LC-ESI- MS／MS方法測定人血漿肌苷的應(yīng)用研究＊

王洪波，張夢亮，張蕓輝，楊 艷，張寶昌△

（1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長春130012；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春130012）

異丙肌苷原為一抗病毒藥，對人體皰疹、流感及鼻病毒感染均有療效，用于單純皰疹病毒感染的患者療效顯著。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)異丙肌苷具有增強機體免疫功能的作用，主要是增強細(xì)胞免疫功能，作為一新的免疫調(diào)節(jié)劑，在國外臨床上廣泛應(yīng)用［1-9］。異丙肌苷由肌苷與二甲胺基異丙醇-對乙酰胺基苯甲酸鹽（1∶3）3部分組成，易水解成為肌苷、二甲胺基異丙醇、對乙酰胺基苯甲酸，以往有關(guān)異丙肌苷的體內(nèi)藥代動力學(xué)報道甚少。本試驗建立了快速、靈敏的測定血漿中肌苷濃度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）分析方法，并對4名健康受試者口服1g異丙肌苷后肌苷的體內(nèi)藥代動力學(xué)過程進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和藥品 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，型號 API 4000，配有電噴霧離子源（加拿大Applied Biosystem公司）；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）；TGL-16G-A高速臺式冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

肌苷對照品（濃度為99.8%，上海微蒙生物科技有限公司提供，批號：140669-200702）；內(nèi)標(biāo)阿德福韋對照品（濃度99.0%，葛蘭素史克蘇州制藥公司提供，批號：9002）；色譜純級別甲醇由Sigma-Aldrich有限公司提供，其他試劑為分析純級別；人血漿由吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜／質(zhì)譜條件 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱，5 μm粒徑，150.0mm×4.6mm I.D.，美國 Agilent公司；流動相：甲醇∶10mmol／L 乙酸銨-水溶液（15∶85，v／v）；流速：1mL／min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL。質(zhì)譜條件 離子源：ESI離子源；噴射電壓：-4 000V；溫度：500℃；源內(nèi)氣體（N2）GS1、GS2和氣簾氣體壓力分別為：40psi、40psi和15psi；正離子方式檢測；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；肌苷的解簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）分別為-78V和-30eV；內(nèi)標(biāo)阿德福韋的DP和CE分別為-75 V和-50eV；用于定量分析的離子對分別為m／z母離子為267.3，子離子為135.0（肌苷）和 m／z母離子為272.0，子離子為134.1（內(nèi)標(biāo)阿德福韋）。

1.2.2 樣品采集和處理 全血取出后置肝素化試管中，立即4℃離心（15 000r／min×5min），取出血漿置另一試管（每毫升血漿加100μL 30%高氯酸溶液），充分振蕩混勻，低溫離心（15 000r／min×5min），取上清液，于80℃冷凍待測。室溫溶解，取100μL上清液，立即加入內(nèi)標(biāo)溶液100μL，充分振搖混勻后，取上清液5μL進(jìn)行LC-MS／MS分析。

1.2.3 溶液的配制 稱取25.0mg肌苷（分子式：C10H12N4O5）對照品，置于25mL容量瓶中，加甲醇-水定容至刻度，配制成1mg／mL的肌苷母液。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制：取肌苷儲備液適量，分別用室溫放置超過3d后的空白血漿稀釋至10、30、100、300、1 000、3 000 ng／mL。內(nèi)標(biāo)的配制：稱取25.0mg阿德福韋，置于25mL容量瓶中，加甲醇-水定容至刻度，配制成1mg／mL的母液，取適量用甲醇水（1∶1，v／v）稀釋至濃度為1μg／mL，即為內(nèi)標(biāo)溶液。

2 結(jié) 果

本試驗參照相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行了方法學(xué)確證［10］。

2.1 方法的專屬性 分別取6名健康受試者的空白血漿（室溫放置超過3d后的空白血漿）1 000μL，按血漿樣品處理方法操作，得到空白樣品色譜圖（圖1A）；將含有10ng／mL肌苷的血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)阿德福韋后，依同法操作，得到定量下限樣品的色譜圖（圖1B）；取受試者給藥后收集的血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1C。結(jié)果表明：室溫放置超過3d后的空白血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾肌苷和阿德福韋的測定。

圖1 測定人血漿中肌苷和內(nèi)標(biāo)阿德福韋的典型MRM色譜圖

表1 血漿中肌苷LC-MS／MS測定方法的準(zhǔn)確度與精密度（3個分析批，每分析批n＝6）

表2 血漿中肌苷的穩(wěn)定性（n＝3）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和定量下限 取用空白血漿（室溫放置超過3d后的空白血漿）配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（10、30、100、300、1 000、3 000ng／mL）1000μL，按血漿樣品處理方法操作，取5 μL進(jìn)行LC-MS／MS分析；以肌苷標(biāo)示濃度為橫坐標(biāo)，肌苷與內(nèi)標(biāo)物阿德福韋的色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)，以加權(quán)系數(shù)W＝1／χ2進(jìn)行線性回歸［11］，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。典型的回歸方程曲線為Y＝0.001 9 X-0.006 89（r＝0.995 4），其中Y為待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比，X為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，血漿中肌苷的線性范圍為10～3 000ng／mL，定量下限（9.8±0.4）ng／mL（n＝6）。

2.3 精密度、準(zhǔn)確度 取空白血漿（室溫放置超過3d的空白血漿）配制的低、中、高3個濃度（30、300、2 400ng／mL）的質(zhì)量控制（QC）樣品，按血漿樣品處理方法操作，每濃度6樣本，連續(xù)測定3d。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線，計算QC樣品測得濃度，根據(jù)QC樣品結(jié)果計算本法的準(zhǔn)確度與精密度，測定血漿中肌苷的準(zhǔn)確度與精密度。見表1。

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取一定量空白血漿（室溫放置超過3d的空白血漿），按血漿樣品處理方法（不加入內(nèi)標(biāo)）操作，獲得的空白血漿上清液，用此上清液配制低、中、高3個濃度的QC樣品和內(nèi)標(biāo)，每濃度4個樣本。將該樣本進(jìn)行LCMS／MS分析，獲得相應(yīng)峰面積，兩種處理方法得到的峰面積比值（百分比）即為提取回收率。血漿樣品中肌苷低、中、高3個濃度回收率分別為（96.7±3.45）%、（93.7±2.60）%、（93.2±2.58）%。用水配制的低、中、高3個濃度（30、300、2 400ng／mL）的質(zhì)量控制（QC）樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作，每濃度4個樣本；同時取一定量空白血漿（室溫放置超過3 d的空白血漿），按血漿樣品處理方法（不加入內(nèi)標(biāo)）操作，獲得的空白血漿上清液，用此上清液配制低、中、高3個濃度的QC樣品和內(nèi)標(biāo)，每濃度四樣本，進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)峰面積，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取基質(zhì)效應(yīng)，分別為（98.9±9.09）%、（104.8±3.87）%、（102.5±6.20）%。

2.5 穩(wěn)定性考察 依據(jù)“2.3”項下方法制備穩(wěn)定性QC樣品，每濃度3個樣本，不經(jīng)提取，經(jīng)-80℃放置30d后，測定樣品濃度；或經(jīng)反復(fù)3次-20℃冰凍-溶解循環(huán)，測定樣品濃度。結(jié)果（表2）表明：所有凍融試驗測定值與添加值的相對偏差（R.E.%）均小于15%。即血漿樣品可以進(jìn)行反復(fù)凍融或在-80℃放置30d，不會影響測試結(jié)果的準(zhǔn)確度。

試驗中對處理后的QC樣品（每濃度3個樣本）進(jìn)行了2.5 h室溫放置穩(wěn)定性考察，結(jié)果顯示所有樣品的試驗測定值與添加值R.E.%均小于15%，說明分析測試過程中的樣品較為穩(wěn)定。

2.6 分析方法在藥動學(xué)研究中的應(yīng)用 4例健康受試者，男女各半。試驗方案經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。向受試者解釋知情同意，并簽署受試者知情同意書進(jìn)入該試驗。受試者于服藥前1d入住I期病房，并于第2天8：00口服1g異丙肌苷片（北京賽而生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20081215），溫開水200mL送服。臨床醫(yī)生及研究者隨時觀察不良事件并對受試者進(jìn)行監(jiān)護。給藥前、給肌苷藥后10、20、30、45min，1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、6.00h于上肢肘窩靜脈取血5mL，按“1.2.2”操作，以當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各時間點的血藥濃度，測得的藥時曲線見圖2。由圖2可見，給藥前，健康受試者血漿基礎(chǔ)肌苷在20～60ng／mL。

圖2 4名健康受試者口服1g異丙肌苷后肌苷血藥濃度-時間曲線

3 討 論

3.1 肌苷作為一種內(nèi)源性核苷類物質(zhì)，對其定量分析報道不多。Jeng等［12］用LC-MS／MS同時定量分析了肝癌患者和健康人尿中7種核苷；David等［13］利用微滲析技術(shù)用 HPLCDAD檢測了犬心肌缺血模型細(xì)胞間隙中5種核苷濃度；文獻(xiàn)［14-15］報道用HPLC-DAD或HPLC-UV測定人血漿中內(nèi)源性肌苷濃度。本實驗建立了人血漿肌苷LC-MS／MS分析方法，該方法靈敏度高（定量下限10ng／mL），分析時間短，處理方法簡單（一步沉淀蛋白），試用于高通量的藥代動力學(xué)研究或臨床樣本檢測。該方法已應(yīng)用于健康受試者口服異丙肌苷后的體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。

3.2 肌苷在全血和血漿中均不穩(wěn)定。在全血中，嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）快速代謝肌苷成為次黃嘌呤（t1／2＜5min）；在血漿中，PNP的活力相對較低［14］。因此，為保證樣品在處理過程中的穩(wěn)定性，盡快按照“1.2.2”處理，置-80℃冰箱保存。高氯酸可以破壞酶的活性，所以高氯酸處理過的樣品相對穩(wěn)定。實驗證明含肌苷的新鮮大鼠血漿處理后上清-80℃下至少穩(wěn)定30d。同時未處理的含肌苷的新鮮血漿室溫放置一段時間（3d）后肌苷完全降解，可以用來作為空白血漿配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，不干擾肌苷和內(nèi)標(biāo)阿德福韋的定量分析。

3.3 4例受試者的血藥濃度-時間曲線見圖2。由圖可見，4名受試者的藥-時曲線均呈現(xiàn)不規(guī)律的多峰現(xiàn)象，推測其原因可能是多方面的。肌苷為機體內(nèi)源性物質(zhì)，內(nèi)源性肌苷的干擾無法避免；在人體內(nèi)，肌苷的變化途徑復(fù)雜，作為嘌呤代謝過程中一個中間代謝產(chǎn)物，可以由腺苷、次黃嘌呤核苷酸和次黃嘌呤生成肌苷，同時肌苷也能通過不同途徑代謝成次黃嘌呤或次黃嘌呤核苷酸，十幾種酶參與其中，如肌苷酶、核苷磷酸化酶等。很多情況下，機體會針對某種內(nèi)源性物質(zhì)的增多或減少發(fā)生代償反應(yīng)，肌苷在人體內(nèi)是否存在這種代償性的保護機制目前尚不明確；另外，有些內(nèi)源性物質(zhì)受飲食、晝夜節(jié)律或生理周期影響明顯，肌苷是否受飲食、晝夜節(jié)律或生理周期的影響還需進(jìn)一步考察。

本研究建立LC-MS／MS測定人血漿中肌苷濃度的方法并進(jìn)行了方法確證。該方法專屬性強，樣品處理方便，靈敏度高，適用于肌苷臨床藥動學(xué)研究。

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