硝酸甘油的生物轉(zhuǎn)化和耐藥機制研究進展

荊程橋 綜述 彭輝 審校

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，新疆 烏魯木齊830011)

1 硝酸甘油的血流動力學(xué)效應(yīng)

硝酸甘油(nitroglycerin，GTN)是治療心絞痛、急性心肌梗死、慢性心力衰竭等心血管疾病的基礎(chǔ)藥物。GTN可以擴張外周靜脈容量血管，減少回心血量從而降低心室前負荷和心室壁張力，擴張動脈減少后負荷和心室射血阻力，最終減少心室心肌做功和耗氧;同時GTN擴張大中冠狀動脈及交通支增加心肌供血。這種增加心肌供氧和降低心肌耗氧作用對缺血狀態(tài)的心肌有非常重要的保護意義[1]。

2 硝酸甘油和一氧化氮/環(huán)磷酸鳥苷信號通路

目前一致認為硝酸甘油在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為一氧化氮(nitric oxide，NO)或類似的活性物質(zhì)(S-亞硝基硫醇)，從而激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase，sGC)，第二信使環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)產(chǎn)生增多，激活cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，cGK)，降低細胞內(nèi)鈣離子水平，最終引起血管平滑肌細胞舒張。同時體外實驗表明:與硝普鈉(直接產(chǎn)生NO)不同，GTN并不能單獨激活sGC，因此GTN是通過體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化為NO或類似的活性物質(zhì)發(fā)揮作用[2]。

3 硝酸甘油的生物轉(zhuǎn)化

目前認為GTN在體內(nèi)有著不同的代謝途徑。生物活化途徑:主要產(chǎn)生1，2-二硝酸甘油(1，2-glyceryl dinitrite，l，2-GDN)、亞硝酸鹽、NO 或類似的活性物質(zhì);降解途徑:代謝產(chǎn)物不能激活sGC，主要產(chǎn)生1，3-二硝酸甘油(1，3-glyceryl dinitrite，1，3-GDN)、硝酸鹽和少量亞硝酸鹽[2]。GTN的生物活化包括非酶途徑和酶途徑。

3.1 非酶途徑

在體外實驗中，N-乙酰半胱氨酸與GTN反應(yīng)可以激活sGC;高濃度的L-半胱氨酸和高濃度的GTN反應(yīng)亦能激活sGC。Kollau等[3]學(xué)者還發(fā)現(xiàn)抗壞血酸鹽也可以與GTN反應(yīng)產(chǎn)生NO(或者結(jié)構(gòu)類似的化合物)從而激活sGC，但是這個化學(xué)反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)是低的，而且cGMP的產(chǎn)生也是相對低的。因此這些非酶途徑對于體內(nèi)GTN的生物轉(zhuǎn)化可能是有限的。

3.2 酶途徑

目前研究已發(fā)現(xiàn)存在2種不同的酶途徑。高劑量GTN生物轉(zhuǎn)化，參與的酶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞色素P450系統(tǒng)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤氧化酶;低劑量(臨床治療劑量)GTN生物轉(zhuǎn)化，現(xiàn)在認為線粒體乙醛脫氫酶(mitochondrial aldehyde dehydrogenase，ALDH2)是關(guān)鍵酶[4]。下面詳細介紹ALDH2對GTN的生物轉(zhuǎn)化作用。

3.3 線粒體乙醛脫氫酶

在2002年，Chen、Stamler等在小鼠RAW264.7巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)了一種蛋白可以催化GTN產(chǎn)生1，2-GDN和亞硝酸鹽(1，3-GDN和硝酸鹽很少)，并證實是線粒體乙醛脫氫酶;在兔體外(主動脈)和體內(nèi)ALDH2特異性抑制劑實驗中發(fā)現(xiàn):GTN產(chǎn)生的1，2-GDN、cGMP均明顯減少，GTN的擴血管和降壓作用減弱甚至消失，硝普鈉的擴血管和降壓作用未受影響[5]。在隨后的ALDH2基因敲除小鼠的實驗中有著同樣的發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，在ALDH2基因敲除小鼠，主動脈GTN產(chǎn)生的1，2-GDN、cGMP很少，GTN的擴血管和降壓作用幾乎消失;同樣的硝普鈉對兩種小鼠的擴血管和降壓作用并沒有差別，而且，高劑量的GTN對ALDH2基因敲除小鼠的擴血管和降壓作用變化不大[6]。這些研究說明:ALDH2在(臨床治療劑量)GTN轉(zhuǎn)化為NO過程中發(fā)揮重要作用，同時并不影響 NO和下游信號通路。

人類ALDH2基因第12外顯子存在一個堿基突變(rs671)導(dǎo)致487位置的谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?，突變純合子型酶活性大約是正常的5%，突變雜合子型酶活性大約是正常的40%。這種基因突變在東亞人群中高達40%。臨床研究發(fā)現(xiàn):在攜帶ALDH2突變型基因(純合子和雜合子)的人群組，GTN的擴血管、降壓效應(yīng)均顯著下降，需要更大劑量的GTN來維持有效的作用，給予正?；蛐偷娜巳航MALDH2抑制藥物戒酒硫(二硫化四乙基秋蘭姆)后，GTN的擴血管、降壓作用也減弱，但不影響硝普鈉的擴血管、降壓作用[7-8]。這些研究進一步說明，ALDH2在人體內(nèi)(臨床治療劑量)GTN轉(zhuǎn)化為NO過程中同樣具有關(guān)鍵的作用。

Wenzl等學(xué)者通過晶體學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)提出了三種不同的ALDH2與GTN反應(yīng)的分子機制。參與反應(yīng)的活性基團包括ALDH2活性中心的3個相鄰的半胱氨酸(Cys301、Cys302、Cys303)和空間上臨近Cys302的1個谷氨酸(Glu268)。共同的第一步反應(yīng)是Cys302與GTN的一個末端硝基(—NO2)反應(yīng)產(chǎn)生中間產(chǎn)物ALDH2-硝基硫醇復(fù)合物(ALDH2-SNO2)并釋放出1，2-GDN。(1)相鄰的一個半胱氨酸Cys301(或Cys303)與ALDH2-SNO2反應(yīng)釋放出亞硝酸鹽(通過線粒體氧化呼吸鏈和黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生NO)同時和Cys302形成一個二硫鍵(可以被二硫蘇糖醇還原)。(2)ALDH2-SNO2可逆性產(chǎn)生ALDH2-硫酰亞硝基復(fù)合物(ALDH2-SONO)，在Glu268和水分子共同作用下，ALDH2-SONO被水解產(chǎn)生次硝酸(HNO)，進一步可被超氧化物歧化酶(SOD)氧化為NO，同時在Cys302形成ALDH2-亞磺酸基團復(fù)合物(ALDH2-SOOH，不可以被二硫蘇糖醇還原)。(3)ALDH2-SONO均裂產(chǎn)生NO和ALDH2-亞硫酰自由基復(fù)合物(ALDH2-SO－，可以被二硫蘇糖醇還原)[9]。這些反應(yīng)的分子機制尚缺乏詳細的證據(jù)，需要進一步研究。

3.4 細胞液乙醛脫氫酶2和重組乙醛脫氫酶3A1

最近Berretta等[10]體外研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠主動脈平滑肌細胞，GTN的生物轉(zhuǎn)化主要是由細胞質(zhì)中的ALDH2催化完成而非線粒體ALDH2。Lin等[11]學(xué)者研究進一步發(fā)現(xiàn)，在體外實驗中，重組ALDH3A1(25%的氨基酸序列和ALDH2相同，活性中心含有243位置的半胱氨酸)也可以有效催化GTN產(chǎn)生NO。這些發(fā)現(xiàn)引起了關(guān)于GTN生物轉(zhuǎn)化新的爭論，對下一步研究有重要的意義。

4 硝酸甘油耐藥機制

4.1 神經(jīng)激素激活和血容量擴張學(xué)說

長期使用GTN可以反射性激活交感神經(jīng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system，RAS)和血管升壓素的分泌。血漿內(nèi)兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、血管加壓素水平上升增強了血管收縮，醛固酮和血管升壓素引起體內(nèi)水鈉潴留，增加了血容量，從而對抗GTN的擴張血管和減少回心血量作用。但是神經(jīng)激素激活和血容量增加的時間和耐藥發(fā)生的時間并不完全一致，β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、利尿劑并不總是改善GTN耐藥，而且離體血管也可以出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，因此這個學(xué)說并不能完全解釋GTN耐藥現(xiàn)象[4]。

4.2 氧化應(yīng)激學(xué)說

在1995年Munzel等[12]學(xué)者提出一個新的 GTN耐藥機制:GTN誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激可能是重要的耐藥原因。他們發(fā)現(xiàn)，耐藥兔主動脈的過氧化物水平顯著高于對照組;Cu，Zn超氧化物歧化酶(可增加細胞內(nèi)超氧化物歧化酶水平)可以顯著改善GTN對離體耐藥兔主動脈的擴張作用。Schulz等[13]學(xué)者亦發(fā)現(xiàn)在耐藥人乳房內(nèi)動脈(來自冠狀動脈搭橋手術(shù)患者)，整個血管壁活性氧(reactive oxgen species，ROS)類物質(zhì)同樣大幅度增加。后來的研究發(fā)現(xiàn)許多抗氧化性藥物可以部分甚至完全逆轉(zhuǎn)GTN耐藥，從側(cè)面支持氧化應(yīng)激學(xué)說。關(guān)于ROS的來源，早期認為可能是血管緊張素Ⅱ激活了細胞質(zhì)中蛋白激酶C/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系統(tǒng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，GTN可以誘導(dǎo)線粒體ROS的產(chǎn)生。Sydow等[14-16]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，耐藥大鼠的心肌、主動脈線粒體ROS均明顯高于對照組，GTN可以誘導(dǎo)離體正常大鼠心肌線粒體ROS依賴濃度的增加。線粒體ROS的產(chǎn)生，可能與GTN在線粒體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化有關(guān)，但確切的機制有待進一步研究。在錳超氧化物歧化酶基因部分敲除小鼠(一種理想的線粒體氧化應(yīng)激動物模型)實驗中，低劑量 GTN(12.5 μg·min-1·kg-1，4 d)即可導(dǎo)致基因部分敲除小鼠耐藥，而野生型小鼠未發(fā)生耐藥。體外高劑量(200 μmol/L，30 min)GTN誘導(dǎo)兩種小鼠主動脈，基因部分敲除小鼠主動脈出現(xiàn)更嚴重的耐藥現(xiàn)象[17-18]]。研究還發(fā)現(xiàn)特異性線粒體抗氧化劑可以完全逆轉(zhuǎn)GTN引起的小鼠內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激和主動脈耐藥[19]，這些研究進一步證實了氧化應(yīng)激學(xué)說。

最近研究發(fā)現(xiàn):線粒體內(nèi)的ROS可以滲入細胞質(zhì)激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，進一步導(dǎo)致細胞液ROS的生成。因此GTN引起血管壁產(chǎn)生一個復(fù)雜的氧化應(yīng)激循環(huán)網(wǎng)絡(luò)[20]。

4.2.1 氧化應(yīng)激對ALDH2的作用

許多研究發(fā)現(xiàn)耐藥大鼠主動脈和心肌ROS增加的同時ALDH2活性降低，體外GTN誘導(dǎo)正常大鼠心肌線粒體，ALDH2 活性和 ROS 的產(chǎn)生呈負相關(guān)[14-15，21]。體外線粒體復(fù)合體Ⅲ抑制劑抗霉素A(可導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激)誘導(dǎo)正常大鼠心肌線粒體，ALDH2活性下降50%[22]。體外過氧亞硝酸鹽誘導(dǎo)正常大鼠心肌線粒體，ALDH2活性依賴濃度的下降[19]。體外GTN誘導(dǎo)人大隱靜脈(來自行冠狀動脈搭橋術(shù)患者)，ALDH總活性顯著下降，抗氧化劑二硫蘇糖醇(DTT)可恢復(fù)ALDH的活性[23]。這些體內(nèi)和體外研究表明:氧化應(yīng)激導(dǎo)致了ALDH2的活性降低，減少了GTN生物轉(zhuǎn)化。目前認為氧化活性物質(zhì)可以氧化修飾ALDH2活性中心302位的半胱氨酸，形成一個二硫鍵，從而導(dǎo)致ALDH2功能障礙。

4.2.2 氧化應(yīng)激對NO的作用

ROS可以和NO快速反應(yīng)產(chǎn)生一種氧化性更強的活性物質(zhì)——過氧亞硝酸鹽。NO的直接減少影響NO/cGMP信號通路的激活。研究發(fā)現(xiàn):耐藥大鼠主動脈硝基化酪氨酸蛋白水平(過量過氧亞硝酸鹽的標(biāo)志物)上升，體外GTN誘導(dǎo)正常大鼠主動脈出現(xiàn)3-硝基化酪氨酸水平依賴濃度的增加[22]，肼屈嗪(強效的過氧亞硝酸鹽清除劑)可以有效改善大鼠耐藥[24]，這些研究均證實這個觀點，而且說明過氧亞硝酸鹽也是血管壁氧化應(yīng)激重要成分。

4.2.3 氧化應(yīng)激對sGC的作用

Weber等[25]研究發(fā)現(xiàn)過氧亞硝酸鹽可能通過氧化修飾sGC中的的巰基(NO激活途徑的必須基團)從而抑制NO對大鼠主動脈sGC激活，減少cGMP的產(chǎn)生，減弱GTN對主動脈的擴張作用。

4.2.4 氧化應(yīng)激對血管內(nèi)皮功能的影響

四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的重要輔因子，研究發(fā)現(xiàn)ROS和過氧亞硝酸鹽可以將BH4氧化為二氫生物蝶呤(dihydrobiopterin，BH2)，引起eNOS解偶聯(lián)，解偶聯(lián)的eNOS不能催化NO的產(chǎn)生，反而催化產(chǎn)生更多ROS。研究還發(fā)現(xiàn)過氧亞硝酸鹽通過硝基化作用導(dǎo)致前列環(huán)素合酶失活，降低血管前列環(huán)素水平[22]，因此內(nèi)源性舒血管物質(zhì)NO和前列環(huán)素合成抑制(內(nèi)皮功能障礙)也是GTN耐藥的重要機制。

4.3 其他的耐藥機制

4.3.1 磷酸二酯酶1A1活性和表達增加

磷酸二酯酶 1A1(phosphodiesterase1A1，PDE1A1)是血管平滑肌細胞磷酸二酯酶的一種亞型，可以特異性水解cGMP。Kim等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):在耐藥大鼠主動脈，PDE1A1活性和表達顯著增加，PDE1A1mRNA水平亦顯著增加，同時長春西汀(選擇性PDE1A1抑制劑)可以有效改善耐藥大鼠主動脈對GTN的舒張反應(yīng)和cGMP的增加。該研究表明:持續(xù)使用GTN可以增加血管平滑肌細胞PDE1A1活性和表達，cGMP水解加劇，導(dǎo)致GTN的血管擴張作用減弱[26]。但是PDE1A1活性和表達增加的機制仍不清楚，需要進一步的研究。

4.3.2 sGC對NO敏感性下降

最近Sayed等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在給予巰基亞硝基化半胱氨酸的大鼠和耐藥的大鼠均發(fā)現(xiàn)，巰基亞硝基化sGC水平顯著上升和sGC對NO供體藥物亞硝基鐵氫化鈉的敏感性喪失(cGMP生成明顯減少)即亞硝基鐵氫化鈉耐藥;體外GTN誘導(dǎo)正常大鼠主動脈平滑肌細胞，巰基亞硝基化sGC依賴濃度的增加和sGC對亞硝基鐵氫化鈉的敏感性依賴濃度的下降[27]。過往的許多研究均證明GTN可以導(dǎo)致巰基亞硝基化半胱氨酸產(chǎn)生，這些研究表明持續(xù)使用GTN引起sGC的巰基亞硝基化，導(dǎo)致sGC對NO的敏感性下降，第二信使cGMP產(chǎn)生減少，GTN的擴張血管作用隨之減弱。

4.3.3 eNOS解偶聯(lián)

研究發(fā)現(xiàn)eNOS蛋白結(jié)構(gòu)中1 177位絲氨酸(Ser 1177)、495位蘇氨酸(Thr495)磷酸化水平和半胱氨酸巰基谷胱甘肽化水平與 eNOS的活性密切相關(guān)[16]。最近Knorr等[16]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在耐藥大鼠主動脈，eNOS發(fā)生解耦聯(lián)的同時，Ser 1177磷酸化降低，Thr495磷酸化升高，半胱氨酸巰基谷胱甘肽化升高(同樣出現(xiàn)在體外GTN誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細胞)，以及GTP環(huán)化水解酶1(重要的BH4合成酶)表達下降，而且替米沙坦(血管緊張素Ⅰ受體拮抗劑)可以逆轉(zhuǎn)這些異常改變，最終改善耐藥。這些研究表明，長期使用GTN可以改變eNOS化學(xué)結(jié)構(gòu)和降低GTP環(huán)化水解酶1表達(可能是激活RAS引起的化學(xué)修飾作用)，導(dǎo)致eNOS解耦聯(lián)，產(chǎn)生耐藥，這種化學(xué)修飾發(fā)生的具體機制尚不清楚，需進一步研究。

5 結(jié)語

近年來關(guān)于GTN的生物轉(zhuǎn)化和耐藥機制的研究取得了許多新的進展。但仍然存在許多疑問和爭論，有待進一步的研究探索。同時基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)許多藥物可以預(yù)防和改善GTN耐藥，初步的臨床試驗也證實了N-乙酰半胱氨酸、左旋蛋氨酸、肼屈嗪、卡托普利、卡維地洛、阿托伐他汀具有改善耐藥的作用[4，28-29]，這些研究對臨床上 GTN 耐藥的防治具有重要的意義，需要進一步的研究尋找針對臨床GTN耐藥的最佳藥物。

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