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    兩種不同緩沖系統(tǒng)的多聚甲醛對(duì)鼠腦組化結(jié)果的影響

    2014-03-05 08:05:58杜志榮彭小忠
    關(guān)鍵詞:原位雜交緩沖液探針

    杜志榮,張 琳,陰 彬,彭小忠

    (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100005)

    哺乳動(dòng)物大腦皮質(zhì)的發(fā)育長(zhǎng)期以來(lái)都是發(fā)育生物學(xué)研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前用于研究大腦發(fā)育的組織化學(xué)技術(shù)主要有原位雜交技術(shù)和免疫熒光染色,而這些技術(shù)均需要前期的標(biāo)本制備,尤其是取材后的組織固定。組織固定的主要目的是盡可能保持組織內(nèi)待檢測(cè)物的原位性、完整性和免疫活性[1],所以組織固定的效果往往決定著組化實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的成敗。4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)因其優(yōu)良的理化性質(zhì)成為目前固定標(biāo)本組織的常用固定劑之一[2-3],而關(guān)于其配制方法,尤其是用于溶解它的溶劑的選擇目前還未有定論。本研究以此問(wèn)題為出發(fā)點(diǎn),比較不同溶劑的4%PFA對(duì)鼠腦組織的固定效果,探討最佳的組織固定方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料:1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)懷孕的CD1小鼠,雌性,取材時(shí)的孕期分別為 10.5 d(E10.5)、E11.5、E12.5、E16.5d(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處)。2)化學(xué)試劑:0.1 mol/L PB緩沖液(pH 7.4):81 mmol/L Na2HPO4,19 mmol/L NaH2PO4;0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4):NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,Na2HPO410 mmol/L,KH2PO42 mmol/L(上海生工公司);PFA(Sigma公司);Pax6抗體和Ctip2抗體(Abcam公司);地高辛抗體(Roche公司)。3)RNA探針:所需cDNA均從小鼠大腦中獲得,連接于pGEM-3zf載體,利用單酶切線性化質(zhì)粒,體外轉(zhuǎn)錄后再乙醇沉淀回收RNA探針。

    1.2 切片制備:1)標(biāo)本采集:CD1孕鼠斷頸處死,剖腹,將胚胎取出后放入預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液中,E12.5及更早的胚胎整胚固定,E16.5鼠胚取腦,浸入4%PFA(0.01 mol/L PBS或0.1 mol/L PB)固定過(guò)夜。第2天用25%蔗糖溶液(0.01 mol/L PBS或0.1 mol/L PB)脫水,24 h后包埋,于-80℃冰箱中冷凝備用。2)切片:以16 μm厚度切片。

    1.3 原位雜交:組織切片于4%PFA 20 min,PK緩沖液(2 μg/mL蛋白酶 K)常溫 10 min,再 DEPC-4%PFA 10 min,0.1 mol/L三乙醇胺(不含RNA酶)常溫?cái)嚢?0 min,常溫預(yù)雜交1 h,65℃雜交過(guò)夜(探針終濃度為0.5 ng/μL);65℃0.2×檸檬酸鈉緩沖液 洗20 min ×3次,地高辛抗體1∶5 000,4 ℃孵育過(guò)夜;利用四唑硝基藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(Roche)系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng),使用純水終止反應(yīng),放到100%甲醇中處理20 min,封片,拍照。

    1.4 免疫熒光染色:組織切片于1×PBS中浸泡5 min,封閉液室溫封閉20~30 min,一抗4℃過(guò)夜(一抗稀釋比例:Pax6 1∶200,Ctip2 1v500);1×PBS洗5 min×3次,二抗(1∶200)室溫孵育1.5~2 h,PBS洗5 min×3次,DAPI染色,室溫3~5 min,1×PBS洗3 min×1次,封片,用Olympus confocal共聚焦熒光顯微鏡P1000拍照記錄。

    2 結(jié)果

    2.1 原位雜交結(jié)果:可見4%PFA(0.1 mol/L PB)固定的組織不僅較4%PFA(0.01 mol/L PBS)的致密和形態(tài)完好,而且原位雜交背景也明顯降低,明顯提高了信噪比(圖1)。

    2.2 免疫熒光染色結(jié)果:如圖可見,轉(zhuǎn)錄因子PAX6蛋白抗體用0.01 mol/L PBS免疫熒光染色的結(jié)果更清楚、背景更低;而用0.1 mol/L PB則較模糊和高背景,CTIP2蛋白抗體用0.01 mol/L PBS的非常清晰,而0.1 mol/L PB的結(jié)果卻幾乎不能用于實(shí)驗(yàn)分析(圖2)。

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較兩種緩沖系統(tǒng)的PFA固定小鼠大腦組織后的原位雜交、免疫熒光染色的結(jié)果的差別,發(fā)現(xiàn)0.1 mol/L PB作為溶劑固定的組織更適合原位雜交,而0.01 mol/L PBS更適合于免疫熒光染色。但造成這一差異的具體機(jī)制,尚待進(jìn)一步研究。

    總之,為了得到較好的原位雜交和免疫熒光的結(jié)果,不僅需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和熟練的技術(shù),而且還要注意根據(jù)待固定的組織特性和具體的實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇不同緩沖系統(tǒng)的固定液。

    圖1 不同溶劑配制的4%PFA對(duì)小鼠胚腦ngn1基因原位雜交結(jié)果的影響Fig 1 Effects of different solvent mixture of paraformaldehyde on in situ hybridization results of ngn1 gene in mouse embryo brain(×60)

    圖2 不同溶劑配制的4%PFA對(duì)E16.5小鼠胚腦PAX6、CTIP2蛋白免疫熒光染色結(jié)果的影響Fig 2 Effects of different solvent mixture of paraformaldehyde on immunofluorescent staining results of pax6/ctip2 genes in mouse E16.5 brain(×100)

    [1]賁長(zhǎng)恩,李叔庚.組織化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:10-12.

    [2]雷種,成丹丹,王百忍,等.局灶性腦缺血再灌注后大鼠下丘腦pSTAT3陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞分布與局部微血管的關(guān)系[J].中華麻醉學(xué)雜志,2007,27:827 -830.

    [3]Wilcox JN.Fundamental principles of in situ hybridization[J].J Histochem Cytochem,1993,41:1725 -1733.

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