含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對未成熟心肌細胞凋亡的影響*

孟保英，張青，潘曉蘭，王元祥，沈定榮，提運幸，馬超，彭樂

含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對未成熟心肌細胞凋亡的影響*

孟保英，張青，潘曉蘭，王元祥，沈定榮，提運幸，馬超，彭樂

目的：探討含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對未成熟心肌細胞凋亡及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達的影響。

先天性心臟病；烏司他??；自體冷血停搏液；凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1011.)

心內直視手術中主動脈阻斷后，心肌保護效果關系到術中及術后心功能的恢復，故在缺血期間加強心肌細胞保護，減輕再灌注損傷尤為重要，因此尋求與未成熟心肌生理功能相適應的保護措施，是國內外心臟外科關注的焦點。近年來，我中心開展嬰幼兒心內直視手術應用自體冷血停搏液保護未成熟心肌的研究，已證實自體冷血停搏液對未成熟心肌保護優(yōu)于冷血停博液和晶體停搏液，但是仍然發(fā)現(xiàn)存在不同程度的心肌損傷，我們在此基礎上進一步探索，開展嬰兒心內直視手術應用含烏司他丁自體冷血心臟停搏液，以期減輕心肌缺血－再灌注損傷。

1 資料與方法

選取2011-10至2012-08在我院收治的行體外循環(huán)室間隔缺損修補術患兒60例，其中男32例，女28例，年齡3～12月，平均年齡（3.5±0.4）個月，體重4.1～10.5 kg，平均體重（5.3±0.3）kg。隨機分為含烏司他丁自體冷血心臟停搏液組（實驗組）30例，男17例，女13例，及自體冷血心臟停搏液組（對照組） 30例，男15例，女15例。術前將所有患兒按照標準進行心功能分級[1]，均為心功能Ⅱ級，術前無肝腎功能異常、肺炎等合并癥，末梢血象正常。（本研究符合作者所在單位人體實驗倫理委員會所制定的倫理學標準，并取得患兒家屬的知情同意。）

心臟停搏液制備：經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過，并經(jīng)監(jiān)護人知情同意，實驗組：體外循環(huán)開始前，將烏司他丁（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產，純度為5000 U/kg）加入前期抽取制備的心臟停搏液中（晶體母液15 ml），經(jīng)主動脈根部按血液：晶體4∶1比例快速抽取血液，K+濃度20 mmol/L，抽血時間約30～50秒，保持動脈收縮壓≥40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），停搏液制備完畢后，經(jīng)主動脈插管補充血容量以維持循環(huán)穩(wěn)定，并將配制的心臟停博液浸入冰屑液中制成4℃冷停搏液備用。對照組：停跳液抽取及制備均與實驗組相同，但不含烏司他丁。

麻醉與灌注方法及標本采集：二組患兒均全身麻醉及氣管插管，采用JOSTRA人工心肺機，POLYSTAN膜式氧合器，全血預充，體外循環(huán)采用淺、中低溫（25～32）℃，紅細胞比積0.25～0.30。并行循環(huán)降溫，阻斷升主動脈，對照組經(jīng)主動脈根部灌注4℃自體冷血心臟停搏液，實驗組灌注含烏司他丁自體冷血心臟停搏液，首次劑量均為30 ml/kg，灌注壓力50 mmHg，間隔40 min灌注一次，體外循環(huán)結束時進行改良超濾。分別于術前、主動脈開放后10 min分別取手術患兒右心房組織。所有患兒體外循環(huán)時間（35～75）min，平均（53.3±3.2）min，主動脈阻斷（20～50）min，平均（32.5±5.2）min。手術由同一組醫(yī)生、麻醉師、體外循環(huán)師合作完成。

dUTP缺口末端標記法（TUNEL法）檢測心肌細胞凋亡：采用末端脫氧核糖核酸苷酸轉移酶介導的TUNEL法檢測細胞凋亡。按照福州邁新生物技術開發(fā)有限公司試劑盒說明書進行。石蠟切片脫蠟至水，蛋白激酶K消化，過氧化氫阻斷，PBS液沖洗，TUNEL反應液37℃ 60 min，DAB/ H2O2顯色（DAB為3,3二氨基聯(lián)苯胺），蘇木素復染，脫水、透明、封片。正常心肌細胞核呈藍色，而凋亡陽性心肌細胞核呈棕黃色。每個標本觀察4張切片，每張切片在光學顯微鏡400倍視野下分別隨機選擇5個工作區(qū)域，每個工作區(qū)域計數(shù)100個細胞，按公式計算：凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總觀察細胞數(shù)×100%。

心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達測定（免疫組化檢測）： 按照福州邁新生物技術開發(fā)有限公司試劑盒說明書進行。制備石蠟切片，石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟（2次）、無水乙醇（2次）、95%乙醇及85%乙醇使組織再水化，進行抗原修復（Bcl-2蛋白采用檸檬酸組織抗原修復，Bax蛋白采用EDTA法進行抗原修復，嚴格按照說明書操作）。過氧化氫消除內源性過氧化物酶，加非特異性染色阻斷劑，分別加一抗，4℃冰箱過夜，加酶標羊抗小鼠IgG聚合物，室溫下孵育15 min。DAB顯色，自來水沖洗后用蘇木素復染，再用梯度乙醇和二甲苯脫水透明，中性樹膠封片。陽性表達判斷為鏡下胞漿內有棕黃色顆粒者為陽性細胞，計數(shù)每個高倍鏡視野中100個細胞陽性細胞數(shù)，每張切片中采集5個視野，求出均值，得出陽性細胞百分率。應用GD-8型病理影像多媒體圖文操作系統(tǒng)進行圖像分析。

統(tǒng)計學分析： 使用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理。結果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用秩和檢驗及t檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1兩組患兒體外循環(huán)情況

兩組患兒的主動脈阻斷時間、體外循環(huán)時間、自動復跳率及心室顫動發(fā)生率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表1

表1 兩組患兒體外循環(huán)情況（n=30 ,

表1 兩組患兒體外循環(huán)情況（n=30 ,

注：對照組為自體冷血心臟停搏液組 實驗組為含烏司他丁自體冷血心臟停搏液組

2.2兩組患兒心肌細胞凋亡檢測結果

體外循環(huán)前5 min兩組心肌細胞凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。主動脈開放10 min兩組心肌細胞凋亡指數(shù)較體外循環(huán)前5 min明顯增加（P＜0.05），且實驗組心肌凋亡指數(shù)較對照組明顯降低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。表2

表2 兩組心肌細胞凋亡指數(shù)檢測結果（n=30 ,

表2 兩組心肌細胞凋亡指數(shù)檢測結果（n=30 ,

注：與對照組比較*P＜0.05；與本組體外循環(huán)前5 min比較△P＜0.05。余注見表1

時間 對照組 實驗組體外循環(huán)前5 min 6.98±0.51 7.22±0.56主動脈開放10 min 23.47±3.01△ 13.56±2.28*△

2.3兩組不同時點心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達比較

體外循環(huán)前5 min兩組心肌細胞結構完整, Bcl-2蛋白與Bax蛋白輕度表達，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。主動脈開放10 min兩組心肌Bcl-2蛋白與Bax蛋白明顯表達，較體外循環(huán)前5 min明顯增加，且實驗組心肌Bcl-2蛋白表達較對照組明顯增加，實驗組心肌Bax蛋白表達較對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達表現(xiàn)為細胞漿內有棕黃色著色。表3，圖1、2

表3 兩組不同時點Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達比較（n=30,%,

表3 兩組不同時點Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達比較（n=30,%,

注：與對照組比較*P＜0.05；與本組體外循環(huán)前5min比較△P＜0.05。余注見表1

對照組 實驗組Bcl-2蛋白表達體外循環(huán)前5 min 12.94±0.98 13.21±1.01主動脈開放10 min 40.17±3.54△ 68. 31±4.26*△Bax蛋白表達體外循環(huán)前5 min 8.93±0.91 8.25±0.88主動脈開放10 min 49.58±5.58△ 23.64±3.43*△

圖1 免疫組化分析兩組患兒右心房心肌細胞Bcl-2蛋白表達（×400）

圖2 免疫組化分析兩組患兒右心房心肌細胞Bax蛋白表達（×400）

2.4術后隨訪

兩組患兒術后均存活，術后隨訪1月～2年，隨訪率100%，心功能均為I級與術前心功能均為Ⅱ級比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

先天性心臟病是引起嬰幼兒死亡的主要疾病之一，近年來盡管心臟外科技術發(fā)展迅速，但手術患兒日趨低齡、復雜、危重，心肌保護的不夠完善仍是嬰幼兒心臟術后心功能不全及住院病死率較高的重要原因[2]。自體血停搏液是我中心首創(chuàng)，抽取的自體血未接觸體外循環(huán)管道，不含有活化的中性粒細胞、各種細胞因子、細胞毒素和氧自由基等，紅細胞未被破壞，產生內源性氧自由基清除劑，對消除氧自由基等有害物質有一定作用。近年來，我中心開展嬰幼兒心內直視手術應用冷自體血停搏液保護未成熟心肌的研究，已證實冷自體血停搏液對未成熟心肌保護優(yōu)于冷血停博液和晶體停搏液，但是仍然存在不同程度的心肌損傷[3，4]。而研究表明烏司他丁對于消除自由基、防止心臟直視手術中心肌再灌注損傷有明顯作用。故我中心采用烏司他丁及自體血配制停跳液，進行心內直視手術灌注停跳，以期減輕心肌缺血再灌注損傷及及心肌細胞凋亡。

烏司他丁是一種能夠抑制多種蛋白水解酶活力的糖蛋白，能夠同時抑制胰蛋白酶、NE、磷脂酶A2、透明蛋白酶等多種水解蛋白酶的活性；其代謝產物也具有很強的水解酶的抑制作用，可抑制炎癥級聯(lián)反應的多個環(huán)節(jié)，尤其可抑制黏附因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素-6、白細胞介素-8及氧自由基等的釋放，促進白細胞介素-10的釋放。趙亞玲等[5]綜述可能存在一種通過凋亡和炎癥介導的心肌再灌注損傷。體外循環(huán)心臟直視手術心肌損傷主要是缺血－再灌注損傷，大量研究表明，缺血缺氧不僅導致心肌細胞的壞死，亦誘導心肌細胞凋亡；而細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的病理特征之一，且與心肌缺血再灌注損傷后的心律失常密切相關，亦與心肌重構、心肌頓抑及心力衰竭等病理機理密切相關[6,7]。李琛等[8]研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者早期應用烏司他丁，通過降低血清白介素-6水平，升高白介素-10、超氧化物歧化酶水平，對缺血-再灌注心肌起到保護作用。陽世雄等研究發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)中應用研究表明烏司他丁對于降低炎性介質白細胞介素-6和白細胞介素-8有明顯作用，對于消除自由基、防止心臟直視手術中心肌再灌注損傷有明顯作用。烏司他丁可在一定程度上抑制心肌組織細胞粘附因子-1（ICAM-1）表達上調，減輕炎癥性反應，起到心肌保護作用[9-11]。楊明紅等[12]研究表明含烏司他丁晶體心臟停搏液能夠減輕心肌損傷，具有良好的心肌保護作用。綜上所述采用烏司他丁及自體血配制停跳液，進行心內直視手術灌注停跳，以期減輕心肌缺血再灌注損傷及心肌細胞凋亡。

細胞凋亡是由基因控制的主動性死亡過程，機體內存在多條細胞凋亡的信號途徑，其中“線粒體途徑”是最重要的途徑之一，Bcl-2家族蛋白是該途徑的關鍵調節(jié)因子[13]。Bcl-2和Bax蛋白是該族的兩個主要成員。Bcl-2蛋白主要定位于線粒體外膜，起抗凋亡的作用。而具有促凋亡作用的Bax蛋白則主要定位于細胞質，當細胞受到調亡因子的誘導便向線粒體轉位。Bcl-2和Bax兩者相互競爭，雙相調節(jié)細胞凋亡。當Bax表達占優(yōu)勢時促進細胞凋亡，而Bcl-2表達占優(yōu)勢時則阻止細胞凋亡，因此學者將Bcl-2和Bax稱為細胞的“死亡開關”[14,15]。

主動脈開放10 min兩組心肌細胞凋亡指數(shù)較體外循環(huán)前明顯增高，但烏司他丁自體血冷停搏液組心肌細胞凋亡指數(shù)較自體血冷停搏液組明顯減低。主動脈開放10 min兩組心肌Bcl-2及Bax蛋白表達較體外循環(huán)前5 min明顯增加，且烏司他丁自體血冷停搏液組心肌Bcl-2蛋白表達較自體血冷停搏液組明顯增加，自體血冷停搏液組心肌Bax蛋白表達較烏司他丁自體血冷停搏液組明顯增加（P＜0.05）。以上結果可能是由于烏司他丁可抑制炎癥級聯(lián)反應的多個環(huán)節(jié)，能夠消除自由基、減輕心臟直視手術中心肌再灌注損傷，使得心肌Bcl-2蛋白表達上調，下調Bax蛋白表達，可抑制體外循環(huán)心臟直視手術再灌注心肌細胞的凋亡，減輕心肌細胞損傷。故含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對未成熟心肌保護作用可能通過減輕心肌細胞缺血再灌注損傷及抑制心肌細胞凋亡，從而減輕體外循環(huán)未成熟心肌細胞損傷，利于未成熟心肌保護。

通過本研究我們認為含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對未成熟心肌保護效果明顯優(yōu)于自體冷血心臟停搏液，能夠減輕心肌細胞凋亡，減輕心肌損傷，利于術后心功能恢復，值得臨床推廣。

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Effect of Cold Self-blood Cardioplegia With Ulinastatin on Immature Myocardial Cell Apoptosis in Infant Patients

MENG Bao-ying, ZHANG Qing, PAN Xiao-lan, WANG Yuan-xiang, SHEN Ding-rong, TI Yun-xing, MA Chao, PENG Le.
Cardiovascular Center, Shenzhen Children’s Hospital, Shenzhen (518038), Guangdong, China

ZHANG Qing, Email:szzhangqing@126.com

Objective: To investigate the effect of cold self-blood cardioplegia with ulinastatin on immature myocardial cell apoptosis and protein expressions of Bcl-2, Bax in ventricular septal defect (VSD) infants.Methods: A total of 60 infants received VSD repairing operation with cardiopulmonary bypass (CPB) in our hospital were summarized. The patients were randomly divided into 2 groups: Test group, the infants received cold self-blood cardioplegia with ulinastatin when aortic cross-clamp was closed. Control group, the infants received cold self-blood cardioplegia when aortic cross-clamp was closed. n=30 in each group. The right atrium tissue was collected before CPB and 10 min after releasing aortic cross-clamp. The index of myocardial cell apoptosis was observed by TUNEL method, and the protein expressions of Bcl-2, Bax were examined by immunohistological method.Results: Both groups showed the higher index of myocardial cell apoptosis at 10 min after releasing aortic cross-clamp than 5 min before CPB, and the apoptosis index in Test group was lower than that in Control group, all P＜0.05. The protein expressions of Bcl-2 and Bax were obviously increased at 10 min after releasing aortic cross-clamp than 5 min before CPB in both groups. Compared with Control group, Test group presented the higher Bcl-2 protein expression and lower Bax protein expression, all P＜0.05.Conclusion: Cold self-blood cardioplegia with ulinastatin could protect immature myocardum from ischemia-reperfusion injury in VSD infants during CPB operation in clinical practice.

Congenital heart disease; Ulinastatin; Self-blood Cardioplegia; Apoptosis

2014-04-30）

（編輯: 王寶茹）

本項目為深圳市科技計劃資助項目（項目編號：201002115）

518038 廣東省，深圳市兒童醫(yī)院 心血管科

孟保英 主治醫(yī)師 碩士研究生 主要從事體外循環(huán)直視手術心肌保護方面的研究 Email:szmengbaoying@163.com 通訊作者：張青

Email:szzhangqing@126.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1011-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.013

方法：選取在我院收治的行體外循環(huán)室間隔缺損修補術患兒60例，隨機分成含烏司他丁冷血停搏液組（實驗組，n=30）和自體冷血停搏液組（對照組，n=30）。分別于術前、主動脈開放后10 min分別取手術患兒右心房組織，末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法觀察心肌細胞凋亡情況，免疫組化檢測Bcl-2及Bax蛋白表達。

結果：主動脈開放10 min兩組心肌細胞凋亡指數(shù)較體外循環(huán)前5 min明顯增加（P＜0.05），且實驗組心肌凋亡指數(shù)較對照組明顯降低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。主動脈開放10 min兩組心肌Bcl-2 蛋白與Bax蛋白明顯表達，較體外循環(huán)前5 min明顯增加，且實驗組心肌Bcl-2蛋白表達較對照組明顯增加，實驗組心肌Bax蛋白表達較對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

結論：含烏司他丁自體冷血停搏液對缺血再灌注心肌有保護作用，值得臨床廣泛推廣。