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    人重組蛋白胸腺素B10促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3凋亡

    2014-11-27 09:42:32曲連悅姜明燕
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系卵巢癌試劑盒

    曲連悅,蔡 爽,姜明燕

    (中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部,遼寧 沈陽 110001)

    人重組蛋白胸腺素B10促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3凋亡

    曲連悅,蔡 爽,姜明燕*

    (中國醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部,遼寧 沈陽 110001)

    β族胸腺素由于具有維持細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)平衡,促進(jìn)血管生成、傷口愈合、心肌修復(fù)等多種生物學(xué)功能,并與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系而倍受關(guān)注。本文研究對象胸腺素B10(thymosinβ 10,Tβ10) 定位于胞內(nèi),大量文獻(xiàn)證實(shí)Tβ10與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1-2],但在不同類型的腫瘤中它的功能還存在爭議,Tβ10在腫瘤細(xì)胞凋亡中所起的作用也鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中探索Tβ10對其凋亡的影響及其分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料:重組人Tβ10蛋白(Abcam公司);流式雙染試劑盒(BD公司);caspase-3活性檢測試劑盒(Haimen公司);Cell Counting Kit-8? solution(CCK-8)試劑盒(日本同仁公司);Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(KeyGEN公司);BAX、BCL-2 抗體(Santa Cruz公司);RNA提取及Realtime PCR(Takara公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞使用DMEM 培養(yǎng)基含10%滅活小牛血清。37 ℃,5% CO2的條件下培養(yǎng),每2天換1次液,并用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

    1.2.2 細(xì)胞活力檢測:使用CCK-8 檢測細(xì)胞的增殖能力。將處于對數(shù)增殖期的SKOV3細(xì)胞分成4組,其中1組為對照,加入等體積的PBS,另外3組分別加入0.5、1或2 g/L 3個(gè)濃度的Tβ10,24 h后按每孔4×103個(gè)/100 μL將各組分別接種于96孔培養(yǎng)板中,待其貼壁后每孔加入10 μL CCK-8 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。檢測在450 nm 波長下測定各孔吸光度值,以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對照。

    1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測:使用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),每孔3 mL大約4×105個(gè),實(shí)驗(yàn)組加入Tβ10 1 g/L,對照組加入PBS,24 h后收集細(xì)胞。流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)1萬個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞凋亡百分比用CellQuest analysis 軟件計(jì)算。

    1.2.4 Caspase-3活性檢測:使用caspase-3活性檢測試劑盒。實(shí)驗(yàn)組加入Tβ10 1 g/L,對照組加入等體積的PBS,24 h后兩組細(xì)胞在裂解液中裂解, 然后離心10 min,進(jìn)行蛋白定量。將每組蛋白取30 μg放入96孔板中與caspase-3顯色底物(2 mmol/L)混合,37 ℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度值。

    1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR:收集細(xì)胞提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后使用SYBR Green 法進(jìn)行定量real-time PCR擴(kuò)增,總體積20 μL。40個(gè)循環(huán)退火溫度60 ℃,30 s。

    β-actin作為內(nèi)參。引物序列見表1?;蛳鄬Ρ磉_(dá)水平計(jì)算方式如下ΔCt =Ct 待測基因-Ct 內(nèi)參基因, ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組,增加倍數(shù)用如2-ΔΔCt方法計(jì)算。每次實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)重復(fù)孔。

    表1 Real-time PCR中使用的引物序列Table 1 Primer sequences

    1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達(dá):收集細(xì)胞并加入裂解液充分裂解,4 ℃ 12 000r/min離心30 min,提取上清。使用總蛋白60 μg,SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)印到PVDF上;5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉2 h,分別與抗BCL-2,抗BAX(1∶300),抗β-actin(1∶500), 4 ℃孵育過夜。分別與對應(yīng)的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,ECL顯色,結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集,進(jìn)行灰度值測定。

    2 結(jié)果

    2.1 加入Tβ10后SK0V3細(xì)胞的活力變化:SKOV3細(xì)胞內(nèi)加入3個(gè)濃度的Tβ10后,24 h細(xì)胞活性明顯下降(表2)。

    表2 不同濃度Tβ10加入SKOV3后細(xì)胞活力的變化

    *Plt;0.05,**Plt;0.01compared with the 0 g/L concentration group.

    2.2 加入Tβ10后SK0V3細(xì)胞凋亡百分比的變化:加入1 g/L的Tβ10后,SK0V3的調(diào)亡百分比由5.23%上升至12.34%,Plt;0.01(圖1)。

    圖1 胸腺素β10對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響Fig 1 Effect of thymosin β10 on the apoptosis of SKOV3 cell

    2.3 加入Tβ10后SK0V3細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性的變化:加入1 g/L的Tβ10后,SK0V3中caspase-3的活性由100%增強(qiáng)至287%(Plt;0.01)。

    2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA的變化:與凋亡密切相關(guān)基因Bcl-2及BAX檢測結(jié)果顯示,加入1 g/L Tβ10后促進(jìn)凋亡的BAX的mRNA水平上升,而抑制凋亡的Bcl-2的mRNA表達(dá)下降(圖2)。

    *Plt;0.01 compared with control圖2 胸腺素β10對SKOV細(xì)胞中Bcl-2及Bax mRNA的影響Fig 2 Effect of thymosin β10 on the mRNA level of Bcl-2 and Bax in SKOV3 cell

    2.5 蛋白免疫印跡檢測SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因蛋白的變化:加入1 g/L Tβ10后的SKOV3細(xì)胞檢測Bcl-2、BAX這兩種蛋白的變化顯示,BAX蛋白表達(dá)灰度值由0.09±0.01上調(diào)到0.4±0.16,而Bcl-2表達(dá)灰度值由0.63±0.14下降到0.2±0.11(圖3)。

    圖3 胸腺素β10對SKOV3細(xì)胞中Bcl-2及Bax蛋白的影響Fig 3 Effect of thymosin β10 on the protein level of Bcl-2 and Bax in SKOV3 cell

    3 討論

    Tβ10目前在腫瘤中的作用存在很大爭議,一些研究證明它與Tβ4作用相似在腫瘤組織中高表達(dá)[3],同時(shí)能夠促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。但也有研究證明Tβ10在卵巢癌中表達(dá)降低[4]。Tβ10在不同腫瘤中所起的作用及其機(jī)制還有待于進(jìn)一步完善。在本研究中,卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中加入Tβ10后細(xì)胞的凋亡百分比升高, Bcl-2的水平顯著降低,而BAX的水平顯著增高, Bcl-2/BAX的比率的降低,使更多的細(xì)胞發(fā)生了凋亡。因此Tβ10可能通過降低Bcl-2/BAX的表達(dá)水平促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡。

    本研究證實(shí)在卵巢癌細(xì)胞系中,外源加入Tβ10能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這種促凋亡作用可能是通過降低Bcl-2/BAX的比率來實(shí)現(xiàn)的。該研究結(jié)果拓展了對Tβ10在腫瘤中作用機(jī)制的認(rèn)識(shí),為抗腫瘤藥物開發(fā)提供了新的方向。

    [1] Feher LZ, Pocsay G, Krenacs L,etal. Amplification of thymosin beta 10 and AKAP13 genes in metastatic and aggressive papillary thyroid carcinomas[J]. Pathol Oncol Res,2012, 18:449-458.

    [2] Li M, Zhang Y, Zhai Q,etal. Thymosin beta-10 is aberrantly expressed in pancreatic cancer and induces JNK activation[J]. Cancer Invest, 2009, 27:251-256.

    [3] Gu Y, Wang C, Wang Y,etal. Expression of thymosin beta10 and its role in non-small cell lung cancer[J]. Hum Pathol 2009, 40:117-124.

    [4] Kim YC, Kim BG, Lee JH. Thymosin beta10 expression driven by the human TERT promoter induces ovarian cancer-specific apoptosis through ROS production[J]. PLoS One, 2012, 7:e35399.

    2013-12-19

    2014-03-12

    *通信作者(correspondingauthor):qqllyy447743@163.com

    1001-6325(2014)05-0707-02

    R 737.3

    A

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