銀杏外種皮多酚提取工藝及抗氧化性能研究

涂寶軍，李 勇，董玉瑋，陳尚龍

（1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇徐州 221000；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221000）

銀杏外種皮多酚提取工藝及抗氧化性能研究

涂寶軍1，2，李 勇1，董玉瑋1，2，陳尚龍1，2

（1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇徐州 221000；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221000）

以 銀 杏 外 種 皮為 原 料 ，用 乙 醇 為 溶劑 提 取 其 中 的 酚 類(lèi)化 合 物 ，研 究 銀 杏 外 種 皮 多 酚（polyphenol exocarp of ginkgo biloba，PEGB）粗提物的乙醇提取工藝條件及抗氧化性能。選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為乙醇濃度70%，浸提時(shí)間2.6h，浸提溫度90℃，料液比1∶30，此條件下多酚的提取率為5.33mg GAE/g。PEGB粗提物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除能力隨濃度升高而增強(qiáng)。當(dāng)PEGB粗提物濃度為0.5mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH的清除率為84.25%，對(duì)羥基自由基的清除率為78.89%，表明高濃度的PEGB粗提物具有較強(qiáng)的抗氧化性能。

銀杏外種皮，多酚類(lèi)化合物，響應(yīng)面法，抗氧化性

銀杏系銀杏科銀杏屬植物，又名公孫樹(shù)，為我國(guó)特有樹(shù)種。我國(guó)銀杏資源極為豐富，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的90%。銀杏外種皮是銀杏外層較厚的肉質(zhì)層，約占銀杏重量的70%，其化學(xué)成分多樣，主要有黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、萜類(lèi)、聚異戊烯醇類(lèi)等，其中銀杏黃酮、銀杏酚酸等都具有重要的生理活性。以銀杏酚酸為例，其主要存在于銀杏外種皮中[1-2]。Hecke等[3]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏酚酸對(duì)Hcr-15等多種腫瘤細(xì)胞有良好的抑制作用 ；Lee等[4]從 銀杏 外 種皮 的 氯 仿 提取物 中 分 離 得 到銀杏酚酸，顯示其具有極強(qiáng)的磷脂酰肌醇專(zhuān)屬磷脂酶Cr1（PI-PLCr1）抑制活性，同時(shí)還證明銀杏酚酸能抑制多種人癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

多酚類(lèi)化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚性羥基植物成分的總稱(chēng)，包括黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、單寧類(lèi)及花色苷類(lèi)等[5]，具有抗炎抗菌、抗癌、降血糖等多種活性功能，是目前研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[6-7]。銀杏外種皮含有多種多酚類(lèi)物質(zhì)，是一種天然、安全、高效的抗氧化劑來(lái)源。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)銀杏的研究主要集中在其果實(shí)、葉片等部位的活性成分上[8]，而對(duì)銀杏外種皮尤其是針對(duì)其多酚類(lèi)物質(zhì)的研究卻極少。在銀杏果實(shí)采摘中，大量富含抗氧化活性成分的外種皮被當(dāng)作廢棄物扔掉，既污染了環(huán)境，又浪費(fèi)了資源。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)銀杏外種皮多酚提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)其抗氧化性能進(jìn)行了研究，可以為銀杏的綜合利用，特別是制備抗氧化制劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏外種皮 銀杏于2013年10月左右采自徐州工程學(xué)院城南校區(qū)校園內(nèi)，選擇大小適中、成熟度較高且沒(méi)有霉斑、機(jī)械損傷的果實(shí)，擦去表面明顯污物，4℃短期貯藏備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)用刀具制取外種皮；Folin-酚試劑、沒(méi)食子酸、無(wú)水碳酸氫鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸、硫酸亞鐵 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TD24臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；FZ102微型植物粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；R206D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PEGB粗 提物 的 提 取 及 測(cè)定 流 程 銀 杏 外 種皮→清洗→烘干→粉碎（過(guò)60目篩）→乙醇溶液浸提→冷卻→過(guò)濾→離心 （4000r/min）→合并上清液→稀釋定容→Folin-Ciocalte法測(cè)定多酚含量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以銀杏外種皮為原料，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。固定單因素實(shí)驗(yàn)條件：浸提時(shí)間2.5h、浸提溫度80℃、料液比1∶30、乙醇濃度70%，當(dāng)改變其中一個(gè)因素的取值時(shí)，其他因素的取值保持不變。研究乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%），浸提時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h），浸提溫度（50、60、70、80、90℃），料液比（銀杏外種皮∶乙醇，m∶v）（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）對(duì)PEGB粗提物得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化PEGB粗提物提取條件 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇乙醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度三個(gè)因素作為自變量，以提取率為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)曲面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

1.2.4 多酚含量的測(cè)定 多酚含量的測(cè)定參照王桃云等[9]的方法并做適當(dāng)修改。精確稱(chēng)取沒(méi)食子酸50mg配制濃度為0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次吸取0.5、1、2、3、4、5、6、7、8mL置于100mL的棕色容量瓶中，分別加入2.0mL 0.1mol·mL-1Folin-酚試劑，充分混勻，振蕩1min，在0.5～5min內(nèi)加入2mL 10%Na2CO3溶液，混合后用蒸餾水定容至刻度，室溫下避光放置lh，以不加標(biāo)準(zhǔn)液的溶液為空白對(duì)照，在760nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。以沒(méi)食子酸在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C，mg·mL-1），吸光度值為縱坐標(biāo)（A），得標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=0.0096C-0.0097，R2=0.9972。

將不同條件下回流提取得到的各樣品液經(jīng)過(guò)濾、離心后用蒸餾水溶解定容至100mL，準(zhǔn)確量取1mL提取液于10mL具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制步驟進(jìn)行加液，于760nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算樣液中多酚含量，為mg沒(méi)食子酸當(dāng)量/g（mg GAE/g）。

式中，C為提取液濃度，單位g·mL-1；N為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積，單位mL；W為銀杏外種皮重量，單位g。

1.2.5 PEGB粗提物抗氧化性能的測(cè)定

1.2.5.1 清 除DPPH的檢測(cè) 方法 參 照 Moure 等[10]的方法并略作修改。分別將提取物配制成不同濃度的溶液。在10.0mL比色管中加入2.0mL樣品溶液，之后加入2.0mL 8.620×10-5mol/L的DPPH溶液（用無(wú)水乙醇配制），搖勻反應(yīng)30min，以2.0mL DPPH溶液作參比，于517nm處測(cè)定吸光值。以VC作陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算公式為：

式中：A0為空白溶液的吸光值；A為樣品的吸光值。

1.2.5.2 清除羥基自由基的檢測(cè)方法 參照Awika等[11]采用水楊酸自由基法測(cè)定。以VC作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 利用Design Expert 8.05b統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)逐步回歸對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，選取p＜0.05為顯著水平，選取p＜0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)PEGB粗提物得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of PEGB圖2 浸提時(shí)間對(duì)PEGB粗提物得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of PEGB

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)PEGB粗提物得率的影響 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)PEGB粗提物得率的影響如圖1所示?？芍?，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，PEGB粗提物得率呈現(xiàn)“先增后降”的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)PEGB得率為3.50mg GAE/g。繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率逐漸下降。這主要是由于銀杏外種皮多酚在不同濃度溶劑中的溶解性質(zhì)不同 所 致[12]，根 據(jù) 相 似 相 容 原 理 ，說(shuō) 明 PEGB 的 極 性 與70%的乙醇最接近，該體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)克服PEGB作用力的效果最優(yōu)[9，13]。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%左右為宜。

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)PEGB粗提物得率的影響 浸提時(shí)間對(duì)PEGB粗提物得率的影響如圖2所示。可知，在1～2.5h的處理時(shí)間內(nèi)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率隨之增加，當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到2.5h，提取率達(dá)到最大，浸提時(shí)間繼續(xù)增大，到3h時(shí)，提取率將有所下降，但仍高于處理1～2h時(shí)的得率。這一變化趨勢(shì)，與吳克剛[14]、吳蘭蘭等[15]分別對(duì)花生紅衣、龍眼核中多酚乙醇的研究基本一致，表明多酚溶出量與時(shí)間密切相關(guān)，時(shí)間過(guò)短，可能提取不夠充分；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶出減少，而且可能引起多酚結(jié)構(gòu)的變化，使多酚含量下降。因此，本實(shí)驗(yàn)以浸提時(shí)間為2.5h左右為宜。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)PEGB粗提物得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of PEGB圖2 浸提時(shí)間對(duì)PEGB粗提物得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of PEGB

2.1.3 浸提溫度對(duì)PEGB粗提物得率的影響 提取溫度對(duì)PEGB粗提物得率的影響如圖3所示?？梢钥闯觯S著浸提溫度的增加，提取率隨之增加，當(dāng)浸提溫度達(dá)到80℃，提取率達(dá)到最大，此時(shí)提取率為4.05mg GAE/g，浸提溫度繼續(xù)增大，提取率反而呈下降趨勢(shì)。形成這一狀況的原因有多種，可能是由于溫度過(guò)高，原料受熱過(guò)度使得其中淀粉糊化，阻止了提取劑對(duì)多酚的溶出作用，也可能由于高溫導(dǎo)致一部分多酚物質(zhì)發(fā)生分解。因此，浸提溫度選擇在80℃左右。

圖3 浸提溫度對(duì)PEGB粗提物得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on yield of PEGB

2.1.4 料液比對(duì)PEGB粗提物得率的影響 料液比對(duì)PEGB粗提物得率的影響見(jiàn)圖4?？梢钥闯?，隨著料液比的增加，多酚提取率隨之增加，峰值出現(xiàn)在料液比1∶30，此時(shí)多酚提取率達(dá)到4.89mg GAE/g，繼續(xù)加大溶劑量大，多酚提取率略有下降。因此認(rèn)為，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，銀杏外種皮中的多酚已基本溶解在溶劑中，所以，選擇1∶30的料液比，這樣既能夠縮短提取時(shí)間，又能減少試劑用量，同時(shí)還能降低濃縮負(fù)荷。

圖4 料液比對(duì)PEGB粗提物得率的影響Fig.4 Effect of raw material-to-liquid ratio on yield of PEGB

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化PEGB粗提物提取工藝

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 采用Design-Expert軟件，PEGB粗提物提取的Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design matrix and experimental results

2.2.2 模 型 的 建 立 及 其 顯 著 性 檢 驗(yàn) 利 用 Design Expert 8.05b統(tǒng)計(jì)軟件通過(guò)逐步回歸對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得吸光度對(duì)以上3個(gè)因素的二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型：

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，該模型具有高度的顯著性（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.0589＞0.05），R2Adj=0.9705，Adeq. Precision（信噪比）為25.378，遠(yuǎn)大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，實(shí)驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)PEGB粗提物的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面形狀，分析乙醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)提取率的影響。

等高線的形狀反映因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反，即交互作用不顯著，可以忽略。圖5反映了乙醇濃度和浸提時(shí)間的交互作用，呈現(xiàn)橢圓形，表明乙醇濃度與浸提時(shí)間的交互作用顯著，其他交互作用不顯著，這與響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果（表3）基本吻合。

表3 響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for each term in the fitted regression model

圖5 乙醇濃度和浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and extracting time on extraction rate

為了進(jìn)一步確定最佳提取條件，對(duì)所得回歸方程求一階偏導(dǎo)，并令其為0，得優(yōu)化后的最佳提取條件為：乙醇濃度70%、浸提時(shí)間2.6h、浸提溫度90℃，此時(shí)理論預(yù)測(cè)提取率為5.21mg GAE/g。

為了檢驗(yàn)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，在上述優(yōu)化出的最佳提取條件下測(cè)定6次，實(shí)際測(cè)得的平均提取率是5.33mg GAE/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是4.12%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為2.30%。表明基于Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的最佳提取條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 PEGB粗提物抗氧化性能的測(cè)定

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除效果 按1.2.5.1的方法，得到PEGB粗提物和VC清除DPPH自由基的結(jié)果。由圖6可知，VC在0.1mg/mL時(shí)對(duì)DPPH的清除效果即較好，達(dá)到82.72%，此時(shí)PEGB粗提物的清除率僅為25.81%；隨著VC濃度的增加，清除率的增效不明顯；而隨著濃度的增加，PEGB粗提物清除能力提高較大，當(dāng)濃度為0.5mg/mL時(shí)，達(dá)84.25%，具有較好的清除效果?？梢?jiàn)，PEGB粗提物的抗氧化性與其濃度呈正相關(guān)，高濃度的PEGB粗提物對(duì)DPPH自由基的清除 效 果 較 好 ，這 一 結(jié) 論 與Spigno[16]、鄒 家 麗 等[17]分 別對(duì)葡萄渣多酚和山茶花多酚抗氧化性能的研究基本一致。

圖6 對(duì)DPPH·的清除效果Fig.6 Polyphenol compounds scavenging effects on DPPH·

圖7 對(duì)羥基自由基的清除效果Fig.7 Polyphenol compounds scavenging effects on hydroxyl free radical

2.3.2 對(duì)羥基自由基的清除效果 羥基自由基是活性氧中化學(xué)性質(zhì)最活潑的一種。按1.2.5.2的方法，得到PEGB粗提物及VC清除羥基自由基的結(jié)果，如圖7所示。可以看出，當(dāng)PEGB粗提物和VC濃度較低時(shí)（0.1mg/mL），二者清除能力都較弱；隨著濃度的增加，VC清除能力顯著提升，到0.3mg/mL時(shí)已達(dá)85.09%，再增加濃度清除率變化不大。與2.3.1的結(jié)果類(lèi)似，隨著PEGB粗提物濃度的增加，清除率逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明PEGB粗提物對(duì)羥基自由基的清除率與其濃度在一定范圍內(nèi)存在量效依存關(guān)系，即正相關(guān)；當(dāng)PEGB粗提物濃度為0.5mg/mL時(shí)，清除率為78.89%。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PEGB粗提物對(duì)羥基自由基有一定的清除作用，且在濃度較大時(shí)有較好的清除效果。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)單因素與響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了PEGB粗提物提取的優(yōu)化工藝條件為：乙醇濃度70%，浸提時(shí)間2.6h，浸提溫度90℃，料液比1∶30。在此工藝條件下，PEGB粗提物得率達(dá)到5.33mg GAE/g。

3.2 PEGB粗提物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力，且在一定范圍內(nèi)存在量效依存關(guān)系，PEGB濃度越高，清除率越高。當(dāng)PEGB粗提物濃度為0.5mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為84.25%，對(duì)羥基自由基的清除率為78.89%。證明高濃度的PEGB提取物具有較強(qiáng)的抗氧化性能。

3.3 有關(guān)PEGB粗提物的主要成分及含量等有待進(jìn)一步研究，以促進(jìn)PEGB的研究、開(kāi)發(fā)與利用。

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Study on extract process and antioxidant activities of polyphenol from the Ginkgo biloba exocarp

TU Bao-jun1，2，LI Yong1，DONG Yu-wei1，2，CHEN Shang-long1，2
（1.Food Engineering College of Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221000，China；2.The Key laboratory of Jiangsu Food Resource Development and Quality Control，Xuzhou 221000，China）

Ginkgo biloba exocarp being material and ethanol being solution to extract phenolic compounds ，the ethanol extraction conditions and oxidation resistance of crude extract from the ginkgo biloba exocarp （PEGB）were studied.Taking ethanol volume fraction，extracting time and temperature as well as ratio of solid to liquid to conduct single factor experiment，the extraction conditions were further optimized with response surface methodology.The results showed that the optimal extraction conditions were as follows：ethanol concentration 70%，extracting time 2.6h，temperature 90℃ and ratio of solid to liquid 1∶30.The extracting rate of crude extract was 5.33mg GAE/g under such conditions.The scavenging effect of PEGB crude extract on DPPH and hydroxyl radicals was enhanced with increased concentration.When the concentration of PEGB crude extract was 0.5mg/mL，the clearance rate for DPPH was 84.25%and 78.89%for hydroxyl radicals.It showed that high concentrations of PEGB crude extract had strong antioxidant properties.

ginkgo biloba exocarp；polyphenol compounds；response surface methodology；anti-oxidative

TS255.1

B

1002-0306（2014）20-0340-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.066

2014－01－17

涂寶軍（1981-），男，博士在讀，講師，研究方向：植物提取物及抗氧化性能。

徐州市科技計(jì)劃（XF13C017）資助項(xiàng)目。