微小RNA鼻咽癌潛在的診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)

龍表利綜述，胡國(guó)華審校

（1．重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科 402360；2．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科 400016）

鼻咽癌主要為非角化鱗狀細(xì)胞癌，其惡性程度很高，伴隨著局部浸潤(rùn)和早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鼻咽癌的病因主要包括3個(gè)方面，即遺傳易感性、環(huán)境因素和EB病毒（EBV）感染，然而，鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制仍未完全明確。鼻咽癌對(duì)放化療非常敏感，如果腫瘤僅局限于鼻咽部，可以通過(guò)放療治愈。遺憾的是，30%～40%確診的患者已經(jīng)到了晚期，他們往往在治療4年后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)。因此，迫切需要更深入地研究鼻咽癌的分子機(jī)制，尋找早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物及開發(fā)新的治療方案。

從體液中檢測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物的方法叫做“體液活檢”。最近，這種方法被高度重視，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)自由核酸類物質(zhì)DNA、mRNA和微小RNA（mi RNA）作為血液中生物學(xué)標(biāo)志物具有潛在的價(jià)值。這些天然的內(nèi)源性小RNA分子可以下調(diào)或抑制mRNA的表達(dá)，在很多生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。他們可能不僅是潛在的生物標(biāo)志物，還是克服耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)的藥物靶點(diǎn)。本文主要從mi RNA與鼻咽癌、mi RNA作為診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物及mi RNA作為鼻咽癌的治療靶點(diǎn)3個(gè)方面進(jìn)行了綜述。

1 mi RNA與鼻咽癌

1．1 mi RNA mi RNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA分子，長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸，新近發(fā)現(xiàn)在所有真核生物中起轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。早在1993年，mi RNA在新桿狀線蟲lin-4類中首次被發(fā)現(xiàn)［1］。Lin-4編碼小RNA，通過(guò)反義RNA之間相互作用調(diào)節(jié)lin-14翻譯。最初，人們認(rèn)為lin-4僅在蛔蟲中存在，并沒(méi)有得到廣泛的關(guān)注。直到2001年，3個(gè)研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)報(bào)道了他們關(guān)于mi RNA作為基因沉默調(diào)節(jié)器的研究［2-4］。之后，這些mi RNA受到極大的關(guān)注。目前，在所有多細(xì)胞真核生物、一些單細(xì)胞真核生物甚至一些非細(xì)胞生物（如病毒）中都已明確有mi RNA的存在。研究發(fā)現(xiàn)mi RNA在高等生物中是RNA調(diào)節(jié)器中最重要的一類?；谏镄畔W(xué)分析，在多細(xì)胞真核生物中，mi RNA調(diào)節(jié)超過(guò)60%的基因。

一個(gè)成熟的mi RNA作為反式作用因子調(diào)節(jié)大多數(shù)基因，徹底改變了人們對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的看法。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約50%mi RNA定位在易碎的染色體區(qū)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中，這些染色體區(qū)域可能會(huì)出現(xiàn)DNA擴(kuò)增、缺失和易位。另一個(gè)重大的發(fā)現(xiàn)是在2004年成功鑒定病毒編碼的mi RNA（病毒mi RNA，v mi RNA）［5］。腫瘤相關(guān)v mi RNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用。

1．2 mi RNA在鼻咽癌中的機(jī)制 眾所周知，鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，有許多重要的分子和相應(yīng)的信號(hào)通路參與。研究證實(shí)EBV潛伏膜蛋白、Wnt／β-catenin通路的分子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)MAPK／ERK信號(hào)通路，在鼻咽癌發(fā)生、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的所有步驟中mi RNA起了一個(gè)關(guān)鍵的作用。許多科學(xué)家致力于發(fā)現(xiàn)mi RNA在鼻咽癌發(fā)展中的功能。Mi R-200a靶基因ZEB2和β-catenin不僅抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，而且有助于上皮細(xì)胞間質(zhì)向干細(xì)胞的過(guò)度，這是致癌作用的關(guān)鍵步驟［6］。c-Myc是細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因子，研究表明c-Myc調(diào)節(jié)一系列mi RNA且被mi RNA調(diào) 節(jié)，如mi R-34b、-34c、-18a、-29a／b、-100、-141、-221和let-7家族成員。mi RNA功能失調(diào)導(dǎo)致一些其他重要分子的異常，如EZH2，一個(gè)多硫蛋白基因產(chǎn)物，調(diào)節(jié)組蛋白3的甲基化［7-8］；Plk1，調(diào)節(jié)G2／M期過(guò)渡的激酶；ROBO1，血管生成受體和調(diào)節(jié)子；Cox-2，前列腺素合成的限速酶。所有這些蛋白質(zhì)在發(fā)病機(jī)理、轉(zhuǎn)移和預(yù)后差等方面起了重要作用。兩大實(shí)驗(yàn)室同時(shí)證明了mi RNA（mi R-26a，-98、-101）失調(diào)導(dǎo)致EZH2致癌基因過(guò)表達(dá)、細(xì)胞增殖、腫瘤形成和抑制細(xì)胞分化。在鼻咽癌中，降低mi R-26a表達(dá)能夠激活c-myc、細(xì)胞周期蛋白D3和E2、細(xì)胞周期依賴激酶CDK4和CDK6，抑制CDK抑制劑p14、ARF、p21、CIP1的表達(dá)［7-8］。mi R-100下調(diào)導(dǎo)致Plk1過(guò)表達(dá)。通過(guò)mi RNA使Plk1表達(dá)沉默導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂顯著增強(qiáng)［9］。抑制mi R-26b導(dǎo)致COX-2蛋白在去鐵敏（解毒藥，DFOM）處理的鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。Mi R-10b在EBV陽(yáng)性的C666-1／L MP鼻咽癌細(xì)胞中上調(diào)。相反的，在L MP1陰性的C666-1細(xì)胞過(guò)表達(dá)mi R-10使鼻咽癌細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)并導(dǎo)致荷瘤裸鼠死亡。下調(diào)mi R-218，導(dǎo)致SLIT表觀遺傳學(xué)沉默，細(xì)胞凋亡蛋白BIRC5在鼻咽癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。Mi R-28通過(guò)下調(diào)SLIT2-ROBO1通路抑制鼻咽癌進(jìn)展。

2 mi RNA作為診斷和預(yù)后的標(biāo)志物

2．1 EBV編碼的v mi RNA EBV基因組總共有25個(gè)EBV mi RNA前體和44個(gè)成熟v mi RNA，對(duì)應(yīng)BHRF1區(qū)（4個(gè)mi RNA）和BART區(qū)（40個(gè)mi RNA）。研究表明在鼻咽癌中BHRF1區(qū)無(wú)mi RNA表達(dá)，然而，BART mi RNA調(diào)節(jié)病毒和宿主靶點(diǎn)使其潛伏感染更容易，同時(shí)誘發(fā)致癌信號(hào)。

至今，在鼻咽癌中只有少數(shù)EBV mi RNA功能和作用靶點(diǎn)已經(jīng)明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已有3個(gè)EBV mi RNA，（mi RBART1-5p、mi R-BART16和mi RBART17-5p）引起EBV蛋白L MP1下調(diào)［10］。L MP1調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)從而控制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，通過(guò)mi R-BART5下調(diào)宿主細(xì)胞基因PUMA抑制病毒感染的宿主細(xì)胞凋亡［11］。Mi R-BART2靶向作用于EBV DNA聚合酶BALF5，可能在細(xì)胞溶解到潛伏感染的過(guò)渡期通過(guò)延緩病毒的復(fù)制促進(jìn)病毒進(jìn)入潛伏期［12］。通過(guò)mi R-BART2使L MP2 A表達(dá)下調(diào)，有可能允許EBV感染的鼻咽癌細(xì)胞逃離宿主的免疫監(jiān)督［13］。mi RBHRF1-3抑制干擾素誘導(dǎo)CXCL11，可阻斷EBV從T細(xì)胞感染B細(xì)胞。然而下調(diào)應(yīng)急誘導(dǎo)的自然殺傷（NK）細(xì)胞如MICB，mi R-BART2-5p導(dǎo)致病毒從識(shí)別和消除的NK細(xì)胞中逃逸［14-15］。Wong等［16］報(bào)道，通過(guò)mi RNA調(diào)節(jié)宿主與病毒相互作用機(jī)制，揭示mi RNA涉及到鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，而且對(duì)臨床運(yùn)用“體液活檢”篩選生物學(xué)標(biāo)志物具有巨大潛力，因?yàn)樗拗餮鍁 mi RNA與EBV v mi RNA有明確的相關(guān)性。EBV編碼的mi RNA見(jiàn)表1。

表1 鼻咽癌中EBV編碼的mi RNA

2．2 人類宿主編碼的mi RNA 實(shí)時(shí)調(diào)查原始致癌EBV和宿主細(xì)胞相互作用并揭示病毒與細(xì)胞的監(jiān)管動(dòng)態(tài)比較困難。然而，仍然可以在臨床樣本中檢測(cè)到mi RNA，在體內(nèi)外試驗(yàn)中研究他們的功能。

最近，人們嘗試各種各樣的方法在臨床鼻咽癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)人類mi RNA及與TNM分期的聯(lián)系。2008年，Sengupta等［17］運(yùn)用激光顯微切割成對(duì)的鼻咽癌組織（腫瘤組織和癌旁組織）揭示了mi RNA表達(dá)譜。他們發(fā)現(xiàn)8個(gè)（共207）mi RNA較明顯的表達(dá)改變，進(jìn)一步研究mi R-29c的功能顯示這個(gè)宿主mi RNA（h mi RNA）通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白參與了鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。后來(lái)，用PCR mi RNo mes研究，鼻咽癌細(xì)胞中35個(gè)（共270）h mi RNA有顯著的改變［18］。最近，34個(gè)h mi RNA的表達(dá)改變通過(guò)組織芯片研究，且與鼻咽癌臨床分期相關(guān)。引人注目的是，神經(jīng)系統(tǒng)和感官知覺(jué)的發(fā)育與鼻咽癌相關(guān)［19］。從5對(duì)鼻咽癌組織和癌旁組織mi RNo mes中，Wong等［16］利用一個(gè)大規(guī)模的陣列（包含850個(gè)宿主mi RNA和39個(gè)EBV病毒mi RNA）研究宿主病毒相互作用。

2．3 細(xì)胞自由mi RNA 除了大多數(shù)人們關(guān)注的細(xì)胞內(nèi)mi RNA，最近在EBV陽(yáng)性的細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一些mi RNA。這些循環(huán)mi RNA能夠進(jìn)一步參與和抑制周圍細(xì)胞和臨近受體細(xì)胞的功能［20］。Rechavi等［21］報(bào)道稱，當(dāng)EBV編碼的mi RNA與B細(xì)胞共培養(yǎng)，B細(xì)胞向非EBV感染的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化。更重要的是，他們發(fā)現(xiàn)mi RNA在受體T細(xì)胞中使目標(biāo)基因表達(dá)沉默。另外一個(gè)研究顯示在多個(gè)鼻咽癌細(xì)胞中（如C15、C17和C666-1），BART mi RNA-1（mi R-1-5p和5）和BART mi RNA-2（mi R-7-3p、12和13）被釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中；此外，BART mi RNA在鼻咽癌裸鼠和鼻咽癌患者血清中均能檢測(cè)到［22］。Meckes等［23］不僅檢測(cè)到鼻咽癌細(xì)胞分泌BART-mi RNA，而且鑒定了病毒腫瘤蛋白L MP1作為分泌BART-mi RNA的信使。在這項(xiàng)研究中，進(jìn)一步評(píng)估L MP1在調(diào)節(jié)外分泌體（如BART-mi RNA）中的作用，L MP1增加表皮生長(zhǎng)因子受體的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和PI3 K／Akt信號(hào)通路的活化。近日，在血清中檢測(cè)到EBV編碼的cf mi RNA［16］。研究人員首次運(yùn)用微陣列技術(shù)分析5對(duì)鼻咽癌組織芯片v mi RNA的表達(dá)差異，用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)證實(shí)了表達(dá)上調(diào)的v mi RNA有12個(gè)（BART1-3p、2-5p、5、6-5p、6-3p、7、8、9、14、17-5p、18-5p、19-3p）。他們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血清中的v mi RNA與鼻咽癌細(xì)胞中的v mi RNA在數(shù)量上有明確的相關(guān)性。從生物信息學(xué)角度進(jìn)一步分析結(jié)果提示BART v mi RNA是許多信號(hào)通路的靶分子。顯然，v mi RNA參與PTEN（PI3 K／AKT通路）和Wnt信號(hào)通路（表1），包括抑癌基因如WIF1、NKD、CXXC4和APC（關(guān)鍵的Wnt抑制分子）和一些其他的信號(hào)分子如Wnt級(jí)聯(lián)信號(hào)（ERK信號(hào)的NLK和調(diào)節(jié)泛素水解的BTRCP）相互調(diào)節(jié)［16］。

3 mi RNA基因治療

攜帶mi RNA的慢病毒可用于鼻咽癌的基因治療。2009年，Li等［24］用慢病毒表達(dá)mi R-155使環(huán)氧合酶-2（cox-2）在鼻咽癌細(xì)胞C666-1中表達(dá)沉默。他們研究表明Lenti-mi R-155可能會(huì)是一個(gè)更好的cox-2抑制劑。Qu等［25］通過(guò)研究mi R-155導(dǎo)致無(wú)線電電阻錳超氧化物歧化酶（SOD2）的沉默是否減少鼻咽癌抗電離輻射，結(jié)果表明mi R-155在CNE1細(xì)胞過(guò)表達(dá)，65%SOD2 mRNA和80%蛋白質(zhì)下調(diào)，克隆形成減少（從24．5%減少到9．67%），提示mi R-155可能會(huì)提高鼻咽癌放療效率。而Lenti-mi R-26a顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力，提示了一個(gè)潛在的治療價(jià)值［7］。

4 結(jié)論與展望

mi RNA在鼻咽癌中各種生物功能的研究為人們提供了很有價(jià)值的信息，揭露了EBV相關(guān)性鼻咽癌發(fā)生的潛在機(jī)制。EBV利用他的v mi RNA通過(guò)推遲復(fù)制周期使其更容易在體內(nèi)潛伏（如通過(guò)BART 2-5p失去對(duì)BALF5的調(diào)節(jié)功能）和逃避NK細(xì)胞（如MICB）。一旦EBV成功定居于易感的上皮細(xì)胞，病毒侵襲性感染逐漸變得活躍起來(lái)，漸漸開始有選擇性地表達(dá)其癌基因和幾個(gè)致癌mi RNAs，如L MP1／2和BART mi RNA在幾個(gè)通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子信號(hào)轉(zhuǎn)換過(guò)程中相互交流如βcatenin、NF-κB、ERK、c-myc。致癌作用經(jīng)過(guò)多步驟積累，鼻咽上皮細(xì)胞逐漸發(fā)展為一個(gè)腫瘤微環(huán)境，伴隨異?；虮磉_(dá)，增殖不受控制（如Pl K1、cyclin D和E）和抗細(xì)胞凋亡（如PUMA）。EBV甚至可以釋放致癌物質(zhì)，這些物質(zhì)攜帶超負(fù)荷的病毒和細(xì)胞產(chǎn)物（如L MP1、v mi RNA和EGFR）到體液中形成一個(gè)易于腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的環(huán)境（如MMPs、Cox-2、ROBO1和ECM）。

通過(guò)micro RNA增進(jìn)宿主與病毒之間相互交流作用，如h mi RNA和v mi RNA，為鼻咽癌腫瘤形成提供可能的潛在機(jī)制。hmi RNA和v mi RNA的大量研究，不僅可以作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物用于篩查高危人群，而且可以成為鼻咽癌治療靶點(diǎn)，增加鼻咽癌放化療敏感性，降低復(fù)發(fā)和耐藥性。

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