銅綠假單胞菌對致病真菌的抑制作用＊

徐令清，汪 峰，侯紅艷，劉彩林，歐國平，孫明月，孫自鏞

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，武漢430030）

銅綠假單胞菌（PA）是一種無處不在的細菌，井水、河水、生牛奶、凍魚、未經處理的污水、人畜的糞便及醫(yī)院環(huán)境中都能分離到PA，能夠引起菌血癥、創(chuàng)傷后傷口感染、肺炎、腦膜炎、附睪炎、眼部感染、乳突炎等。但有報道稱，在感染PA的囊性纖維變性患者中，極少有真菌感染的發(fā)生，提示PA可能具有抗真菌的活性。

1 材料與方法

1.1 材料 2012年5月至2012年9月從本院住院部及門診患者送檢標本中共分離出不重復的PA 24株，經革蘭染色、氧化酶實驗、Vitek-2全自動微生物鑒定儀（法國梅里埃公司）或API 20NE（法國梅里埃公司）對菌株進行鑒定。大腸埃希菌（EC）ATCC23922、肺炎克雷伯菌（KP）ATCC700603及 PA ATCC25923為質控菌株。真菌質控菌株為白色念珠菌（CA）ATCC90028、熱帶念珠菌（CT）、光滑念珠菌（CG）、近平滑念珠菌（CP）、克柔念珠菌（CK）、葡萄牙念珠菌（MSB）各5株，均分離自臨床標本。由科瑪嘉平板及API-20CAUX酵母樣真菌鑒定試條（法國梅里埃公司）對臨床分離的真菌進行鑒定。

1.2 方法

1.2.1 紙片法 在沙堡羅培養(yǎng)基上涂布2個麥氏濁度的真菌菌液，然后貼上無菌濾紙片（直徑6mm），將PA制成0.5個麥氏濁度的菌懸液，吸取3μL均勻涂在濾紙片上，孵育48h后，觀察結果。

1.2.2 十字交叉劃線法 24株臨床PA菌株與3種質控菌株分別培養(yǎng)24h后用0.9%生理鹽水制成菌懸液，取30μL菌懸液至沙堡羅培養(yǎng)基上，用無菌棉簽沿任意直徑劃寬為1cm的劃痕，然后放至37℃培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。用無菌刀片移除沙堡羅培養(yǎng)基上的菌苔，取5cm的無菌濾紙浸滿三氯甲烷后放入一金屬小盒子中，將移除菌苔的沙堡羅培養(yǎng)基生長面朝向濾紙放好，三氯甲烷的蒸汽會殺滅殘余的細菌，30min后將平板暴露于生物安全柜中抽吸幾分鐘，讓三氯甲烷揮發(fā)掉。將上述真菌在沙堡羅培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后，制成1×106／mL菌懸液，棉簽醮取并沿著三氯甲烷處理過的菌痕作垂直相交劃線。將平板30℃孵育24h后，觀察結果。

24株PA中每一株都與6種念珠菌中的每一株進行測試。平板按照以下規(guī)則判讀，完全抑制真菌生長記作：＋；部分抑制真菌生長記作：±；不能抑制真菌生長記作：-。

1.2.3 LB液體培養(yǎng)基中共孵育實驗 無菌EP管中裝入1 mL LB液體培養(yǎng)基，分別將上述紙片法中的每一株PA和每一株真菌菌懸液各50μL加入EP管中，100r／min離心，30℃搖菌24h，取混懸液置顯微鏡下觀察。另取50μL真菌菌懸液放入1mL LB液體培養(yǎng)基中作對照。

1.2.4 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析菌體蛋白差異 將完全有抑制作用的6號與15號PA菌株及完全無抑制作用的1號與22號PA菌株作SDS-PAGE蛋白分析。在LB液體培養(yǎng)基中150r／min離心，35℃搖菌24 h，取沉淀及上清液分別煮沸10min后直接進行SDS-PAGE電泳，脫色后觀察結果。

2 結 果

2.1 紙片法結果 在24株PA與30株真菌的紙片法試驗中，24株PA菌株中6、15、16、17、18、19、20號菌株對6種真菌的30株菌株均出現了明顯的抑菌環(huán)，抑菌環(huán)直徑非常接近，3、9、23號菌株有抑菌環(huán)但不明顯，其余菌株及質控菌株均無抑菌環(huán)出現，見圖1。

圖1 紙片法實驗

2.2 十字交叉劃線實驗結果 部分 PA（6、15、16、17、18、19、20號菌株）出現明顯的抑制現象，部分PA菌株（3、9、23號菌株）有輕微抑制作用，其余菌株及質控菌株均未出現抑制現象，這與紙片法結果一致，見圖2。24株PA對各種真菌的抑制活性情況見表1。

2.3 LB液體培養(yǎng)基中共孵育試驗結果 有抑制作用的PA菌株（6、15號菌株）與真菌共培養(yǎng)時，發(fā)現真菌菌絲顯著減少，而無抑制作用的PA菌株（1、22號菌株）共培養(yǎng)后菌絲數量與真菌單獨培養(yǎng)相近，見圖3。

2.4 SDS-PAGE分析菌株蛋白差異 幾株PA的共同點是在35×103處均有一明顯條帶，但其他條帶存在明顯差異：無抑制作用的1、22號PA菌株只在35×103處有一明顯條帶，有明顯抑制效果的6、15號PA菌株在38、35、27、24×103處均有較清晰的條帶，即6、15號PA菌株要比1、22號PA菌株多出好幾個條帶，見圖4。

圖2 十字交叉劃線實驗

圖3 LB液體培養(yǎng)基中共孵育實驗（普通光學顯微鏡×400）

表1 PA菌株抗真菌活性

圖4 SDS-PAGE電泳圖

3 討 論

PA是廣泛存在于水、土壤、動物體內的一種條件致病菌，以往研究只關注PA作為致病菌在臨床上能引起一些感染性疾病，但在環(huán)境與個體中PA常會與周圍的其他微生物相互作用，抑制甚至殺死其他微生物。

已有資料表明，PA的二代產物，如植物毒素、黏液、抗真菌化合物的產生，對自然環(huán)境中的其他微生物有明顯的選擇作用。Hogan等［1］報道稱，PA能在CA菌絲上形成厚厚的生物被膜從而殺死CA，表明PA影響的是CA的菌絲形成，而不是孢子形成，因為他們的細胞壁存在差異；另外一些PA的毒力因子（如四型菌毛、磷脂酶C、吩嗪等）同樣也與殺死CA的菌絲有關。Kaleli等［2］報道PA對CA、CP、CK及CT的抑制率在使用血平板和沙堡羅培養(yǎng)基時差異無統(tǒng)計學意義。

另有一些研究表明，PA和CA在人體內相互作用。在囊胞性纖維癥中有超過80%的患者會伴有PA感染，而廣譜抗菌藥物和類固醇激素的使用也會導致煙曲霉和CA的感染。Hughes等［3］發(fā)現在感染PA的囊胞性纖維癥患者中只有10%CA皮膚試驗陽性，而未感染PA的囊胞性纖維癥患者中則有30%的陽性率，表明PA產生了一些抗真菌的物質防止念珠菌感染。另外也有報道稱，PA可以抑制隱球菌的生長［4-5］。而到目前為止，還沒有在囊泡性纖維癥患者體內分離出隱球菌的報道，隱球菌與PA都是常見的肺部致病菌，如果這二者不能同時定植，那么有可能是PA抑制了隱球菌生長，綠膿菌素和喹諾酮系統(tǒng)可能是預防囊泡性纖維癥患者肺部感染隱球菌的主要原因。

PA能產生多種細胞間因子如群體感應系統(tǒng)絲氨酸內酯、鼠李糖脂、氧化還原吩嗪、胰蛋白酶E、磷脂酶C、胞外多糖、胞藻酸鹽等。Hogan等［6］發(fā)現PA能產生一種絲氨酸內酯，是一種細胞間信號分子，能充分抑制CA菌絲形成。

Grillot等［7］通過PA與酵母菌純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)來調查PA與酵母菌間的相互作用，報道顯示所有被測試酵母菌在血平板和在與細菌的過濾液中共同培養(yǎng)時均受到抑制。Gupta等［8］報道有59%的念珠菌在燒傷時與細菌混合感染。然而，在有PA存在時，真菌的定植明顯受到抑制。這也表明PA能殺死或抑制致病性真菌的生長。Kerr等［9］報道PA臨床菌株的主要抗真菌活性是通過產生氧化還原色素、綠膿菌素等來抑制CA和煙曲霉的。綠膿菌素能降低人類上皮細胞中的環(huán)磷酸腺苷和三磷酸腺苷［10-14］。

本次研究發(fā)現，部分PA對真菌有顯著的抑制效果，部分PA有一定抑制作用，而另外一些則對真菌完全沒有抑制作用。如6號PA菌株出現了非常明顯的抑菌環(huán)（圖1），通過十字交叉劃線及共培養(yǎng)進一步發(fā)現，6號及15號PA菌株的抑制作用非常強，通過SDS-PAGE發(fā)現這兩株菌與1號及22號PA菌株的蛋白條帶比較差異明顯，比后者多出2～3個條帶（圖4），多出的條帶是否與其抑制真菌的活性存在相關性，有待進一步研究。

綜上所述，PA在體內和體外都具有強大的抗真菌活性，原因可能是他能產生綠膿菌素形成生物被膜，及產生多種細胞間因子如群體感應系統(tǒng)絲氨酸內酯、鼠李糖脂、氧化還原吩嗪、胰蛋白酶E、磷脂酶C等及分泌各種蛋白類物質抑制真菌菌絲從而抑制真菌生長。作者將進一步分離和純化這些物質，作進一步研究。

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