Roux-en-Y胃旁路術(shù)對2型糖尿病大鼠腎臟糖異生的影響

文 藝，馮 犁，張少華，陳振宇，閆洪濤，陳 濤，湯禮軍*

(1.第三軍醫(yī)大學(xué) 研究生管理大隊(duì)，重慶 400038；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院 全軍普通外科中心，四川 成都 610083)

研究論文

Roux-en-Y胃旁路術(shù)對2型糖尿病大鼠腎臟糖異生的影響

文 藝1，馮 犁2，張少華2，陳振宇2，閆洪濤2，陳 濤2，湯禮軍2*

(1.第三軍醫(yī)大學(xué) 研究生管理大隊(duì)，重慶 400038；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院 全軍普通外科中心，四川 成都 610083)

目的研究胃旁路術(shù)對2型糖尿病大鼠腎臟糖異生的影響，探討其可能的降糖機(jī)制。方法建立2 型糖尿病大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為：對照組，糖尿病模型組，假手術(shù)組和手術(shù)組。分別于術(shù)前及術(shù)后4周檢測各組大鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和游離脂肪酸(FAA)；術(shù)前及術(shù)后1、2和4周，檢測各組大鼠空腹胰島素，行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)，計(jì)算血糖濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)和胰島素敏感指數(shù)(ISI)。術(shù)后4周，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot雜交技術(shù)檢測腎臟組織中糖異生關(guān)鍵酶：葡萄糖6磷酸酶(G-6-P)和磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)的mRNA表達(dá)及蛋白含量。結(jié)果術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠較糖尿病模型和假手術(shù)組血脂相關(guān)指標(biāo)降低(Plt;0.05)，空腹血糖及OGTT 2 h血糖值明顯下降(Plt;0.05)，AUC明顯減小(Plt;0.05)，ISI明顯升高(Plt;0.05)，手術(shù)組G-6-P和PEPCKmRNA的表達(dá)及蛋白含量較糖尿病模型組和假手術(shù)組均有降低(Plt;0.05)。結(jié)論胃旁路術(shù)能顯著降低糖尿病大鼠血糖，改善異常的糖耐量，其降糖機(jī)制可能與腎臟糖異生關(guān)鍵酶表達(dá)降低，腎臟糖異生減弱有關(guān)。

胃旁路術(shù)；Roux-en-Y；糖尿??；腎臟；糖異生

糖尿病已成為威脅人類健康的主要慢性疾病之一，其中90%以上為2型糖尿病。目前以飲食控制和口服降糖藥物的治療方式對血糖的長期控制并不理想,胰島素的替代治療也只能解決暫時(shí)的問題。相較于傳統(tǒng)治療，以Roux-en-Y胃旁路術(shù)為代表的減重手術(shù)對2型糖尿病的治療取得意想不到效果，手術(shù)不僅能明顯的改善2型糖尿病患者的血糖、胰島素和糖化血紅蛋白，同時(shí)也可糾正糖耐量異常和胰島素抵抗[1]，近期報(bào)道[2]手術(shù)對2型糖尿病的治療效果明顯優(yōu)于單純的藥物治療。然而目前對其確切的降糖機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。本研究采用高脂高糖飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素建立大鼠2 型糖尿病模型，觀察胃旁路術(shù)對腎臟糖異生的影響，對胃旁路術(shù)的降糖作用及其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料

SPF級(jí)8周齡SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量170～190 g[簡陽達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào):SCXK(川)2004)]。高脂飼料由基礎(chǔ)鼠飼料(72%)、煉豬油(15%)、蔗糖(10%)和蛋黃(3%)按比例搭配制成高脂高糖飼料。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L、pH 7.4)，胰島素放免試劑盒(海博研生物科技有限公司)，Trizol(碧云天生物技術(shù)研究所)，反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒(TAKARA R0086A)，全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，山羊抗兔IgG (武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗PEPCK多克隆抗體(Santa Cruz sc-32879)和兔抗G-6-P多克隆抗體(Santa Cruz sc-25840)(圣克魯斯生物技術(shù)公司)

1.3 糖尿病動(dòng)物模型復(fù)制、分組及處理

將大鼠分為對照組(8只)和糖尿病模型動(dòng)物(32只),對照組動(dòng)物給予基礎(chǔ)飼料，建模動(dòng)物給予高脂飼料。喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，左下腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg[3]。模型穩(wěn)定1周后，將糖尿病大鼠30只隨機(jī)分為糖尿病模型組8只，假手術(shù)組8只和手術(shù)組14只。假手術(shù)組行胃竇十二指腸離斷原位吻合術(shù)，手術(shù)組行胃旁路術(shù)，大鼠術(shù)前禁食12 h，不限飲水，0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，無菌條件下，上腹部正中切口長3 cm切開進(jìn)腹，閉合胃遠(yuǎn)端，距Treitz韌帶10 cm切斷空腸，遠(yuǎn)端腸襻行胃空腸吻合，距胃腸吻合口遠(yuǎn)端10 cm行空腸側(cè)側(cè)吻合，完成吻合后用甲硝唑溶液5 mL沖洗腹腔后關(guān)腹，手術(shù)14只，存活4周8只，存活率57.1%。

1.4 檢測方法

1.4.1 大鼠血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和游離脂肪酸(FFA)測定：分別于術(shù)前及術(shù)后4周，采用全自動(dòng)生化分析儀測定各組大鼠總膽固醇和甘油三酯，ELISA法測定游離脂肪酸。

1.4.2 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)：術(shù)前及術(shù)后1、2和4周，禁食12 h后，50%葡萄糖灌胃1.5 g/kg，取大鼠尾尖血分別測定給葡萄糖后0、0.5、1和2 h的血糖值，用梯形法按式AUC=0.25×(0 h血糖濃度+4×0.5 h血糖濃度+3×2 h血糖濃度)計(jì)算血糖濃度-時(shí)間曲線下面積(area under the curve,AUC)。

1.4.3 大鼠血清Insulin測定：術(shù)前及術(shù)后1、2和4周，采用放射免疫法測定各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)空腹血清胰島素水平。

1.4.4 計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(Insulin sensitivity index，ISI)：ISI=1/(空腹血糖×空腹胰島素)，分析時(shí)取其自然對數(shù)值，即ISI=In(空腹血糖×空腹胰島素)-1

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P mRNA的表達(dá)水平：采用Trizol法提取腎臟皮質(zhì)總RNA，嚴(yán)格按照試劑操作說明書進(jìn)行。用Thermo NanoDrop2000分光光度儀檢測RNA 的含量和純度，取A260/A280在1.8～2.1 之間的RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。引物由上海生工合成，為相對定量檢測mRNA 表達(dá)量，用β-actin作為內(nèi)參(表1)。采用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR試劑盒配制25 μL體系， BIO-RAD C1000進(jìn)行目標(biāo)序列擴(kuò)增，用2-△△Ct法分析磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G-6-P)mRNA 的水平變化。

1.4.6 Western blot檢測腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P的蛋白表達(dá)：采用BCA法定量總蛋白，取40 μg總蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離蛋白, 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1 h，封閉后分別加入兔抗PEPCK多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗G-6-P多克隆抗體(1∶800)，4 ℃雜交過夜。洗膜后用辣根過氧化物酶酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫下二抗雜交1 h, 洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色, 暗室曝光成像，應(yīng)用UVP BioSpectrum 410 Imaging System分析密度并計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Tch、TG、FFA的檢測結(jié)果

術(shù)前與對照組相比，糖尿病模型組Tch、TG和FFA均有明顯升高(Plt;0.05)；術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠較糖尿病模型組和假手術(shù)組，Tch、TG和FFA均有降低(Plt;0.05)(表2)。

2.2 各組大鼠OGTT實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果

術(shù)前糖尿病模型組空腹血糖及OGTT 2 h血糖均顯著高于對照組(Plt; 0.05)；術(shù)后，手術(shù)組空腹血糖及OGTT 2 h血糖呈明顯下降趨勢，術(shù)后4周其血糖值顯著低于糖尿病對照和假手術(shù)組(Plt;0.05)(表3)。

2.3各組血糖濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)的檢測結(jié)果

術(shù)前糖尿病模型組AUC顯著高于對照組(Plt;0.05)；術(shù)后，手術(shù)組AUC較糖尿病模型組和假手術(shù)組顯著降低(Plt;0.05)(表4)。

2.4各組大鼠空腹胰島素和胰島素敏感指數(shù)的檢測結(jié)果

術(shù)前，糖尿病模型組胰島素敏感指數(shù)較對照組明顯降低(Plt;0.05)；術(shù)后1周，手術(shù)組較糖尿病模型組和假手術(shù)組胰島素敏感指數(shù)即明顯升高，空腹胰島素水平降低(Plt;0.05)，手術(shù)效果一直維持到術(shù)后4周(表5)。

表1 PCR引物序列及反應(yīng)條件Table 1 Sequences and conditions of primers in used in PCR

表2 各組大鼠血脂相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果Table 2 The results of blood-lipoid indexes in each group(±s, mmol/L,n=8)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

表3 各組大鼠血糖的檢測結(jié)果Table 3 The results of blood glucose in each group (±s, mmol/L,n=8)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

表4 各組大鼠AUC的檢測結(jié)果Table 4 The results of AUC in each group (±s, mmol/h·L,n=8)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

表5 各組大鼠空腹胰島素和胰島素敏感性的檢測結(jié)果Table 5 The results of insulin (mIU/L) and ISI in each group(±s,n=8)

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

2.5各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK、G-6-PmRNA相對表達(dá)的檢測結(jié)果

術(shù)后4周，糖尿病模型組及假手術(shù)組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK、G-6-PmRNA的表達(dá)明顯高于對照組大鼠(Plt;0.05)，分別升高了近6倍和4倍；手術(shù)組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK、G-6-PmRNA的表達(dá)較糖尿病模型組及假手術(shù)組均有降低，尤以G-6-P降低明顯(Plt;0.05)(表6)。

表6 各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P mRNA表達(dá)的比較

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

2.6各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK、G-6-P蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果

術(shù)后4周，糖尿病模型組及假手術(shù)組PEPCK和G-6-P的蛋白表達(dá)均明顯高于對照組大鼠(Plt;0.05)，手術(shù)組大鼠PEPCK和G-6-P的蛋白表達(dá)較糖尿病模型組和假手術(shù)組均有降低(Plt;0.05)(表7，圖1)。

表7 各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P蛋白表達(dá)的比較

*Plt;0.05 compared with control group；#Plt;0.05 compared with DM group；△Plt;0.05 compared with SRYGB group.

圖1 各組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P蛋白表達(dá)的比較Fig 1 The expressions of PEPCK and G-6-P protein in each group(±s,n=8)

3 討論

Roux-en-Y胃旁路術(shù)是目前治療2型糖尿病的新手段和主要手術(shù)方法，其臨床治療有效率達(dá)80%以上[4]。長期隨訪調(diào)查顯示胃旁路術(shù)后患者血糖控制穩(wěn)定，胰島素抵抗改善明顯，患者血脂、血壓等也有一定程度改善，降低了糖尿病并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素及發(fā)病率，是一種有效的治療方式[5]。

2型糖尿病主要是以胰島素抵抗為主，使人體器官和組織對胰島素敏感性降低，致人體對糖的利用減少，內(nèi)源性糖生成增多。而內(nèi)源性糖的來源主要有兩條途徑：一是糖原的分解，二是糖異生。2型糖尿病患者上述兩條生糖途徑都有不同程度的增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致餐后和空腹的高血糖。近年研究發(fā)現(xiàn)，腎臟具有在各種生理和病理?xiàng)l件下產(chǎn)生和釋放糖的能力，腎臟對血糖穩(wěn)態(tài)的重要作用已經(jīng)得到公認(rèn)[6]。除了肝臟，腎臟皮質(zhì)也含有大量糖異生相關(guān)的酶，且腎臟是唯一能夠通過糖異生產(chǎn)生足夠多的糖并釋放進(jìn)入血液循環(huán)的器官[6]。研究顯示腎糖產(chǎn)量占人體內(nèi)源性糖產(chǎn)量近20%，約占糖異生途徑的40%[7]。而2型糖尿病患者內(nèi)源性糖的產(chǎn)量增加了近300%，肝糖和腎糖的釋放各占50%，糖尿病患者與非糖尿病患者相比，其腎糖的釋放增加了近3倍，然而肝糖的釋放只增加了30%[8]。此外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，糖尿病大鼠腎臟糖異生關(guān)鍵酶基因的表達(dá)、酶的活性都是增加的，且腎臟與肝臟G-6-P基因的表達(dá)和酶的活性增加幾乎相同[9]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，與對照組大鼠相比，模型組大鼠腎臟皮質(zhì)PEPCK和G-6-P的基因和蛋白表達(dá)均明顯升高，腎臟糖異生增強(qiáng)。

本研究建立的2型糖尿病大鼠模型，與對照組大鼠相比，該模型大鼠血脂偏高，血糖中度升高，胰島素敏感性指數(shù)降低，糖耐量嚴(yán)重受損，與2型糖尿病的病理生理特點(diǎn)基本一致。對糖尿病大鼠實(shí)施胃旁路術(shù)后1周，其空腹血糖即明顯降低，胰島素敏感性增加，受損的糖耐量得到改善，表明手術(shù)具有快速且顯著的降糖效果，這也與前期的研究結(jié)果一致[10]。術(shù)后4周，手術(shù)組大鼠血糖水平趨于穩(wěn)定，腎臟糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G-6-P的基因及蛋白表達(dá)較糖尿病大鼠均有一定程度降低，腎臟糖異生減弱。手術(shù)組大鼠腎臟糖異生的減弱可能跟其術(shù)后胰島素敏感性增加有關(guān)，有研究報(bào)道胰島素可以通過下調(diào)糖異生關(guān)鍵酶基因的表達(dá)而對糖異生起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[11]，抑制肝臟和腎臟內(nèi)源性糖的產(chǎn)生[12]，因此推測腎糖輸出的減少可能主要和胰島素的作用有關(guān)。其次，胃旁路術(shù)后諸多胃腸道激素及脂肪因子的分泌會(huì)發(fā)生改變[13]，是否有其他的因素在其中產(chǎn)生作用都仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上，Roux-en-Y胃旁路術(shù)能迅速降低糖尿病大鼠血糖，改善受損糖耐量，其機(jī)制可能跟術(shù)后降低腎臟糖異生關(guān)鍵酶的表達(dá)，抑制腎臟糖異生有關(guān)。

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Effect of Roux-en-Y gastric bypass surgeryon renal gluconeogenesis in type 2 diabetes mellitus rats

WEN Yi1, FENG Li2, ZHANG Shao-hua2, CHEN Zhen-yu2, YAN Hong-tao2, CHEN Tao2, TANG Li-jun2*

(1.Administration Office of Graduate Students，Third Military Medical University，Chongqing 400038;2.Center of General Surgery，General Hospital of Chengdu Military Command，Chengdu 610083，China)

ObjectiveTo investigate the effect of Roux-en-Y gastric bypass surgery on renal gluconeogenesis in type 2 diabetes mellitus rats, and explore its possible hypoglycemic mechanism.MethodsTo build diabetes mellitus animal models. Diabetic rats were divided into four groups randomly: control group, diabetes model group (DM group),sham Roux-en-Y gastric bypass group (SRYGB group), Roux-en-Y gastric bypass group (RYGB group). Plasma TG,TC and FFA were measured respectively before and 4th week after the operation in each group rats; the fasting insulin was measured and OGTT was taken before and 1st,2nd and 4th week after the operation, calculate the AUC of blood glucose concentration-time and ISI. The key enzymes of renal gluconeogenesis: G-6-P and PEPCK were detected using RT-PCR and Western blot respectively 4th week after the operation in each group rats.Results4 weeks after surgery,RYGB group rats were compared with DM and SRYGB group rats,Roux-en-Y gastric

bypass surgery can reduce the level of blood lipid (Plt;0.05) and decrease the fasting blood glucose of as well as 2 h after OGTT significantly (Plt;0.05), reduce the AUC (Plt;0.05), increase insulin sensitivity(Plt;0.05),decrease expression ofG-6-PandPEPCKmRNA and protein in some degree.ConclusionsRoux-en-Y gastric bypass surgery can reduce blood glucose in diabetic rats significantly and improve the glucose tolerance, its mechanism may be related to decrease of G-6-P and PEPCK mRNA and protein levels in renal tissue，weaken renal gluconeogenesis.

gastric bypass surgery；Roux-en-Y；diabetes mellitus；kidney；gluconeogenesis

2013-12-20

2014-03-12

全軍臨床高新技術(shù)重大項(xiàng)目(2010gxjs040)

*通信作者(correspondingauthor)：whjtlj1251@163.com

1001-6325(2014)05-0661-06

R 656.6；R 587.1

A