阿托伐他汀對穩(wěn)定性心絞痛患者血漿微小核糖核酸-143/145表達(dá)水平的影響

趙蓓，劉利峰，劉瑛琪，劉莉，趙京濤，周莉，夏會會，王守力

阿托伐他汀對穩(wěn)定性心絞痛患者血漿微小核糖核酸-143/145表達(dá)水平的影響

趙蓓，劉利峰，劉瑛琪，劉莉，趙京濤，周莉，夏會會，王守力

目的：探討阿托伐他汀對穩(wěn)定性心絞痛患者血漿微小核糖核酸（microRNA）-143/145表達(dá)水平的影響。

阿托伐他??；微小核糖核酸；穩(wěn)定性心絞痛

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:972.)

雖然藥物洗脫支架大大降低了冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后再狹窄的發(fā)生率，但由于接受支架治療的患者數(shù)量逐年遞增，實(shí)際上每年檢查出來的支架內(nèi)再狹窄患者例數(shù)依然呈上升的趨勢，支架內(nèi)再狹窄已經(jīng)成為影響冠心病患者遠(yuǎn)期預(yù)后的主要問題之一[1,2]。目前認(rèn)為，支架內(nèi)再狹窄的主要病理生理機(jī)制是，支架部位血管平滑肌細(xì)胞的過度增殖和遷移[3,4]。微小核糖核酸-143/145（microRNA-143/145)在血管平滑肌細(xì)胞增殖中有重要作用，與支架內(nèi)再狹窄的關(guān)系密切[5]。本研究探討阿托伐他汀對穩(wěn)定性心絞痛患者血漿microRNA-143/145表達(dá)水平的影響。

1 對象與方法

研究對象：入選2012-01至2012-12于我院門診就診的冠心病患者74例，男性51例（68.9%），女性23例, 年齡42～73歲，平均（53.6±16.8）歲。隨訪12～19個(gè)月，平均（14.8±4.3）個(gè)月。 入選標(biāo)準(zhǔn)：①首次診斷冠心病穩(wěn)定性心絞痛；②入組之前未服用過他汀類藥物；③年齡18～70歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤；②預(yù)期壽命＜1年；③結(jié)締組織病；④接受透析；⑤肝酶異常。所有入組患者在服用阿托伐他汀之前、服藥1個(gè)月以及服藥12個(gè)月時(shí)均檢測三大常規(guī)、肝腎功能、血脂、C反應(yīng)蛋白等。所有患者均簽署知情同意書。

方法：74例患者按納入順序賦予序號，由統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)分為兩組，低劑量組（n=36）, 阿托伐他汀20 mg，每日一次；中等劑量組(n=38), 阿托伐他汀40 mg，每日一次。觀察并比較兩組患者用藥前、用藥1個(gè)月及用藥12個(gè)月血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平和microRNA-143/145表達(dá)水平的變化。將74例患者按照不同時(shí)間點(diǎn)的LDL-C是否達(dá)標(biāo)進(jìn)行分組，即達(dá)標(biāo)組（LDL-C ＜ 2.60 mmol/L） 和不達(dá)標(biāo)組（LDL-C≥2.60 mmol/L）。

主要試劑與儀器：microRNA提取試劑盒miRNeasy RNA isolation kit 購自德國Qiagen公司，Taqman Universal Master Mix Ⅱ試劑盒和Taqman microRNA探針購自美國ABI公司；其他試劑如氯仿、無水酒精等均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑；反轉(zhuǎn)錄儀及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀均為美國ABI公司產(chǎn)品，NanoDrop 2 000c紫外分光光度計(jì)為美國Thermo公司產(chǎn)品。

檢測指標(biāo)：74例患者在服用阿托伐他汀之前、用藥1個(gè)月和12個(gè)月時(shí)留取血樣，抗凝管靜脈取血10 ml，4 h內(nèi)離心，離心條件：室溫，1 800 g，10 min，取上層血漿4 ml于-80℃凍存?zhèn)溆?。核糖核酸（RNA）分離及純化：血漿于冰上解凍后取200 μl用于提取總RNA。按miRNeasy RNA isolation kit說明書操作，收集RNA洗提液（大約12 μl），于-20℃凍存?zhèn)溆?。使用Taqman Universal Master Mix Ⅱ（ABI公司）試劑盒和Taqman microRNA（ABI公司）探針檢測microRNA的表達(dá)水平。以人類U6RNA作為內(nèi)參。

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：為研究microRNA-143/145表達(dá)水平與LDL-C的關(guān)系，依照參考文獻(xiàn)[6]，對各樣本中目的microRNA的Ct值進(jìn)行一定的轉(zhuǎn)換：定義每個(gè)樣品中所測microRNA的平均Ct值為Ct0，每個(gè)樣品中的每個(gè)microRNA的原始Ct減去Ct0得到Ct1，把所有樣品中所測的microRNA總的平均Ct值加回Ct1得到Ct2，Ct3＝50-Ct2，從而Ct3值越高說明該microRNA的表達(dá)水平越高。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Graghpad Prism 5作圖軟件作圖。連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；分類變量采用數(shù)值和百分比表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患者基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1

表1 兩組患者基線資料比較

表1 兩組患者基線資料比較

注：LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇 HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇 ACEI:血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑 ARB:血管緊張素受體拮抗劑 CCB: 鈣離子通道阻滯劑

低劑量組(n=36)中等劑量組(n=38) P值年齡 (歲) 52.8 ±15.4 54.4 ±17.3 0.6762男性[ 例 (%)] 26 (72.2) 25 (65.8) 0.5501體重指數(shù) (kg/m2) 25.8 ± 4.6 24.9 ± 3.9 0.3661糖尿病[例 (%)] 8 (22.2) 9 (23.7) 0.8812高血壓[例 (%)] 13 (36.1) 16 (42.1) 0.5975吸煙[例 (%)] 10 (27.8) 9 (23.7) 0.6870飲酒[例 (%)] 17 (47.2) 14 (36.8) 0.3657 LDL-C (mmol/L) 3.67±1.24 3.59±1.18 0.7769 HDL-C (mmol/L) 1.01 ± 0.24 1.00 ± 0.22 0.8522甘油三酯 (mmol/L) 1.78 ± 1.38 1.65 ± 1.21 0.7409空腹血糖 (mmol/L) 6.4 ± 2.1 6.6 ± 2.3 0.6977 ACEI[例 (%)] 6 (16.7) 7 (18.4) 0.8429 ARB[例 (%)] 5 (13.9) 5 (13.2) 0.9267 CCB[ 例 (%)] 7 (19.4) 10 (26.3) 0.4825 β受體阻滯劑 [ 例 (%)] 4 (11.1) 6 (15.8) 0.5563

兩組患者血漿micro-143/145表達(dá)水平（Ct3）、血漿LDL-C變化及比較：兩組患者用藥1個(gè)月時(shí)和12個(gè)月時(shí)血漿microRNA-143/145的水平均較用藥前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＜0.05）;兩組患者用藥12個(gè)月與用藥1個(gè)月時(shí)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中等劑量組在用藥1個(gè)月與用藥12個(gè)月時(shí)血漿microRNA-143/145表達(dá)高于低劑量組；兩組患者阿托伐他汀治療1個(gè)月和12月時(shí)血漿LDL-C水平較治療前均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；用藥12個(gè)月較1個(gè)月時(shí)血漿LDL-C水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表2

血漿LDL-C水平與microRNA-143/145的相關(guān)性分析：以microRNA-143為例，兩組患者各時(shí)間點(diǎn)上血漿LDL-C水平與microRNA-143/145無明顯相關(guān)性。圖1

表2 兩組患者用藥前后血漿micro-143/145表達(dá)水平（Ct3）、血漿LDL-C變化

表2 兩組患者用藥前后血漿micro-143/145表達(dá)水平（Ct3）、血漿LDL-C變化

注：與用藥前比較*P＜0.05；與低劑量組比較△P＜0.05。 microRNA：微小核糖核酸 LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

低劑量組 (n=36) 中等劑量組(n=38) microRNA 143用藥前 19.4±4.5 18.9±4.5用藥1個(gè)月 23.7±6.7* 27.9±7.4*△用藥12個(gè)月 24.1±6.9* 28.3±7.5*△microRNA 145用藥前 20.6±4.7 19.8±4.5用藥1個(gè)月 24.3±6.3* 28.6±7.1*△用藥12個(gè)月 24.9±6.7* 29.2±7.3*△LDL-C(mmol/L)用藥前 3.67±1.24 3.59±1.18用藥1個(gè)月 2.92±1.15* 2.37±0.96*用藥12個(gè)月 3.16±1.19* 2.64±1.05*

圖1 兩組患者不同時(shí)間點(diǎn)血漿LDL-C與microRNA-143水平的相關(guān)性分析

達(dá)標(biāo)組與未達(dá)標(biāo)組間的血漿microRNA-143/145表達(dá)水平的比較：達(dá)標(biāo)組與未達(dá)標(biāo)組microRNA-143/145的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表3

表3 達(dá)標(biāo)組與未達(dá)標(biāo)組間的血漿microRNA-143/145水平變化的比較

表3 達(dá)標(biāo)組與未達(dá)標(biāo)組間的血漿microRNA-143/145水平變化的比較

注：括號內(nèi)為各時(shí)間點(diǎn)LDL-C達(dá)標(biāo)或未達(dá)標(biāo)病例數(shù)。余注見表2

組別 microRNA-143 microRNA-145用藥1個(gè)月 用藥12個(gè)月 用藥1個(gè)月 用藥12個(gè)月達(dá)標(biāo)組 26.1±6.9 (51) 26.7±7.1 (43)26.3±6.9 (51) 27.5±7.4 (43)未達(dá)標(biāo)組 25.3±6.5 (23) 25.6±6.8 (31)27.0±7.2 (23) 26.6±7.1 (31)

3 討論

支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生，受多種因素影響，其主要的病理生理機(jī)制是平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，前期的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)microRNA在平滑肌細(xì)胞增殖和遷移過程中發(fā)揮重要作用，尤以microRNA-143/145最為重要。microRNA-143/145相對特異在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用[7]，敲除microRNA-143/145后，小鼠主動(dòng)脈和股動(dòng)脈血管壁平滑肌細(xì)胞發(fā)生明顯增殖[8]。在另外一項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)，隨著再狹窄的進(jìn)展，局部血管內(nèi)膜和中膜的microRNA-143/145的表達(dá)水平呈進(jìn)行性下降[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)microRNA-145有利于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定。近期的研究則認(rèn)為，循環(huán)microRNA-143/145的表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈病變的嚴(yán)重程度相關(guān)，病變越重其表達(dá)水平越低。事實(shí)上，目前逐步開展的臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大約有1/3的支架內(nèi)再狹窄并不是典型的平滑肌細(xì)胞過度增殖，而是支架內(nèi)發(fā)生了新的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[10]。前述研究提示microRNA-143/145可能在平滑肌細(xì)胞增殖和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中都發(fā)揮重要著用，因此提示我們microRNA-143/145很有可能是冠心病患者支架術(shù)后再狹窄的重要作用分子，有必要進(jìn)行深入的臨床研究。

他汀類藥物治療可以顯著減少冠心病患者的不良心血管事件的發(fā)生，包括減少冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后支架內(nèi)再狹窄[11-13]。在本研究中，我們較早報(bào)道了阿托伐他汀對血漿microRNA-143/145表達(dá)水平的影響，研究表明，不同劑量的阿托伐他汀均可以明顯上調(diào)血漿中microRNA-143/145的表達(dá)水平，而且，這個(gè)作用與阿托伐他汀降低LDL-C的作用并沒有明顯的相關(guān)性；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，血漿中microRNA-143/145的表達(dá)水平與LDL-C的水平也沒有相關(guān)性。

在本研究中，我們給予穩(wěn)定性心絞痛患者不同劑量的阿托伐他汀治療，證明了該藥可以提高患者血漿中microRNA-143/145的表達(dá)水平，而且中等劑量的作用更為明顯，但這個(gè)作用在用藥12個(gè)月隨訪時(shí)與1個(gè)月隨訪時(shí)比較，沒有明顯差異。雖然12個(gè)月時(shí)LDL-C由于多種原因有所反彈上升，但這并沒有影響microRNA-143/145的相對高表達(dá)，而且，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相關(guān)分析也表明，血漿microRNA-143/145水平與LDL-C的水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性，提示兩者之間可能沒有明顯的相互影響的作用。因此，我們認(rèn)為，阿托伐他汀使血漿microRNA-143/145水平上調(diào)的作用是獨(dú)立于其降脂作用，而這個(gè)作用可能有利于延緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展，尤其是可能有利于減少支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生與進(jìn)展，且較大劑量的阿托伐他汀可能作用更為明顯。關(guān)于阿托伐他汀使血漿microRNA-143/145水平升高的機(jī)制，結(jié)合本研究結(jié)果其他相關(guān)研究，我們認(rèn)為，首先，如前所述，這個(gè)作用與LDL-C水平的變化無關(guān)；其次，可能是阿托伐他汀的間接作用。曾有研究認(rèn)為阿托伐他汀可以抑制平滑肌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡[14,15]，這似乎與本研究結(jié)果矛盾。斑塊成分及局部炎癥對再狹窄的發(fā)生有很大影響[16]，而事實(shí)上阿托伐他汀除了降血脂，還有抗炎、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，可能正是通過這些作用間接影響到平滑肌細(xì)胞表達(dá)microRNA-143/145，將來的研究可以從細(xì)胞分子水平，進(jìn)一步探討阿托伐他汀對平滑肌細(xì)胞表達(dá)microRNA-143/145的影響，深入分析其中可能的相關(guān)分子機(jī)制。最新國內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以影響冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)患者CD4T淋巴細(xì)胞microRNA-21的表達(dá)[17]，后者在動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄過程中也起重要作用，相關(guān)研究值得進(jìn)一步深入。

本研究是觀察他汀類藥物對血漿microRNA表達(dá)水平影響的初步研究，選取穩(wěn)定性心絞痛患者，通過本研究，我們證實(shí)了阿托伐他汀可以影響冠心病病理生理過程中較為重要的microRNA的表達(dá)水平。以后的研究可以繼續(xù)擴(kuò)大對象范圍，觀察他汀藥物對急性冠脈綜合征患者某些microRNA表達(dá)水平的影響，并觀察某些microRNA對療效以及患者預(yù)后的影響或預(yù)測作用。

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Effect of Atorvastatin on Plasma MicroRNA-143/145 Expression in Patients With Stable Angina Pectoris

ZHAO Bei, LIU Li-feng, LIU Ying-qi, LIU Li, ZHAO Jing-tao, ZHOU Li, XIA Hui-hui, WANG Shou-li.
Department of Cardiology, The 306thHospital of PLA, Beijing (100101), China

WANG Shou-li, Email: wangsl.63@126.com

Objective: To investigate the effect of atorvastatin on plasma microRNA-143/145 expression in patients with stable angina pectoris (SAP).Methods: A total of 74 SAP patients taken atorvastatin at fi rst time were enrolled in this study, the patients were assigned into 2 groups by the dose of medication: Low dose group, the patients received atorvastatin 20 mg/day, n=36 and Moderate dose group, the patients received atorvastatin 40 mg/day, n=38. Plasma levels of LDL-C and microRNA-143/145 were examined before medication and at 1 month, 12 months after medication respectively. The patients were further divided into another 2 groups by plasma levels of LDL-C: Reach the standard group, plasma LDL-C＜2.60 mmol/L and Not reach the standard group, plasma LDL-C≥2.60 mmol/L. Plasma levels of microRNA-143/145 were measured and compared between 2 groups.Results:① Compared with baseline condition, plasma levels of microRNA-143/145 were increased in both groups after medication, P＜0.001 the levels in Moderate dose group were higher than those in Low dose group at both 1 month and 12 months of time points. ②Plasma levels of LDL-C were decreased with medication in both groups, P＜0.05. Micro RNA-143/145 expression was similar between Reach the standard group and Not reach the standard group, P＞0.05.Conclusion: Atorvastatin could up-regulate plasma microRNA-143/145 expression, which was not related to lipiddecreasing effect.

Atorvastatin; MicroRNA; Stable angina pectoris

2014-03-24）

（編輯：曹洪紅）

100101 北京市，中國人民解放軍第306醫(yī)院 心血管內(nèi)科

趙蓓 主治醫(yī)師 博士 主要研究方向?yàn)楣谛牟〗槿朐\治和心臟超聲 Email: rubyzhao1212@126.com 通訊作者：王守力 Email: wangsl.63@126.com

R541

A

1000-3614（2014）12-0972-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014. 12.004

方法：入選74例首次服用阿托伐他汀的穩(wěn)定性心絞痛患者，隨機(jī)分為兩組，低劑量組（n=36）患者每天服用阿托伐他汀20 mg，中等劑量組（n=38）每天服用阿托伐他汀40 mg。留取用藥前、用藥1個(gè)月及12月時(shí)的靜脈血樣，分別檢測各份血樣的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）；將74例患者按照不同時(shí)間點(diǎn)的LDL-C是否達(dá)標(biāo)分為達(dá)標(biāo)組（LDL-C＜2.60 mmol/L），不達(dá)標(biāo)組（LDL-C≥2.60 mmol/L）；觀察各組microRNA-143/145表達(dá)水平。

結(jié)果：兩組患者服用阿托伐他汀后血漿microRNA-143/145表達(dá)水平均較服用前明顯升高（P＜0.001)；中等劑量組在用藥1個(gè)月和用藥12個(gè)月時(shí)血漿microRNA-143/145表達(dá)水平均高于低劑量組； 阿托伐他汀治療后兩組患者LDL-C均較服用前明顯下降（P＜0.05)，且LDL-C達(dá)標(biāo)組與不達(dá)標(biāo)組的microRNA-143/145表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。

結(jié)論：阿托伐他汀可上調(diào)血漿microRNA-143/145表達(dá)水平，該作用與降脂無明顯關(guān)系。