改良摻食法建立苯巴比妥成癮大鼠模型＊

韓 彬，王國俊△，傅 萍，葉 云

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川瀘州646000；2.四川省食品藥品檢驗所，成都611731）

藥物成癮（addiction）是濫用藥物的后果，指習(xí)慣于攝入某種藥物而產(chǎn)生的一種依賴狀態(tài)，撤去藥物后可引起一些特殊的癥狀即戒斷癥狀，又稱藥物依賴性。成癮性藥物可誘發(fā)欣快感或緩解疼痛，持續(xù)使用促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生適應(yīng)性改變，導(dǎo)致出現(xiàn)耐受性、依賴性、嗜欲性和復(fù)發(fā)性［1］。苯巴比妥是一種臨床應(yīng)用非常廣泛的催眠鎮(zhèn)靜藥物，隨著其新的藥理作用不斷被發(fā)現(xiàn)，大量使用此類藥物所帶來的藥物成癮已經(jīng)成為臨床日益重視的問題。

既往文獻(xiàn)中對于巴比妥類藥物成癮的研究，一般采用苯巴比妥或者巴比妥，用大鼠、小鼠、狗、猴為試驗對象，一般是采用劑量遞增的灌胃、腹腔注射、摻食的方式［2］。灌胃或腹腔注射造模方法報道較多：建立大鼠苯巴比妥成癮模型多歷時90 d左右，操作要求較高，對大鼠損傷較大［3］；國內(nèi)摻食法造模較少報道：一般第1 周內(nèi)讓大鼠日攝入藥量達(dá)100 mg／kg，逐漸增加劑量到600 mg／kg，歷時10 周以上［2］，造模耗時較長；國外有報道摻食法歷時40 d 左右建立苯巴比妥成癮模型，但劑量遞增方法不盡相同［4］。模型檢驗一般采用停止攝入藥物方式自然戒斷、中樞興奮藥催促戒斷以驗證造模是否成功［5］。

本實驗參考國內(nèi)外文獻(xiàn)報道［3-6］，對既往造模方法加以改進(jìn)，選用大鼠為實驗動物，采用摻食法造模，苯巴比妥起始劑量75 mg／kg，逐日遞增劑量，經(jīng)45 d，模型分別采用文獻(xiàn)報道的催促戒斷法及自然戒斷法加以檢驗，結(jié)果表明大鼠形成了穩(wěn)定的苯巴比妥依賴。本法操作簡單，造模時間較既往明顯縮短，有效地避免了長期灌胃及注射對大鼠造成的痛苦，無大鼠死亡，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠雌雄各半，重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，動物批準(zhǔn)號SCXK（渝）2012-0008，體質(zhì)量150～200 g。所有大鼠自由攝食、飲水1 周適應(yīng)環(huán)境。

1.2 藥品與試劑 苯巴比妥片，每片30 mg，上海信誼藥廠有限公司提供，批號120401；異煙肼注射液，規(guī)格2 m L：100 mg，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司提供，批號1112281。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法80 只大鼠分為對照組（催促戒斷對照組、自然戒斷對照組），造模組（苯巴比妥催促戒斷模型組、苯巴比妥自然戒斷模型組）共4 組，每組20 只，雌雄各半。苯巴比妥造模組用劑量遞增的苯巴比妥片粉末摻入粉末狀的大鼠食物喂養(yǎng)，藥物劑量為結(jié)合臨床，以Meeh Rubner 公式即人與大鼠間藥物劑量體表面積換算關(guān)系為依據(jù)［7］，并參考相關(guān)動物試驗［5-6］及前期試驗［8-9］的用藥劑量而定。1～10d 苯巴比妥起始濃度為75 mg ·kg-1 ·d-1，11～20d 劑量為120mg ·kg-1 ·d-1，21～30 d 劑量為165 mg ·kg-1 ·d-1，31～45d 劑量為210 mg ·kg-1 ·d-1。對照組則用普通的粉末狀飼料喂養(yǎng)。造模第33 天苯巴比妥催促戒斷模型組用催促戒斷試驗驗證成癮模型制造進(jìn)展，自然戒斷組繼續(xù)喂養(yǎng)至第45 天后停藥。

1.3.2 模型檢驗 大鼠催促戒斷試驗?zāi)Ｐ蜋z驗：造模第33天，催促戒斷試驗驗證成癮模型制造進(jìn)展，苯巴比妥催促戒斷模型組大鼠，用普通的不含苯巴比妥的食物代替含苯巴比妥的混合食物喂養(yǎng)大鼠并稱取重量，戒斷16 h 后用誘導(dǎo)驚厥閾下劑量150 mg／kg 的異煙肼對大鼠給予腹腔注射［10-11］，觀察半小時內(nèi)的大鼠反應(yīng)并統(tǒng)計驚厥率；直至第72 小時，每日稱取重量［12］。與對 照組相 比較，χ2檢驗驚厥率差異的顯著性，t檢 驗重量減輕程度差異的顯著性。大鼠自然戒斷試驗?zāi)Ｐ蜋z驗：造模第46 天，苯巴比妥自然戒斷模型組大鼠停藥，稱取重量，每隔8 h 進(jìn)行戒斷癥狀觀察并評分直至72 h［12］，統(tǒng)計戒斷癥狀評分，每日稱取重量，與對照組相比較，t檢驗差異的顯著性。

1.3.3 對照組及造模組腦切片情況（光鏡下情況）上述各組大鼠處死，腦組織切片，HE 染色，光鏡下觀察對比切片情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算各組戒斷后的體質(zhì)量變化百分率、催促戒斷各組驚厥百分率、自然戒斷各組戒斷癥狀評分，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

采用上述摻食法建立大鼠苯巴比妥成癮模型，分別采用催促戒斷、自然戒斷兩種方法進(jìn)行模型檢驗，表明該方法能成功用于建立大鼠苯巴比妥成癮模型，方法簡便可行，造模過程中未發(fā)生大鼠死亡。

2.1 大鼠苯巴比妥成癮模型催促戒斷法模型檢驗結(jié)果 催促戒斷組的驚厥發(fā)生率為60%，明顯高于對照組（P＜0.05），見表1。催促戒斷組的體質(zhì)量明顯下降，至72 h 仍沒恢復(fù)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 大鼠注射INH后驚厥情況

表2 大鼠催促戒斷后體質(zhì)量變化情況（±s，%）

表2 大鼠催促戒斷后體質(zhì)量變化情況（±s，%）

＊：P＜0.05，與對照組比較。

戒斷后 對照組 催促戒斷組24 h 0.58±1.48 -2.06±1.85＊48 h -0.71±1.29 -5.11±2.44＊72 h 0.16±1.94 -4.32±2.69＊

2.2 摻食法大鼠苯巴比妥成癮模型自然戒斷法進(jìn)行模型檢驗結(jié)果 戒斷后第16 小時開始模型組有大鼠出現(xiàn)戒斷癥狀，如興奮不安、嘶叫、流涎、稀便、豎毛、顫抖、四肢亂抓。24～48 h癥狀出現(xiàn)到達(dá)頂峰，開始出現(xiàn)陣發(fā)性驚厥，呼吸急促，四肢痙攣，全身皮膚發(fā)白，牙關(guān)打顫，個別大鼠出現(xiàn)強直性陣攣甚至死亡（圖1～3）。48～72 h 癥狀稍有減輕，體質(zhì)量下降尤為明顯，至72 h 仍未恢復(fù)。自然戒斷組24～72h 的戒斷癥狀評分（標(biāo)準(zhǔn)見表3）與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4，體質(zhì)量減輕與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

圖1 大鼠興奮、掙扎

圖2 大鼠陣發(fā)驚厥、跌倒

圖3 大鼠強直驚厥

表3 大鼠戒斷癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)＊

2.3 成癮大鼠腦切片情況 大鼠苯巴比妥成癮，與腦細(xì)胞的凋亡相關(guān)聯(lián)［6］，一般認(rèn)為大鼠對苯巴比妥的依賴性越強，其額葉腦細(xì)胞凋亡數(shù)目占額葉腦細(xì)胞總數(shù)比例越高，將上述大鼠進(jìn)行斷頭取腦額葉部位，切片HE染色，可觀察到對照組與模型組對比腦細(xì)胞形態(tài)的變化［9，13］。對照組：腦細(xì)胞形態(tài)完好，細(xì)胞核清晰可見，胞質(zhì)顏色正常（圖4）造模組：細(xì)胞體積小，胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)以不同形式凝聚：有的凝聚于核膜之下；有的呈典型的新月形；有的凝聚成一大塊或幾小塊占據(jù)整個核區(qū)（圖5、6）。

表4 大鼠自然戒斷評分（±s，n＝20）

表4 大鼠自然戒斷評分（±s，n＝20）

＊：P＜0.05，與對照組比較。

時間 對照組 自然戒斷組8 h 0.05±0.220.15±0.3716 h 0.10±0.310.35±0.4824 h 0.05±0.221.15±0.67＊32 h 0.10±0.311.80±0.69＊40 h 0.05±0.222.89±0.69＊48 h 0.00±0.003.31±0.66＊56 h 0.15±0.363.03±0.84＊64 h 0.10±0.311.94±0.87＊72 h 0.05±0.221.72±0.75＊

表5 大鼠自然戒斷后體質(zhì)量變化情況（±s，%）

表5 大鼠自然戒斷后體質(zhì)量變化情況（±s，%）

＊：P＜0.05，與對照組比較。

戒斷后 對照組 自然戒斷組24 h 0.08±1.41 -4.59±1.07＊48 h 0.71±1.62 -9.16±2.98＊72 h 0.33±1.97 -7.99±3.06＊

圖4 對照組腦細(xì)胞HE 染色切片（×200）

圖5 催促模型組腦細(xì)胞HE 染色切片（×200）

圖6 自然戒斷組腦細(xì)胞HE 染色切片（×200）

3 討 論

戒斷反應(yīng)是藥物成癮的明顯特征之一，指停止使用藥物或減少使用劑量或使用拮抗劑占據(jù)受體后所出現(xiàn)的特殊的心理癥候群，其機(jī)制是由于長期用藥后，突然停藥引起的適應(yīng)性反跳，癥狀是出現(xiàn)反跳性的興奮性升高。苯巴比妥是一種在臨床使用廣泛，成癮性較大的催眠鎮(zhèn)靜抗癲癇藥，本身有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用，能夠提高驚厥的發(fā)作閾值［12］。然而長期使用該藥后忽然停藥，卻會導(dǎo)致包括自發(fā)性的驚厥在類的戒斷癥狀出現(xiàn)。在苯巴比妥模型建立過程中，停藥戒斷后的亢奮、厭食、多汗、體質(zhì)量減輕、自發(fā)性驚厥等癥狀可以作為動物身體依賴的觀察指標(biāo)，也可以根據(jù)程度的不同用來劃分戒斷癥狀的嚴(yán)重等級。

本試驗動物用藥起始劑量（75 mg／kg）為結(jié)合臨床，以Meeh Rubner 公式即人與大鼠間藥物劑量體表面積換算關(guān)系為依據(jù)［7］，并參考相關(guān)動物試驗［4-6］及前期試驗［8-9］的用藥劑量而定，此劑量會在一定程度上對大鼠造成輕微的中樞抑制，但一般不會造成嚴(yán)重的中樞而抑制影響活動進(jìn)食。每日早上用少量食物粉末混合藥物粉末，密切觀察大鼠，保證全部食物及藥物均完全攝入大鼠體內(nèi)，從而有效避免大鼠因為進(jìn)食飲水習(xí)慣導(dǎo)致的藥物未完全攝入體內(nèi)。待大鼠吃光后再給予剩余的正常粉末食物。在摻食法造模過程中需注意的是：初期給藥期間如果出現(xiàn)大鼠中樞抑制極其嚴(yán)重已經(jīng)不能正常進(jìn)食可以略微減少給藥的劑量再逐漸遞增，在計算催促戒斷的驚厥率的時候，只奔跑未倒地和奔跑倒地的動物，均應(yīng)一并計算驚厥發(fā)生率。

與現(xiàn)有的灌胃法和腹腔注射法相比，摻食法建立苯巴比妥依賴模型的優(yōu)勢在于可以讓大鼠以最自然的方式攝入藥物，灌胃法導(dǎo)致的食道損傷和腹腔注射法導(dǎo)致的局部感染潰瘍等問題都可以避免，可以更好地模擬患者平時長期服用藥物形成的藥物依賴，大大減少實驗動物在實驗過程中的死亡數(shù)量（采用文獻(xiàn)報道方法灌胃法造苯巴比妥成癮大鼠模型時發(fā)現(xiàn)該方法操作要求較高，動物死亡數(shù)較多，且造模歷時較長，由于病死率高的原因模型成型率較低）；而與現(xiàn)有文獻(xiàn)的摻食法需要造模時間10～12 周相比，本法將大鼠的初始攝藥劑量略微增加，加大了藥物的遞增梯度劑量，以起始劑量75 mg ·kg-1 ·d-1 開始用藥（以出現(xiàn)中樞抑制狀態(tài)為標(biāo)志［5］）直至劑量高達(dá)210 mg ·kg-1 ·d-1，造模時間僅僅為45 d，除戒斷檢驗?zāi)Ｐ蜁r有大鼠出現(xiàn)驚厥死亡外，造模過程中無大鼠死亡，在第33 天用催促戒斷的方式驗證成癮模型制造進(jìn)展，45 d 就可以觀察到自然戒斷癥狀，與以往文獻(xiàn)相比較，最終成型的模型在相同的時間段均能觀察到相似的戒斷癥狀和體質(zhì)量減輕情況。多年的研究表明藥物濫用對大腦有損傷，藥物濫用導(dǎo)致的成癮是一種腦疾病，Cadet 等［14］將藥物成癮造成的腦細(xì)胞喪失與細(xì)胞凋亡機(jī)制聯(lián)系在一起，認(rèn)為藥物成癮的神經(jīng)損傷是由激活調(diào)控細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制引起的。本實驗中造模組大鼠腦切片圖顯示：造模組大鼠腦細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡改變，符合成癮大鼠腦細(xì)胞改變情況，進(jìn)一步表明造模成功。

近期研究發(fā)現(xiàn)，成癮不僅有關(guān)于腦細(xì)胞的凋亡調(diào)控［15］，而且與學(xué)習(xí)和記憶也密切相關(guān)［16］，本造模法建立的苯巴比妥成癮模型所造成的身體依賴結(jié)果可靠，重復(fù)性好，可以成為成癮腦細(xì)胞凋亡調(diào)控與成癮學(xué)習(xí)記憶能力研究的基礎(chǔ)。

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