Pim—1在人宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義

劉芳梅　張繼紅　閆婷婷

【摘要】 目的：研究Pim-1基因及其蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平，探討其與宮頸鱗癌臨床特性之間的關(guān)系。方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）半定量方法和免疫組化學(xué)法，檢測(cè)46例宮頸鱗癌組織和10例正常宮頸組織標(biāo)本中Pim-1基因及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：宮頸鱗癌組織中Pim-1基因與蛋白的表達(dá)水平明顯高于宮頸正常組織（P<0.05）；Pim-1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：原癌基因Pim-1及其蛋白在宮頸鱗癌組織中過度表達(dá)，可能與宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 宮頸鱗癌； 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)； 免疫組化； Pim-1基因

Pim-1基因最早在莫洛尼小鼠白血病病毒誘導(dǎo)的T-細(xì)胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)的[1]，其編碼的Pim-1蛋白激酶具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡等。已有大量的研究表明Pim-1在人類多種腫瘤組織中高表達(dá)。但關(guān)于Pim-1在宮頸癌組織中的表達(dá)情況研究報(bào)道甚少。本研究應(yīng)用RT-PCR方法和免疫組化學(xué)法分別檢測(cè)了Pim-1基因和其蛋白在宮頸鱗癌中的表達(dá)情況，初步探討了Pim-1基因與宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并且為以后深入研究提供了相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 所有標(biāo)本均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2009-2011年手術(shù)治療且術(shù)后經(jīng)病理科證實(shí)為宮頸鱗癌患者46例（惡性組）、多發(fā)性子宮平滑肌瘤患者10例（正常組），所選患者術(shù)前均未進(jìn)行放療和化療。取所有入選病例術(shù)中切除的新鮮宮頸組織標(biāo)本，均分作兩份，一份立即放入液氮中保存，用于做RT-PCR實(shí)驗(yàn)；另一份用福爾馬林溶液固定、石蠟包埋，用于做免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 RT-PCR所用試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物是由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成：Pim-1上游引物序列為5' CGATGGGACCCGAGTGTA 3'，下游引物序列為5' TGGAGGTGGATCTCAGCAGT 3'，擴(kuò)增片段為312 bp；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5' CTGGGACGACATGGAGAAAA 3'，下游引物序列為5' AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC 3'，擴(kuò)增片段為564 bp。SP試劑盒和DAB顯色劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人單克隆抗體Pim-1購于美國(guó)EPITOMICS公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RT-PCR 取約100 mg宮頸組織，按Trizol提取試劑盒說明提取各組織總的RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 ?L，按PCR試劑盒說明進(jìn)行。Pim-1引物擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取上述擴(kuò)增產(chǎn)物5 ?L與緩沖液混合后加入2%瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進(jìn)行電泳。EB染色，用紫外線投射儀觀察電泳條帶，拍照并記錄，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，得出Pim-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。以正常宮頸組織作為對(duì)照。

1.3.2 免疫組化 采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法檢測(cè)Pim-1蛋白的表達(dá)，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。染色結(jié)果判定：Pim-1在光鏡下進(jìn)行分析，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野共計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，在排除非特異性染色的前提下，胞漿/胞核出現(xiàn)淡黃色至黃棕色或棕褐色為陽性染色。計(jì)分方法：（1）染色程度：無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，黃棕或棕褐色計(jì)3分；（2）陽性細(xì)胞百分率≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，≥76%計(jì)4分。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)（A×B）≤1為陰性表達(dá)，>1為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料應(yīng)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織中Pim-1基因及蛋白的表達(dá) Pim-1基因在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平為（1.361±0.122），明顯高于正常宮頸組織的（0.023±0.002），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pim-1蛋白在宮頸鱗癌組織中陽性表達(dá)例數(shù)為35例（76.1%），高于正常宮頸組織的3例（30.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.026，P=0.014）。

2.2 宮頸鱗癌中Pim-1蛋白的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 Pim-1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。見表1。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多基因調(diào)控的長(zhǎng)期過程，隨著早期診斷技術(shù)不斷進(jìn)步如液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)及陰道鏡等[2-3]，很多宮頸癌前病變得到早期診斷和治療，從而降低了宮頸癌的發(fā)病率，治療上除了手術(shù)、放化療、藥物治療等，介入治療也在宮頸癌的治療中得到廣泛應(yīng)用[4-5]，治療方案更加合理化，死亡率也得到了明顯下降，然而宮頸癌治療后仍然存在著復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，甚至導(dǎo)致病死。故繼續(xù)探索宮頸癌的疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，積極尋找新的診斷、治療靶點(diǎn)具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)Pim-1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，例如He等[6]和張彤等[7]研究指出用QRT-PCR檢測(cè)Pim-1 mRNA，可為診斷前列腺癌提供一個(gè)可靠的標(biāo)準(zhǔn)，提示Pim-1在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能成為前列腺癌診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物；李曉晶等[8]研究表明Pim-1在肺癌組織中高表達(dá)，并且與腫瘤的直徑和TNM分期呈正相關(guān)，提示Pim-1與肺癌的發(fā)生和發(fā)展程度有關(guān)；Yi等[9]發(fā)現(xiàn)Pim-1在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，可能在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，隨著研究的深入，以Pim-1為腫瘤治療靶點(diǎn)的研究也日益引起了眾多學(xué)者的關(guān)注，例如Mumenthaler等[10]發(fā)現(xiàn)Pim激酶抑制劑與化療聯(lián)合可以改善前列腺癌在臨床治療中的耐藥情況；Shengjie等[11]研究發(fā)現(xiàn)沉默Pim-1可以明顯抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并且可以增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞在體外對(duì)化療藥物的敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Pim-1基因及其編碼的蛋白在宮頸鱗癌組織中表達(dá)水平均明顯高于正常宮頸組織，提示Pim-1與宮頸鱗癌的發(fā)生有關(guān)。在對(duì)Pim-1蛋白與宮頸鱗癌病例臨床特征進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)Pim-1蛋白表達(dá)水平與宮頸鱗癌分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示Pim-1可能在一定程度上可以反映宮頸鱗癌的進(jìn)展情況，為臨床預(yù)測(cè)宮頸鱗癌的預(yù)后提供一定的理論依據(jù)。但由于本實(shí)驗(yàn)病例及實(shí)驗(yàn)方法的局限性，Pim-1與宮頸癌的具體關(guān)系及機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究與探討。

綜上所述，Pim-1可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并且可能成為宮頸鱗癌診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，另外以Pim-1為靶點(diǎn)的治療方法有可能為臨床治療宮頸鱗癌開辟一條新的路徑。

參考文獻(xiàn)

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[11] Shengjie Guo，Xiaopeng Mao，Junxing Chen，et al.Overexpression of Pim-1 in bladder cancer[J].Jexp Clin Cancer Res，2010，24（29）：161-168.

（收稿日期：2013-12-12） （本文編輯：蔡元元）

綜上所述，Pim-1可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并且可能成為宮頸鱗癌診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，另外以Pim-1為靶點(diǎn)的治療方法有可能為臨床治療宮頸鱗癌開辟一條新的路徑。

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（收稿日期：2013-12-12） （本文編輯：蔡元元）

綜上所述，Pim-1可能參與了宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并且可能成為宮頸鱗癌診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，另外以Pim-1為靶點(diǎn)的治療方法有可能為臨床治療宮頸鱗癌開辟一條新的路徑。

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（收稿日期：2013-12-12） （本文編輯：蔡元元）