食品安全性指標(biāo)與菌落總數(shù)的測定

翟碩莉

摘 要： 菌落總數(shù)的測定是食品衛(wèi)生檢驗的一個重要指標(biāo)，本文綜述了菌落總數(shù)測定常用的方法：國標(biāo)法、阻抗法、ATP生物發(fā)光技術(shù)、濾膜法、流式細胞技術(shù)等，簡要展望了該領(lǐng)域未來的發(fā)展。

關(guān)鍵詞： 菌落總數(shù) 檢測技術(shù) 食品

菌落指的是生長在固體培養(yǎng)基上，通常由一個細胞生長繁殖而成的肉眼可見的微生物細胞群體。菌落總數(shù)作為食品安全的重要衛(wèi)生指標(biāo)，反映食品被污染的程度。食品生產(chǎn)、運輸、消費過程中的微生物污染造成的食源性疾病是世界安全中最突出的問題。GB/T4789.2中規(guī)定的菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理后，在一定條件下培養(yǎng)（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質(zhì)等），所得1 mL（或1g）檢樣中形成的菌落總數(shù)。該規(guī)定中的“一定時間”通常指48h～72h培養(yǎng)基中長出的菌落，這一時間段只有細菌能夠長成菌落，菌落總數(shù)即活的細菌數(shù)，且不包括嗜冷菌、嗜熱菌、厭氧菌等特殊環(huán)境條件下生長的菌。目前，檢驗機構(gòu)對食品中菌落總數(shù)的測定通常選擇國標(biāo)法，但因國標(biāo)法的檢測周期較長，影響產(chǎn)品的新鮮度和貨架期，快速檢測技術(shù)應(yīng)運而生且發(fā)展迅速。

1.國標(biāo)法

GB/T4789.2規(guī)定菌落總數(shù)的測定方法有兩種：平板菌落計數(shù)法和菌落總數(shù)PetrifilmTM測試片法。平板菌落計數(shù)法包括采樣、稀釋、培養(yǎng)、計數(shù)等步驟，過程繁雜，需要一定的專業(yè)操作技能。平皿長出的菌落有的比較小，有的顏色與培養(yǎng)基相近或相同，在計數(shù)過程中不容易區(qū)別，因此在實際工作中常常將TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）加入到培養(yǎng)基中。TTC是脂溶性的光敏感復(fù)合物，能被活細胞還原為紅色，使培養(yǎng)基中的菌落呈紅色，便于計數(shù)。

菌落總數(shù)PetrifilmTM測試片法是將菌液滴至含培養(yǎng)基和指示劑的紙片上進行培養(yǎng)，紙片由滅菌濾紙、纖維膜、膠膜等作為載體，省略了培養(yǎng)基配制、消毒滅菌等過程。近年來的研究報道稱美國3M公司生產(chǎn)的PetrifilmTM效果好。

2.阻抗法

阻抗法是利用菌體代謝過程中能將培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)、脂類、糖類等電惰性物質(zhì)分解為小分子的胺類、有機酸、無機鹽等有電活性的物質(zhì)，在溶液兩端通以小振幅交流電，通過測定一定時間內(nèi)阻抗參數(shù)值的變化，快速、定量分析樣品中的微生物變化情況，阻抗值與微生物污染程度存在相關(guān)關(guān)系，樣品中微生物污染程度高，則阻抗參數(shù)變化較大，建立阻抗值與菌落總數(shù)之間的標(biāo)準曲線，通過測定食品的阻抗值，計算出食品中含有的菌落總數(shù)。阻抗法比傳統(tǒng)的平板計數(shù)法更快速，能夠動態(tài)地對菌落總數(shù)進行實時監(jiān)控，操作簡單，靈敏度高。其缺點是投資高，對好鹽微生物難以檢測。

3.ATP生物發(fā)光技術(shù)

ATP生物發(fā)光測定法是一種快速檢測菌落總數(shù)的方法，是基于螢火蟲發(fā)光機理設(shè)計的?；罹泻蠥TP且其含量固定，菌體死亡后，ATP將很快被菌體中的酶分解，研究表明，ATP生物發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強度與ATP含量呈正比，ATP生物發(fā)光法是通過提取菌體的ATP，測定ATP濃度，從而推算出樣品中的活菌數(shù)。反應(yīng)機理：以熒光素、ATP、氧氣為底物，在蟲熒光素酶的催化下，熒光素分子被激活，其電子躍遷到不穩(wěn)定的高能態(tài)，當(dāng)電子回到低能態(tài)時發(fā)出熒光光子，熒光素不斷被激活，連續(xù)產(chǎn)生熒光。ATP生物發(fā)光法的優(yōu)點是快速、簡便、靈敏度高，其檢測過程僅需要數(shù)分鐘，其缺點是不能區(qū)分非菌體ATP，會干擾結(jié)果。另外，ATP的提取方法也會造成干擾和抑制發(fā)光作用。

4.濾膜法

濾膜法又稱膜過濾法，原理：待檢檢樣通過已滅菌的濾膜，經(jīng)過抽濾，菌體被留在濾膜上，然后將膜貼于選擇性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，根據(jù)長出的菌落數(shù)即可推算出檢樣中的微生物數(shù)量。此方法投資小，但僅適用于液體或氣體，且含微生物數(shù)量較小的樣品，不適用于含有直徑大于濾膜孔徑的顆粒狀樣品。濾膜法通常用于飲料或水中菌落總數(shù)的測定，若用于固體或直徑大于濾膜孔徑的顆粒狀樣品，則需用無菌水浸提樣品，取上清液通過濾膜過濾。

5.流式細胞技術(shù)

流式細胞技術(shù)以流式細胞儀為工具，其檢測原理是樣品經(jīng)試劑處理時，只對樣品中存在的活菌進行熒光標(biāo)記。這些試劑基于一種非熒光底物，這種底物在酶的作用下可與活細胞結(jié)合，生成熒光標(biāo)記細胞，并進行富集。標(biāo)記后的微生物細胞被注射進ALS儀器內(nèi)的一條石英流式細胞柱，形成一條狹窄的分析流，確保微生物單個接連通過激光激發(fā)柱，激活激發(fā)熒光標(biāo)記細胞發(fā)出熒光，每個細胞形成的熒光信號由靈敏的檢測器收集并由數(shù)字處理器分析，得出樣品中的菌數(shù)。對食品中的活菌數(shù)直接進行檢測，速度快，無需增菌，可在90～100 min內(nèi)出具檢測結(jié)果，靈敏度高。

食品衛(wèi)生與人類健康關(guān)系密切，菌落總數(shù)的檢測是食品衛(wèi)生程度的重要指標(biāo)。隨著微生物檢測技術(shù)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，產(chǎn)生了很多關(guān)于菌落總數(shù)測定的新方法、新技術(shù)、新儀器，國家標(biāo)準測定方法目前仍是菌落總數(shù)測定的主要方法。除上述列舉的方法外，還有定量PCR法、顯微圖像識別技術(shù)、放射測量法、固相細胞計數(shù)法等，各種方法都有優(yōu)勢，但在研究過程中也暴露出一些不足，是科研人員努力的方向。