鬼臼毒素及4'－去甲基鬼臼毒素對黃曲條跳甲的拒食活性研究

趙 慧，徐 迪

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510642)

黃曲條跳甲Phyllotreta striolata Fabricius屬鞘翅目葉甲科［1］，主要危害十字花科蔬菜，尤其對油菜等經(jīng)濟作物有較嚴(yán)重的危害［2］.目前對黃曲條跳甲主要采用化學(xué)方法防治，且多以防治成蟲為主，葉面噴藥無法兼顧土中幼蟲、蛹和卵，藥劑持效期一過，成蟲不斷羽化出土為害，使得噴藥次數(shù)和藥量增加，害蟲產(chǎn)生抗性，加重農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染.

尋找高效、快速、方便、經(jīng)濟且活性高、毒性小的植物次生物質(zhì)，并通過化學(xué)結(jié)構(gòu)上的修飾或模擬等方法獲得的植物化合物是當(dāng)前的研究熱點［3-4］.利用植物的次生物質(zhì)來防治黃曲條跳甲是保護農(nóng)作物的途徑之一［5］.已有研究表明多種植物次生物質(zhì)對黃曲條跳甲成蟲具有選擇性和非選擇性拒食作用［6-10］.多項研究顯示鬼臼毒素及其衍生物對菜粉蝶Pieris rapae、粘蟲Mythimna separata等鱗翅類害蟲和鞘翅類昆蟲均有拒食、毒殺、抑制生長發(fā)育等作用［11-12］.對鬼臼毒素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得的衍生物能擴大殺蟲范圍和提高殺蟲活性［13］.筆者研究了鬼臼毒素及其衍生物4'-去甲基鬼臼毒素對黃曲條跳甲的拒食活性，鬼臼毒素具有抗腫瘤、抗病毒作用，其衍生物能降低藥物副作用［14］，因此將鬼臼毒素及其衍生物用于黃曲條跳甲防治，對人類健康和環(huán)境沒有危害，鬼臼毒素及其衍生物有望成為防治黃曲條跳甲的一種新型生物農(nóng)藥.

1 材料與方法

1.1 供試材料和儀器

窩兒七Rhizoma et Radix Diphylleiae Diphylleia sinensis Li購自廣州清平中藥市場;黃曲條跳甲成蟲采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地并無農(nóng)藥飼養(yǎng)2代;吐溫、石油醚(60-90)、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇、無水甲醇等溶劑(均為分析純)為天津化學(xué)試劑一廠生產(chǎn);柱層析硅膠(100～200目)、薄層層析硅膠(H與GF254)為青島海洋化工廠有限公司生產(chǎn);羧甲基纖維素鈉(CMC)為上?；瘜W(xué)試劑分廠生產(chǎn).Varian Unity INOVA500型核磁儀(美國Varian公司);VGAutospec-500質(zhì)譜儀(美國Beckman公司);FINNIGAN TRACE GC-MSTM，TR201818(美國 Thermo Finnigan公司).

1.2 窩兒七次生物質(zhì)的提取分離

取窩兒七干燥莖根粉末1 kg，加φ為95%的乙醇溶液浸沒生藥粉，加熱回流2 h，過濾，殘渣再加φ為95%乙醇溶液回流1 h，濃縮乙醇提取物至糖漿狀，放冷，傾入500 mL水中，黃棕色樹脂狀沉淀析出.濾集沉淀，得窩兒七樹脂.將樹脂研碎后用三氯甲烷450 mL分3次分散溶解，分成三氯甲烷溶解部分和不溶部分.

將三氯甲烷溶解部分蒸出三氯甲烷后，殘渣在苯和φ為95%乙醇的混合溶液(體積比1∶1)中重結(jié)晶，放置過夜，得鬼臼毒素.將不溶物采用硅膠反復(fù)柱層析，用石油醚/乙酸乙酯(體積比 100∶0、80∶20、50∶50)溶液洗脫得4'-去甲基鬼臼毒素.

1.3 鬼臼毒素類似物結(jié)構(gòu)鑒定

采用FINNIGAN TRACE GC-MSTM分析化合物結(jié)構(gòu)［10］.氣相色譜進(jìn)樣口溫度230℃，載氣為氦氣，流速5 mL·min-1，非極性柱 BP-5［30 m ×0.32 mm ×0.25 mm］，初始柱溫100℃保持5 min，以10℃·min-1程序升溫至200℃，保持5 min，以5℃·min-1線性升溫至 220 ℃，保持 3 min，分流比20∶1.TR201818 MSTM:電壓70 eV，質(zhì)核比 m/z35～335 amu，借助 Wiley＆Mainlib數(shù)據(jù)庫分析化合物結(jié)構(gòu).

1.4 窩兒七化合物不同濃度對黃曲條跳甲成蟲的

非選擇性和選擇性拒食作用的測定

將化合物鬼臼毒素、4'-去甲基鬼臼毒素用φ為50%丙酮溶液和φ為0.3%吐溫水溶液配制成500、1 000、2 000、3 000 和4 000 μg·mL-15 個質(zhì)量濃度.采集較嫩的甘藍(lán)無蟲孔葉片，選擇葉面平整，厚度接近的葉片，用打孔器(d=1.8 cm)制備成圓形葉片.用小毛筆蘸取適量溶液，每片葉片正反面均勻涂藥2次，晾干.對照葉片涂未加待測樣品的空白溶液.用培養(yǎng)皿和透明塑料硬紙制成高為10 cm的養(yǎng)蟲籠，下方培養(yǎng)皿中放置潮濕濾紙保濕.上方的培養(yǎng)皿用保鮮薄膜封好，防止蟲子跑出.

非選擇性拒食作用的測定:每個籠子放6片涂樣小葉，接10頭黃曲條跳甲成蟲，為1個處理，每處理3個重復(fù).24和48 h后分別用九宮方格圖版記錄成蟲取食面積.

選擇性拒食作用的測定:培養(yǎng)皿中濾紙用鉛筆畫1個“十”，將其平均分成4個區(qū)域，其中不相鄰的區(qū)域放涂有試樣的葉片4片，并作上標(biāo)記，另外2個區(qū)域放空白對照的葉片4片，接10頭黃曲條跳甲成蟲，為1個處理，每處理3個重復(fù).24和48 h后分別用九宮方格圖版記錄成蟲取食面積.

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.1.3分析數(shù)據(jù)，非選擇性拒食活性采用DMRT法進(jìn)行分析，選擇性拒食活性采用T檢驗法分析.對差異顯著者，按下列公式計算拒食率，差異不顯著者，不計算拒食率.

拒食率=(對照組取食面積-處理組取食面積)/對照組取食面積×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 鬼臼毒素及其類似物結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 鬼臼毒素及其類似物的分子式Fig.1 Molecular structural formula of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin

2.2 窩兒七化合物不同質(zhì)量濃度對黃曲條跳甲成蟲的非選擇性拒食作用

由表1可知，鬼臼毒素對照與處理差異顯著，具有非選擇性拒食活性，并隨著質(zhì)量濃度增加，拒食活性增加.在 24 h，濃度 500 μg·mL-1時，拒食率為43.49%，4 000μg·mL-1時，拒食率達(dá)93.79%，但濃度在1 000～4 000μg·mL-1范圍內(nèi)的拒食活性差異不顯著.除3 000～4 000μg·mL-1濃度下的拒食活性差異不顯著外，48 h各組間拒食活性差異顯著，其拒食活性均低于相同濃度條件下24 h的拒食活性，但下降不顯著.相同條件下，不同濃度4'-去甲基鬼臼毒素處理組與對照組就拒食活性均無顯著差異.

表1 鬼臼毒素和4'－去甲基鬼臼毒素對黃曲條跳甲的非選擇性拒食活性1)Tab.1 Nonselective antifeedant activities of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin against Phyllotreta striolata

2.3 窩兒七化合物不同質(zhì)量濃度對黃曲條跳甲成蟲的選擇性拒食作用

由表2可知，鬼臼毒素對照與處理差異顯著，具有選擇性拒食活性，隨著質(zhì)量濃度增加，拒食活性增加.在500μg·mL-1時，24 h拒食率為46.12%，4 000 μg·mL-1時，24 h拒食率達(dá)最大，為100%.相等質(zhì)量濃度下，48 h的拒食活性均比對應(yīng)的24 h的活性略低，但下降不顯著.4'-去甲基鬼臼毒素在1 000和4 000μg·mL-1濃度下24 h表現(xiàn)出拒食活性，4 000 μg·mL-1下48 h表現(xiàn)出拒食活性(53.03%)，其余拒食活性表現(xiàn)不顯著.

表2 鬼臼毒素，4'－去甲基鬼臼毒素對黃曲條跳甲的選擇性拒食活性1)Tab.2 Selective antifeedant activities of podophyllotoxin and 4'-demethylpodophyllotoxin against Phyllotreta striolata

3 結(jié)論

植食性昆蟲主要借助化學(xué)感受器來鑒別植物信號，而植物信號以植物次生物質(zhì)為主.從鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素對黃曲條跳甲的拒食研究可知，鬼臼毒素在24和48 h對黃曲條跳甲的選擇性拒食活性均高于非選擇性拒食活性，表明鬼臼毒素對黃曲條跳甲具有更好的選擇性拒食活性，且有一定的持效性.相比之下，4'-去甲基鬼臼毒素只在高濃度(4 000μg·mL-1)條件下，對黃曲條跳甲才表現(xiàn)出選擇性拒食活性.鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素分子結(jié)構(gòu)骨架相似，但拒食活性研究結(jié)果差異很大，可能與分子母核上所帶官能團不同有關(guān).鬼臼毒素比4'-去甲基鬼臼毒素多1個甲基，拒食活性也隨之增大，推測可能是羥基的氫鍵作用阻礙了4'-去甲基鬼臼毒素與相關(guān)受體的結(jié)合，從而降低了拒食活性.類似作用也表現(xiàn)在鬼臼毒素的其他衍生物上，如鬼臼毒素C-4位引入氨基二苯醚基團后，發(fā)現(xiàn)該衍生物的選擇性和殺蟲范圍增強，其殺蟲活性也得到一定程度的提高［15］.

［1］沈金發(fā).黃曲條跳甲的發(fā)生與綜合防治技術(shù)［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，2007(2):58-59.

［2］EKBOM B.Pests and their enemies in spring oilseed rape in Europe and challenges to integrated pest management［M］∥WIILIAMS IH.Biocontrol-based integrated management of oilseed rape pests.New York:Springer Netherlands，2010:151-165.

［3］MARTIN R M，GOPALAKRISHNAN S.Insecticidal activity of aerial parts of Synedrella nodiflora Gaertn(Compositae)on Spodoptera litura(Fab.)［J］.J Cent Eur Agric，2005，6(3):223-228.

［4］BARKAT D A.Insecticidal and antifeedant activities and chemical composition of Casimiroa edulis La Llave＆Lex(Rutaceae)leaf extract and its fractions against Spodoptea littoralis Larvae［J］.Aust J Basic App Sci，2011，5(9):693-703.

［5］KHAN Z R，MIDEGA C A O，BRUCE T JA，et al.Exploiting phytochemicals for developing a‘push-pull’crop protection strategy for cereal farmers in Africa［J］.J Exp Bot，2010，61(15):4185-4196.

［6］KOUL O.Phytochemicals and insect control:An antifeedant approach［J］.Crit Rev Plant Sci，2008，27(1):1-24.

［7］RAUSHER M D.Co-evolution and plant resistance to natural enemies［J］.Nature，2001，411(6839):857-864.

［8］郭成林，覃柳燕，陳海珊，等.楝科植物提取物對黃曲條跳甲成蟲拒食及毒殺活性研究［J］.廣西科學(xué)，2006，13(1):71-74.

［9］張興.砂地柏殺蟲作用研究概況［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2002，30(4):130-134.

［10］XU D，Huang Z，CEN Y J，et al.Antifeedant activities of secondarymetabolites from Ajuga nipponensis against adult of stripeflea beetles，Phyllotreta striolata［J］.JPest Sci，2009，82(2):195-202.

［11］谷文祥，何衍彪，何庭玉，等.苦檻藍(lán)提取物對小菜蛾的生物活性［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2004，15(7):1171-1173.

［12］侯軍，馬志卿，馮俊濤，等.鬼臼毒素對小菜蛾的生物活性及對其幾種代謝酶系的影響［J］.昆蟲學(xué)報，2007，50(9):895-899.

［13］XU Duming，YU Xiangyang，LIU Yingqian，et al.Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for podophyllotoxin［J］.Int Immunopharmacol，2005，5(11):1583-1592.

［14］NEGAR N，JATR K，SAHAAN R，etal.Podophylotoxin and their glycolsidic deriveatives［J］.Pharmacophore，2011，2(2):124-134.

［15］LIU Yingqian，YANG Liu，LIU Yangqing，et al.Synthesis and insecticidal activities of novel derivatives of podophyllotoxin［J］.Nat Prod Res，2007，21(11):967-974.

【責(zé)任編輯霍 歡】