畢赤酵母工程菌表達豬β-干擾素

高智明，趙沁沁，張國華，閆達中，劉軍

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

畢赤酵母工程菌表達豬β-干擾素

高智明，趙沁沁，張國華，閆達中，劉軍*

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛，人工合成了豬β-干擾素（PoIFN-β）基因，構(gòu)建了重組載體pPICZA-PoIFN-β。重組載體經(jīng)SacI線性化后，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，對在含博萊霉素（Zeocin）平板上生長的轉(zhuǎn)化子進行鑒定，得到分泌表達豬β-干擾素的畢赤酵母基因工程菌株GS115/pPICZA-PoIFN-β。以1%甲醇誘導(dǎo)GS115/pPICZA-PoIFN-β表達。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析表明，工程菌株實現(xiàn)了豬β-干擾素的高效分泌表達，表達產(chǎn)物為相對分子質(zhì)量22ku和26ku的混合物，表達蛋白量約為80mg/L。

豬β-干擾素；分泌表達；畢赤酵母

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)是當(dāng)前最有效、最方便的外源蛋白表達系統(tǒng)之一[9-11]。畢赤酵母表達系統(tǒng)不存在原核表達系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以去除的問題，也不存在哺乳細胞表達系統(tǒng)的病毒和支原體污染等問題，并對表達的外源蛋白還可進行翻譯后修飾加工，如蛋白水解、二硫鍵的形成以及糖基化修飾[12-13]等。畢赤酵母中表達量較高的基因往往采用的都是畢赤酵母所偏愛的密碼子，在所有的61個密碼子中，有19～25個是酵母所偏愛的密碼子，高表達的基因幾乎毫無例外地使用這25個偏愛的密碼子[14-16]。鑒于此，依據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛人工合成豬β-干擾素基因，構(gòu)建胞外表達豬β-干擾素的畢赤酵母工程菌株，以期實現(xiàn)了豬β-干擾素高效分泌表達，為豬β-干擾素的進一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌表達載體pPICZaA和GS11菌株：美國Invitrogen公司。

1.1.2 酶和試劑

TaqDNA聚合酶、DNA連接酶以及限制性內(nèi)切酶、DNA Maker DL 2000、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒：日本TaKaRa公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準品、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物回收試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；博萊霉素（Zeocin）抗生素：美國Invitrogen公司；其他試劑均為國藥分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

圍繞全面“從嚴治黨”抓作風(fēng)，凝聚事業(yè)發(fā)展的正能量。抓班子帶隊伍。強化各級領(lǐng)導(dǎo)班子和隊伍建設(shè)；實施行政許可受理、審查、審批“三分離”制度，推行“一站式”服務(wù)，方便群眾辦事。抓廉政樹形象。加強執(zhí)紀監(jiān)督力度，扎實開展各類專項整治；積極探索建立廉政風(fēng)險防控機制。抓公開促法治。所有案件全過程都進行公示，自覺接受監(jiān)督；全面推進行刑銜接，涉刑案件全部移送公安機關(guān)，增強震懾力。

畢赤酵母誘導(dǎo)表達前培養(yǎng)基（buffered glycerol-complexmedium，BMGY）：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，Biotin 0.000 4g/L，0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）10%，無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）13.4g/L，1%（v/v）甘油。

畢赤酵母誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基（buffered methanol-complex medium，BMMY）：除以0.5%（v/v）甲醇代替甘油，其余成分與BMGY相同。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，1mol/L山梨醇，酵母提取物10g/L，1.5%瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R高速冷凍離心機、Electroporator 2510電轉(zhuǎn)化儀：德國艾本德公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；T-Gradient梯度PCR儀：德國Biometra公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；G：BOXF3凝膠成像系統(tǒng)：英國Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 pPICZA-IFN-β載體的構(gòu)建

依據(jù)畢赤酵母特有的密碼子偏愛設(shè)計，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成豬β-干擾素基因。通過XhoI和Xba I酶切位點將豬β-干擾素基因插入到pPICZaA質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pPICZA-PoIFN-β。

1.3.2 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及篩選鑒定

按Invitrogen公司操作手冊制備畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115感受態(tài)細胞，將80～100μL感受態(tài)細胞和經(jīng)Sac I單酶切線性化的高濃度重組質(zhì)粒pPICZA-PoIFN-β 5～10μg混勻轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm間距電擊杯，冰浴5min。用Eppendorf電轉(zhuǎn)儀在1 500V電壓條件下電擊轉(zhuǎn)化，快速加入800μL冰冷的0.1mol/L山梨醇，涂于含100μg/mL Zeocin的YPD平板上，28℃培養(yǎng)3d。

挑取單菌落至酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液體培養(yǎng)基試管中，28℃、220r/min條件下培養(yǎng)過夜，離心收集菌體用試劑盒提取基因組，PCR鑒定，篩選出整合有目的基因的重組子。

1.3.3 畢赤酵母重組子的搖瓶誘導(dǎo)表達

將鑒定的重組子單菌落接種于裝有25mL BMGY的250mL三角瓶中，28℃、220r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm為1.0～1.4，3 000r/min離心5min收集菌體，用25mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，28℃、220r/min條件下培養(yǎng)培養(yǎng)，每24h補加無水甲醇至終體積分數(shù)為1%，72h后取樣進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

2 結(jié)果

2.1 表達載體構(gòu)建

依據(jù)畢赤酵母特有的密碼子偏愛設(shè)計PoIFN-β基因，在合成的基因的5′端和3′端分別加Xho I酶切位點和Xba I酶切位點，用下劃線標(biāo)注。

將優(yōu)化的PoIFN-β基因和pPICZa-A質(zhì)粒用Xho I和Xba I雙酶切后，膠回收連接，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pPICZA-PoIFN-β如圖1所示。

2.2 酵母陽性重組子的PCR鑒定

重組質(zhì)粒pPICZA-PoIFN-β經(jīng)Sac I酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化到赤酵母GS115。以PoIFN-β基因上游和下游引物對在含100μg/mL Zeocin的YPDS平板上得到的轉(zhuǎn)化子提取的基因組和對照pPICZA-PoIFN-β質(zhì)粒為模板PCR鑒定，凝膠電泳分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，pPICZAPoIFN-β質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化子基因組均在500bp處擴增出一條特異條帶，與理論大小相符。擴增產(chǎn)物測序表明PoIFN-β基因整合到酵母基因組中，工程菌GS115/pPICZA-PoIFN-β構(gòu)建成功。

2.3 SDS-PAGE檢測PoIFN-β表達

重組酵母誘導(dǎo)72h后，離心，取上清電泳。SDS-PAGE結(jié)果表明，工程菌表達產(chǎn)生了相對分子質(zhì)量約22ku和26ku的產(chǎn)物，陰性對照菌株此處無條帶如圖3所示，這表明畢赤酵母成功表達PoIFN-β基因。采用薄層掃描儀，檢測表達產(chǎn)物電泳結(jié)果，測定分泌表達的PoIFN-β蛋白量約為80mg/L。

圖1 畢赤酵母重組表達載體pPICZA-PoIFN-βFig.1 Recombinant expression vector of yeastPichia pastoris

圖2 PCR鑒定畢赤酵母轉(zhuǎn)化子Fig.2 PCR identification ofP.pastoristransformant

圖3 SDS-PAGE分析PoIFN-β在畢赤酵母中的表達Fig.3 SDS-PAGE analysis of PoIFN-βexpressed in recombinant yeast

3 結(jié)論

本實驗選用分泌型表達載體pPICZaA在畢赤酵母中表達PoIFN-β，得到了能較高表達PoIFN-β工程菌株，但表達的豬IFN-β蛋白分子質(zhì)量比預(yù)期片段（19ku）稍大，可能是因為PoIFN-β多肽中含有幾個糖基結(jié)合位點，發(fā)生了一定程度的糖基化，致使PoIFN-β蛋白分子質(zhì)量偏大。

由于畢赤酵母有自身的氨基酸密碼子偏愛性，同義密碼子的表達能力不同，對非自身的基因表達時，稀有密碼子更有可能限制外源基因的表達。本研究設(shè)計時，充分利用了優(yōu)勢密碼子的使用，以便適應(yīng)轉(zhuǎn)運核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）的同工受體及宿主的反義密碼子搖擺位置處被修飾的核苷酸的豐度，同時也有利于翻譯的二級結(jié)構(gòu)的形成。工程菌GS115/pPICZA-PoIFN-β分泌表達PoIFN-β蛋白量約為80mg/L，這與未經(jīng)密碼子優(yōu)化的文獻報道的相當(dāng)，究其原因，除密碼子偏愛外，外源基因整合的拷貝數(shù)，RNA二級結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，發(fā)酵條件等都對畢赤酵母表達外源蛋白水平有影響。

[1]曹瑞兵，包晶晶，周海霞，等.豬β-干擾素的原核表達及其對豬流行性腹瀉病毒制作用研究[J].中國病毒學(xué)，2004，19（3）：364-368.

[2]KALLIOLIAS G D,IVASHKIV L B.Overview of the biology of type I interferons[J].Arthritis Res Ther,2010,12(S1):1-9.

[3]SANG Y,ROWLAND R R R,HESSE R A,et al.Differential expression and activity of the porcine type I interferon family[J].Physiol Genomics, 2010,42(2):248-258.

[4]王艷曉，羅滿林.豬干擾素在臨床生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2011，36（6）：16-18.

[5]徐蕙，劉德輝，郭霄峰.豬β-干擾素的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，36（12）：120-122.

[6]PATEL D,NAN Y C,SHEN M Y,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virusinhibits type I Interferon signaling by blocking STAT1/STAT2 nuclear translocation[J].J Virol,2010,21(84):11045-11055.

[7]ARTURSSON K,GOBL A,LINDERSSON M,et al.Molecular cloning of a gene encoding porcine interferon-β[J].J Interferon Res,1992,12 (3):153-160.

[8]夏春，劉津，楊淇，等.豬β-干擾素基因的分子克隆及測序[J].中國獸醫(yī)雜志，2000，26（6）：6-7.

[9]陸永超，蔣琳.畢赤酵母高效表達策略概述[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進展，2013，41（1）：70-76.

[10]廖錫豪，陳明祥，謝萬勇，等.低溫誘導(dǎo)對畢赤酵母表達重組外源蛋白的影響[J].中國釀造，2013，32（2）：9-12.

[11]CEREGHINO J L,CREGG J M.Heterologous protein expression in the methylotrophicyeastPichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev,2000,24 (1):45-46.

[12]齊連權(quán)，陳薇，來大志，等.畢赤酵母表達系統(tǒng)研究進展[J].中國生物工程，2002，22（6）：45-47.

[13]PFEFFER J,RICHTER S,NIEVELER J,et al.High yield expression of lipase A fromCandida antarcticain the methylotrophic yeastPichia pastorisand its purification and characterization[J].Appl Microbiol Biot, 2006,72(5):931-938.

[14]張唔魁，范清林，宋禮華.畢赤酵母表達系統(tǒng)在外源基因表達中的研究進展及應(yīng)用[J].中國生物工程，2006，26（1）：87-91.

[15]HOEKEMA A,KASTELEIN R A,VASSER M,et al.Codon replacement in thePGKl gene ofSaccharomyces cerevisiae:experimental approach to study the role of biased codon usage in gene expression[J]. Mol Cell Biol,1987,7(8):2914-2924.

[16]覃曉琳，劉朝奇，鄭蘭英.信號肽對酵母外源蛋白質(zhì)分泌效率的影響[J].生物技術(shù)，2010，20（3）：95-98.

Secreting expression of porcine interferon-βin genetically engineeredPichia pastoris

GAO Zhiming,ZHAO Qinqin,ZHANG Guohua,YAN Dazhong,LIU Jun*
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

According toPichia pastorispreference of codon usage,the porcine interferon-βgene was synthesized and recombinant vector pPICZAPoIFN-βwas constructed.The recombinant plasmid was linearized withSacI and transformed intoP.pastorisGS115 by electroporation.The engineered strainP.pastoriGS115/pPICZA-PoIFN-βwas identified on zeocin resistant plate.1%methanol was used to induce the expression of GS115/pPICZA-PoIFN-β.SDS-PAGE indicated that the engineered strain efficiently secreted porcine IFN-β,with two molecular weight products of 22 ku and 26 ku,and the expression porcine IFN-βproteins were about 80 mg/L.

porcine interferon-β;secretion expression;Pichia pastoris

Q78

A

0254-5071（2014）04-0044-03

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.011

2014-02-11

湖北省自然科學(xué)基金（2008CDB067）

高智明（1988-），男，碩士研究生，研究方向為微生物生物技術(shù)。*

劉軍（1967-），男，副教授，博士，研究方向為酶與生物催化。