血干細(xì)胞移植前，患者通常接受清髓的放射治療，移植的造血干細(xì)胞寄宿在照射的基質(zhì)并增殖分化，最終重建造血系統(tǒng)。照射的基質(zhì)可能刺激造血干細(xì)胞，Celebi等[15]研究認(rèn)為照射的MSCs能夠更好的模擬造血干細(xì)胞龕從而支持HSPCs擴(kuò)增。Walenda也驗(yàn)證了照射后MSCs擴(kuò)增的HSPCs中CD34+CD38-比例較未照射提高[16]。本實(shí)驗(yàn)同樣選擇照射處理的MSCs對(duì)HSPCs進(jìn)行擴(kuò)增，取得較好效果。

HSPCs擴(kuò)增數(shù)量與其干性保持的矛盾是目前需探討的一個(gè)重要問題，未分化的HSCs是體外擴(kuò)增的追求目標(biāo)，目前技術(shù)層面下擴(kuò)增的更多是祖細(xì)胞而非干細(xì)胞，多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，擴(kuò)增后的HSPCs長(zhǎng)期造血功能并未得到明顯改善，但高劑量的HSPCs輸注后可以顯著縮短UCBT患者全血細(xì)胞減少期，減少機(jī)會(huì)感染及移植相關(guān)疾病發(fā)病率和死亡率，因此HSPCs體外擴(kuò)增仍具有較好的科研前景。

綜上所述，本研究建立了全新的基于模擬造血微環(huán)境的HSPC體外培養(yǎng)體系，該體系可實(shí)現(xiàn)HSPCs數(shù)量擴(kuò)增一個(gè)數(shù)量級(jí)，培養(yǎng)后CD34+CD38-細(xì)胞比率較高，體外實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了其具有長(zhǎng)期造血重建功能，后續(xù)將在動(dòng)物模型上進(jìn)一步評(píng)估其移植后造血重建能力。

圖7 倒置顯微鏡下觀察各譜系集落形成（×200）

1 Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, et al.Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling[J].N Engl J Med, 1989, 321(17)：1174-1178.

2 Broxmeyer HE.Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation[J].Transfus Apher Sci, 2016,54(3)：364-372.

3 金婷, 王利, 王紅祥.非血緣臍血移植治療成人急性白血病的研究進(jìn)展[J].中華器官移植雜志, 2015, 36(2)：120-123.

4 Ballen KK, Gluckman E, Broxmeyer HE.Umbilical cord blood transplantation： the first 25 years and beyond[J].Blood, 2013, 122(4)：491-498.

5 Oran B, Shpall E.Umbilical cord blood transplantation： a maturing technology[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2012, 2012：215-222.

6 李猛, 盛宏霞, 張斌, 等.臍血來源造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[J].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版), 2016, 6(2)：127-133.

7 Bari S, Seah KK, Poon Z, et al.Expansion and homing of umbilical cord blood hematopoietic stem and progenitor cells for clinical transplantation[J].Biol Blood Marrow Transplant, 2015, 21(6)：1008-1019.

8 De Lima M, Mcniece I, Robinson SN, et al.Cord-blood engraftment with ex vivo mesenchymal-cell coculture[J].N Engl J Med, 2012, 367(24)：2305-2315.

9 Fares I, Chagraoui J, Gareau Y, et al.Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal[J].Science, 2014, 345(623)：1509-1512.

10 Gammaitoni L, Weisel KC, Gunetti M, et al.Elevated telomerase activity and minimal telomere loss in cord blood long-term cultures with extensive stem cell replication[J].Blood, 2004, 103(12)：4440-4448.

11 劉婷.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增研究及其分泌細(xì)胞因子的高通量篩查[D].北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2012.

12 Chu PP, Bari S, Fan XB, et al.Intercellular cytosolic transfer correlates with mesenchymal stromal cell rescue of umbilical cord blood cellviab ility during ex vivo expansion[J].Cytotherapy, 2012, 14(9)：1064-1079.13 Chou S, Chu P, Hwang W, et al.Expansion of human cord blood hematopoietic stem cells for transplantation[J].Cell Stem Cell, 2010, 7(4)：427-428.

14 Gullo F, Van Der Garde M, Russo G, et al.Computational modeling of the expansion of human cord blood CD133+hematopoieticstem/progen itorcells with different cytokine combinations[J].Bioinformatics, 2015, 31(15)：2514-2522.

15 Celebi B, Mantovani D, Pineault N.Irradiated mesenchymal stem cells improve the ex vivo expansion of hematopoietic progenitors by partly mimicking the bone marrow endosteal environment[J].J Immunol Methods, 2011, 370(1/2)：93-103.

16 Walenda T, Bork S, Horn P, et al.Co-culturewithmesenchymal stromal cells increases proliferation and maintenance ofhaematopoietic progenitor cells[J].J Cell Mol, 2010, 14(1-2)：337-350.

Effect of umbilical cord mesenchymal stem cells in combination with UM171 on amplificationof cord blood CD34+ cells

Li meng1, Sheng Hongxia1, Liu Yang2, Liao Li1, Tian Chong1, Sun Peng1, Zhang Bin1, Chen Hu1.1Department of Hematopoietic Stem Cell Transplantation,2Gynaecology and Obstetrics, Affiliated Hospital of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

Corresponding author: Chen Hu, Email:chenhu217@aliyun.com

Objective To investigate the effect of umbilical cord mesenchymal stem cells（MSCs）in combination with UM171 on amplification of cord blood CD34+cells.Methods The cord blood CD34+cells and umbilical cord MSCs were divided into four groups： Group A（control group）, Group B（UM171 culture group）, Group C（MSCs co-culture group）and Group D（UM171 and MSCs co-culture group）.The cell number, phenotype and colony formation ability were compared among different groups after amplification in vitro for 10 days.Results The umbilical cord MSCs expressed CD105, CD73 and CD90, while didn't express CD14, CD34, CD19, CD45 and HLA-DR.After induction, the cells could differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes.After the CD34+cells were cultured in vitro for 10 days, the total nuclear cells in the UM171 culture group were amplified by 14 times, and CD34+cells by 13.5 times; the total nuclear cells in the MSCs co-culture group were amplified by 11 times, and CD34+cells by 10 times; the total nuclear cells in the UM171 and MSCs co-culture group were amplified by 22 times, and CD34+cells by 21 times.The ratio of CD34+CD38-cell in the UM171 and MSCs co-culture group was（91.49±2.67）﹪.There was significant difference compared with the UM171 culture group（91.49±2.68）﹪and the MSCs co-culture group（78.11±2.35）﹪.After amplification, the cells were cultured for 14 days,and colony formation were observed in all groups.Besides, cells in the UM171 group formed more erythroid cells and granulocytes than cells in the MSC co-culture group.Conclusion As feeder cells, umbilical cord MSCs can improve in vitro amplification of CD34+cells.UM171 can favorably maintain stemness of the cells in the amplification process.The optimal amplification can be achieved by combining umbilical cord MSCs and UM171.

Mesenchymal Stem Cells; CD34+; Hematopoietic stem cells; Fetal blood

2016-11-17）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.006

100071 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院造血干細(xì)胞移植科1，婦產(chǎn)科2

陳虎，Email：chenhu217@aliyun.com

李猛，盛宏霞，劉陽，等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合UM171對(duì)臍血源CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增效果研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（2）：93-100.