纈沙坦對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及p-ERK1／2、p-P38表達(dá)的影響

陳宗建，張延斌

（江蘇省昆山市第二人民醫(yī)院，江蘇昆山215300）

冠心病是威脅人類身體健康的一類重大疾病。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）是目前冠心病介入治療的重要方法，主要包括經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)和支架植入術(shù)［1］。但是，PCI術(shù)后的近期效果理想，而遠(yuǎn)期效果并不理想，術(shù)后再狹窄是人類面臨的又一難題。血管平滑肌細(xì)胞（vascular s mooth muscle cell，VSMCs）的異常增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄的主要病理基礎(chǔ)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）與支架術(shù)后再狹窄的發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，AT1受體的激活可促進(jìn)VSMCs的增殖與遷移，故ARB（常用高血壓一線治療藥）可能會(huì)降低支架植入后的再狹窄率。目前，AngⅡ通過(guò)p-ERK1／2促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活促進(jìn)VSMCs增殖與遷移的機(jī)制已被證實(shí)［3］，但纈沙坦（Val）對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖與遷移的影響以及與p-ERK1／2、p-P38 MAPK表達(dá)關(guān)系的研究并不多。

本研究觀察了Val對(duì)AngⅡ刺激下離體大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs的增殖與遷移及p-ERK1／2、p-P38 MAPK表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 主要材料與試劑 Sprague-Dawley大鼠，雄性，體質(zhì)量150～200 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；Val（常州四藥有限公司惠贈(zèng)），AngⅡ（Sig ma，美國(guó)），PD98059（ERK1／2上游激酶的特異性抑制劑）（Sigma，美國(guó)），SB23015（P38上游激酶的特異性抑制劑）（Sig ma，美國(guó)），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物材料有限公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；噻唑藍(lán)（MTT）（Sig ma，美國(guó)），兔抗鼠ERK1／2、p-ERK1／2-抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，美國(guó)原裝進(jìn)口分裝），兔抗鼠P38、p-P38-抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，美國(guó)原裝進(jìn)口分裝）。

1．2 VSMCs的培養(yǎng)與鑒定 取雄性Sprague-Dawley大鼠1只，10%水合氯醛2 mL腹腔注射麻醉，75%乙醇浸泡消毒5 min。移入超凈工作臺(tái)，解剖分離出大鼠心肺組織與胸主動(dòng)脈，剪下胸主動(dòng)脈放于培養(yǎng)皿，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗數(shù)次。眼科剪縱行剖開(kāi)血管，眼科彎鑷自上而下輕刮內(nèi)膜2～3遍去除單層的內(nèi)皮細(xì)胞，鑷子剝離外膜。更換培養(yǎng)皿，加入少量20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，眼科剪反復(fù)剪碎血管中膜組織成11 mm2×1 mm2大小（剪切10 min左右）。用彎頭吸管將血管組織小塊移入一次性塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，均勻種植于培養(yǎng)瓶底，蓋好瓶蓋，平躺放入培養(yǎng)箱內(nèi)。3～4 h后加入3～5 mL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，使植塊剛好浸入培養(yǎng)液中。培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)3 d后，換新鮮培養(yǎng)液，以后根據(jù)具體情況更換培養(yǎng)基，初期盡量少動(dòng)，以免影響細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)。待植塊周圍生長(zhǎng)暈的細(xì)胞融合成片時(shí)，即可傳代。相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，采用第2代細(xì)胞行α-actin單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，取第3～5代VSMCs。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組：1%FBS的DMEM；AngⅡ組：AngⅡ（10-6mol／L）；Val1＋AngⅡ組：Val（10-3mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；Val2＋AngⅡ組：Val（10-4mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；Val3＋AngⅡ組：Val（10-5mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；PD＋AngⅡ組：PD98059（10-5mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；SB＋AngⅡ組：SB23015（10-5mol／L）＋AngⅡ（10-6mol／L）；Val組：Val（10-3mol／L）。

1．4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化、離心，10%FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞成5×104／mL的密度，接種于96孔板，200μL／孔，培養(yǎng)24 h。換用0．5%FBS的DMEM培養(yǎng)液，200μL／孔，培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于靜止生長(zhǎng)期（G0／G1期）。換用1%FBS的DMEM培養(yǎng)液，200 μL／孔，并進(jìn)行藥物干預(yù)，Val1＋AngⅡ組、Val2＋AngⅡ組、Val3＋AngⅡ組、Val組提前加入Val干預(yù)30 min，PD＋AngⅡ組、SB＋AngⅡ組提前分別加入PD98059，SB23015干預(yù)30 min，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MTT分析檢測(cè)：細(xì)胞培養(yǎng)20 h時(shí)每孔加入MTT（5 mg／mL）20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150μL，微量振蕩器振蕩約10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度OD值。

1．5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)測(cè)定VSMCs遷移距離 選擇第3～5代生長(zhǎng)良好的VSMCs，胰蛋白酶制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1．0×105／mL，均勻接種于6孔板中。在鋪板前，在板的背面用記號(hào)筆劃5～6道平行的橫線。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí)，吸棄原含10%血清的培養(yǎng)液，換用含0．5%血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使VSMCs同步化，處于G0／G1期。用無(wú)菌的200μL槍頭劃痕移液管尖（約0．7 mm）在各培養(yǎng)板細(xì)胞生長(zhǎng)單層相同位置劃垂直或平行直線，與以上的橫線要垂直，造成幾條“傷口”。PBS洗2次，去除被移液管尖破壞而脫落的細(xì)胞，加1%FBS的DMEM培養(yǎng)液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組先分別加入Val（10-3mol／L）、Val（10-4mol／L）、Val（10-5mol／L）、PD98059（10-5mol／L）、SB23015（10-5mol／L）與細(xì)胞孵育1 h，然后再加入AngⅡ繼續(xù)作用。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移。于24 h時(shí)觀察各組細(xì)胞遷移情況，超過(guò)劃線的細(xì)胞最遠(yuǎn)距離，即實(shí)際遷移距離。照相，測(cè)距離3次，計(jì)算均值。

1．6 Val、PD98059、SB23015、AngⅡ?qū)SMCs ERK1／2、p-ERK1／2、P38、p-P38蛋白表達(dá)的影響 選擇第3～5代生長(zhǎng)良好的VSMCs，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至60%～70%匯合時(shí)，換用含0．5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使VSMCs同步化，處于G0／G1期。換用1%FBS的DMEM培養(yǎng)液5 mL／瓶，各實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)藥物干預(yù)，對(duì)照組不處理，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在30 min結(jié)束培養(yǎng)。每瓶加入裂解液與酶抑制劑的混合液300μL，細(xì)胞刮刀刮下瓶底的細(xì)胞，迅速移入1．5 mL EP管中。離心12 000 r／min，4℃，20 min。吸取上清液，于-20℃冰箱中短期保存。按BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)蛋白濃度。按常規(guī)方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），2．5 mA／c m2，50 min轉(zhuǎn)膜（NC膜），取出NC膜，加入5%脫脂奶粉封閉液中置搖床輕輕搖動(dòng)封閉3 h，置 于ERK1／2、p-ERK1／2、P38、p-P38一 抗 工 作 液（1∶1 000），室溫下振搖2 h，4℃冰箱過(guò)夜，洗滌緩沖液清洗5 min×3遍，加入山羊抗兔二抗工作液（1∶1 000），室溫下振搖2 h，用洗滌緩沖液清洗5 min×3遍，雙蒸餾水洗5 min。10 mL AP底物緩沖液中先后加入66 L氯化硝基四氮唑藍(lán)和33 L-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（現(xiàn)配現(xiàn)用），將清洗好的NC膜放入AP顯色液中，搖床上邊搖邊觀察顯色情況，可見(jiàn)棕黑色的條帶。取出NC膜，避光晾干，將條帶掃描入電腦，采用Image J軟件分析灰度值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 VSMCs的鑒定 VSMCs鑒定：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色絲狀條紋者為陽(yáng)性。隨機(jī)挑取5個(gè)以上高倍視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞占95%以上方可用于實(shí)驗(yàn)。

2．2 Val、PD98059和SB23015對(duì)AngⅡ促進(jìn)VSMCs增殖的影響 與對(duì)照組相比，AngⅡ能明顯促進(jìn)VSMCs的增殖（P＜0．01）；Val在濃度為10-5～10-3mol／L時(shí)，呈濃度依賴性抑制VSMCs對(duì)AngⅡ的增殖（P＜0．01）。PD98059能抑制AngⅡ的促VSMCs增殖作用（P＜0．01）；而SB23015能明顯促進(jìn)AngⅡ的促VSMCs增殖作用（P＜0．01）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，Val單獨(dú)作用于VSMCs時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。表見(jiàn)1。

表1 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的MTT 結(jié)果±s，n＝6）

表1 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的MTT 結(jié)果±s，n＝6）

組別 24 h OD值對(duì)照組 0．379±0．033 a AngⅡ組0．598±0．051

續(xù)表1 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的MTT 結(jié)果（±s，n＝6）

續(xù)表1 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的MTT 結(jié)果（±s，n＝6）

a：P＜0．01，與AngⅡ組比較；b：P＜0．01，與Val 1＋AngⅡ組比較；c：P＜0．05，與AngⅡ組比較。

組別 24 h OD值Val 1＋AngⅡ組 0．422±0．043 a Val 2＋AngⅡ組 0．494±0．049 ab Val 3＋AngⅡ組 0．540±0．029 bc PD＋AngⅡ組 0．514±0．045 a SB＋AngⅡ組 0．649±0．026 c Val組 0．377±0．027 a

2．3 Val和PD98059對(duì)AngⅡ促進(jìn)VSMCs遷移的影響 VSMCs經(jīng)AngⅡ作用后，遷移活性明顯增加，AngⅡ作用于細(xì)胞24 h，VSMCs遷移活性是對(duì)照組的1．29倍（P＜0．01）；Val及PD98059抑制AngⅡ誘導(dǎo)大鼠VSMCs的遷移（P＜0．05），但SB23015作用與之相反（P＜0．05）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，Val單獨(dú)作用于VSMCs時(shí)，對(duì)細(xì)胞遷移的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表2。

表2 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的VSMCs 遷移距離（±s，n＝3）

表2 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的VSMCs 遷移距離（±s，n＝3）

a：P＜0．01，與AngⅡ組比較；b：P＜0．05，與AngⅡ組比較；c：P＜0．05，與Val 1＋AngⅡ組比較。

組別 24 h細(xì)胞遷移距離（μm）對(duì)照組 168．0±8．5 a AngⅡ組 217．7±12．5 Val 1＋AngⅡ組 173．0±11．5 a Val 2＋AngⅡ組 185．7±9．5 a Val 3＋AngⅡ組 195．3±11．4 bc PD＋AngⅡ組 189．0±10．4 b SB＋AngⅡ組 241．7±13．4 b Val組 162．0±12．0 a

2．4 Val、PD98059、SB23015對(duì)AngⅡ促進(jìn)VSMCs胞內(nèi)p-ERK1／2、p-P38表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，AngⅡ能促進(jìn)VSMCs胞內(nèi)p-ERK1／2、p-P38的表達(dá)，Val能抑制AngⅡ的促VSMCs胞 內(nèi)p-ERK1／2、p-P38表 達(dá) 的 作 用（P＜0．01）；PD98059能抑制AngⅡ的促VSMCs胞內(nèi)p-ERK1／2表達(dá)的作用（P＜0．01）；但對(duì)AngⅡ促進(jìn)VSMCs胞內(nèi)p-P38的表達(dá)的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；SB23015能促進(jìn)AngⅡ的促VSMCs胞內(nèi)p-ERK1／2表達(dá)的作用（P＜0．05）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，Val單獨(dú)作用于VSMCs時(shí)，對(duì)胞內(nèi)p-ERK1／2、p-P38表達(dá)的影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見(jiàn)表3、圖1。

表3 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的p-ERK1／2、 p-P38的表達(dá)（±s，n＝3）

表3 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的p-ERK1／2、 p-P38的表達(dá)（±s，n＝3）

組別灰度值p-ERK1／2 p -P38對(duì)照組 1．00±0．00a 1．00±0．00 a

續(xù)表3 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的p-ERK1／2、 p-P38的表達(dá)（±s，n＝3）

續(xù)表3 Val、PD98059和SE23015干預(yù)后的p-ERK1／2、 p-P38的表達(dá)（±s，n＝3）

a：P＜0．01，與AngⅡ組比較；b：P＜0．05，與Val 1＋AngⅡ組比較；c：P＜0．05，與AngⅡ組比較；d：P＜0．01，與Val 1＋AngⅡ組比較。

組別灰度值p-ERK1／2 p-P38 AngⅡ組2．11±0．09 2．84±0．13 Val 1＋AngⅡ組 1．32±0．07 a 1．46±0．13 a Val 2＋AngⅡ組 1．38±0．06 a 1．63±0．11 a Val 3＋AngⅡ組 1．45±0．06 ab 1．80±0．07 ad PD＋AngⅡ組 1．40±0．07a 2．81±0．12 SB＋AngⅡ組 2．27±0．12 c 1．96±．11 a Val組 1．02±0．08 a 1．06±0．11 a

圖1 不同干預(yù)組作用后ERK1／2、P38蛋白印跡條帶

3 討 論

AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的重要產(chǎn)物，AT1R、AT2R是AngⅡ的2個(gè)特異性受體，在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖方面顯示出相反的效果［4-9］。研究發(fā)現(xiàn)，AT1R的激活增加了再狹窄過(guò)程中的各種損傷反應(yīng)［10-13］。AngⅡ拮抗劑Val在預(yù)防支架術(shù)后再狹窄方面是可行的。2007年，Iwata等［6］進(jìn)行了Val與氯沙坦預(yù)防支架術(shù)后再狹窄的比較研究，發(fā)現(xiàn)支架術(shù)后治療6個(gè)月，生理劑量的Val可明顯降低支架血管的再血管化率，且Val組冠狀動(dòng)脈造影顯示的靶血管管腔縮小的程度明顯低于氯沙坦組。2005年，Peters等［7］進(jìn)行的臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)支架術(shù)后治療6個(gè)月，Val組的再狹窄率低于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑組（P＜0．05）。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT分析法評(píng)估了VSMCs的增殖狀況，在AngⅡ（10-6mol／L）的刺激下，Val（10-5～10-3mol／L）呈濃度依賴性抑制VSMCs的增殖，與AngⅡ組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而Val單獨(dú)作用于VSMCs時(shí)，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），表明Val能明顯拮抗AngⅡ的促增殖作用。另外，作者發(fā)現(xiàn)AngⅡ（10-6mol／L）能明顯刺激VSMCs的遷移，這一作用被Val（10-5～10-3mol／L）呈劑量依賴性地抑制，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而Val單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)VSMCs的遷移無(wú)明顯影響，表明Val能明顯拮抗AngⅡ的促遷移作用。

AngⅡ激活A(yù)T1R后促進(jìn)VSMCs的增殖、遷移與細(xì)胞外信號(hào)通路ERK1／2 MAPK的表達(dá)上調(diào)有關(guān)［8］。目前關(guān)于Val對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的增殖與遷移的影響以及與p-ERK1／2、p-P38 MAPK表達(dá)關(guān)系的研究并不多。在本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT分析法和劃痕試驗(yàn)評(píng)估了ERK1／2的特異性抑制劑PD98059（10-5mol／L）、P38特異性抑制劑SB23015（10-5mol／L）對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的增殖與遷移的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD98059能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs的增殖與遷移，而SB23015能顯著促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs的增殖與遷移，提示AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移與磷酸化ERK1／2 MAPK表達(dá)上調(diào)有關(guān)，且磷酸化P38在此過(guò)程中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法評(píng)估了Val、PD98059及SB23015對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)磷酸化ERK1／2、P38 MAPK表達(dá)上調(diào)的影響。作者選擇30 min作為觀察時(shí)間，Val（10-5～10-3mol／L）和SB23015（10-5mol／L）明顯抑制了AngⅡ誘導(dǎo)的磷酸化P38 MAPK的表達(dá)，PD98059（10-5mol／L）則對(duì)此過(guò)程無(wú)明顯影響，說(shuō)明磷酸化ERK1／2 MAPK則對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的磷酸化P38 MAPK的表達(dá)無(wú)調(diào)節(jié)作用。這與Kintscher等［9］研究結(jié)果相一致。

綜上所述，Val預(yù)防支架術(shù)后再狹窄的機(jī)制可能與其抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs的增殖與遷移及ERK1／2 MAPK表達(dá)有關(guān)，而磷酸化P38 MAPK則對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的磷酸化ERK1／2 MAPK的表達(dá)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。這為今后臨床應(yīng)用Val預(yù)防支架植入術(shù)后再狹窄提供了依據(jù)。

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