響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)蝦青素假單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基

劉 艷，馮 印，莫 言，閔偉紅，馬景喜，*

（1.長(zhǎng)春科技學(xué)院，生物食品學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130600；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118）

響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)蝦青素假單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基

劉 艷1，馮 印1，莫 言1，閔偉紅2，馬景喜1，*

（1.長(zhǎng)春科技學(xué)院，生物食品學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130600；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118）

利用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)蝦青素菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方。最佳的培養(yǎng)基配方為KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%，在此發(fā)酵條件下蝦青素產(chǎn)量最高，為149.4mg/L。同時(shí)建立蝦青素產(chǎn)量與KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母膏、可溶性淀粉的添加量之間的二次多項(xiàng)式模型，該模型可以很好地預(yù)測(cè)蝦青素產(chǎn)量，可獲得最佳的工藝條件。

蝦青素，假單胞菌，培養(yǎng)基優(yōu)化，響應(yīng)面

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中，從土壤中篩選出產(chǎn)蝦青素的假單胞菌株并對(duì)其進(jìn)行誘變得到了一株高產(chǎn)蝦青素的假單胞菌株（CTD004），其蝦青素的細(xì)胞產(chǎn)率可達(dá)到119mg/L。顯示該菌株具有很強(qiáng)的蝦青素生產(chǎn)能力。因此，為了進(jìn)一步提高CTD004菌株的蝦青素生產(chǎn)能力和產(chǎn)業(yè)化利用價(jià)值，本研究利用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)蝦青素假單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CTD004菌株（自命名，經(jīng)初步鑒定屬于沼澤紅假單胞菌） 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品 購于Sigma公司；二甲基亞砜、氯仿、甲醇、冰醋酸、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O 均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

AUY220型分析天平SHIMADZU PHILIPPINES；Z36HK型高速冷凍離心機(jī) 德國HERMLE公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CL-32L型高壓蒸汽滅菌器 日本ALP公司；HZQ-C型空氣恒溫振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g，酵 母 膏2g，瓊 脂20g，定 容 至1L蒸 餾水中，pH7.2～7.5，121℃，滅菌20min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g ，酵 母 膏 2g，定 容 至 1L 蒸 餾 水 中 ，pH7.2～7.5，121℃，滅菌20min。

式中:Yk是隨機(jī)高度;X和Z分別是射程和方向散布;k是隨機(jī)高度編號(hào)1～10;rk是-0.05至0.05之間符合均勻分布的10個(gè)隨機(jī)數(shù)(由蒙特卡洛法生成)；n為隨機(jī)數(shù)的個(gè)數(shù)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 1g，酵 母 膏2g，定 容 至 1L 蒸 餾 水 中 ，pH7.2～7.5，121℃，滅菌20min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培 養(yǎng) 方 法 將 斜 面 保 存 的 菌 種 接 入 裝 有30mL/250mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中，160r/min、30℃培養(yǎng)12h進(jìn)行活化。將活化的菌液裝入50mL/500mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，160r/min、30℃培養(yǎng)72h，取發(fā)酵液測(cè)定蝦青素的含量。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

1.3.2.1 可溶性淀粉和酵母膏添加量的確定 選擇可溶性淀粉添加量為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，其他同發(fā)酵培養(yǎng)基，單因素實(shí)驗(yàn)選擇最佳的可溶性淀粉添加量；選擇酵母膏添加量為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%其他同發(fā)酵培養(yǎng)基，單因素實(shí)驗(yàn)選擇最佳的酵母膏添加量。

1.3.2.2 MgSO4·7H2O和KH2PO4添加量的確定 選擇MgSO4·7H2O 添 加 量 為 0.05% 、0.1% 、0.15% 、0.2% 、2%、0.25%其他同發(fā)酵培養(yǎng)基，單因素實(shí)驗(yàn)選擇最佳的MgSO4·7H2O添加量；選擇KH2PO4添加量為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、2%、0.25%，其他同發(fā)酵培養(yǎng)基，單因素實(shí)驗(yàn)選擇最佳的KH2PO4添加量。

1.3.3 蝦青素含量測(cè)定 采用分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量[9]，由于蝦青素是一種細(xì)胞內(nèi)色素，需要混合破壁提取試劑提取。甲醇與氯仿按體積比5∶1配成試劑Ⅰ，冰醋酸與二甲基亞砜按體積比5∶1配成試劑Ⅱ，將試劑Ⅰ與試劑Ⅱ按體積比3∶1配成混合破壁試劑。發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，用蒸餾水洗兩遍，離心得鮮菌體，攪拌后加入混合破壁試劑，環(huán)境溫度為30℃。攪拌，于8000r/min離心10min得提取液，480nm下，以混合破壁試劑作為參比液調(diào)零，測(cè)定其OD值。將OD值代入蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 1.2786x-0.0088（R2=0.9995），即可算出發(fā)酵液中蝦青素的含量。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken 響 應(yīng) 面 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 法[10-15]，以 KH2PO4、MgSO4·7H2O，酵母膏，可溶性淀粉為自變量，分別以X1、X2、X3、X4表示，以蝦青素產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及編碼Table 1 Factors and their coded levels in response surface design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采 用Design-Expert軟 件（Version 7.0 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸和方差分析[16-17]，模型及因素的顯著性均通過F值考察（p＜0.05），所有實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

2.1.1 可溶性淀粉添加量對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響 由圖1可看出，當(dāng)可溶性淀粉添加量為0.5%～1%時(shí)，蝦青素的含量不斷增加，并達(dá)到最大值101.5mg/L，繼續(xù)增加可溶性淀粉添加量，蝦青素的含量逐漸降低。因此，確定可溶性淀粉最佳添加量為1%。

圖1 可溶性淀粉對(duì)菌種產(chǎn)蝦青素的影響Fig.1 Effect of soluble starch addition amount on astaxanthin production by the strain

2.1.2 酵母膏對(duì)菌株產(chǎn)蝦青素的影響 由圖2可看出，當(dāng)酵母膏添加量為0.25%～1%時(shí)，蝦青素的含量不斷增加，并達(dá)到最大值109.5mg/L，繼續(xù)增加酵母膏的添加量，蝦青素的含量逐漸降低。因此，確定酵母膏最佳添加量為1%。

2.1.3 MgSO4·7H2O 的 添 加 量 對(duì) 菌 株 產(chǎn) 蝦 青 素 的 影響 由 圖3可 看 出 ，當(dāng)MgSO4·7H2O添 加 量 為0.05% ～0.1%時(shí)，蝦青素的含量不斷增加，并達(dá)到最大值111.7mg/L，繼 續(xù) 增 加 MgSO4·7H2O 添 加 量 ，蝦 青 素 的含量逐漸降低。因此，確定MgSO4·7H2O最佳添加量為0.1%。

圖2 酵母膏對(duì)菌種產(chǎn)蝦青素的影響Fig.2 Effect yeast powder addition amount on astaxanthin production by the strain

圖3 MgSO4·7H2O的添加量對(duì)菌種產(chǎn)蝦青素的影響Fig.3 Effect of MgSO4·7H2O addition amount onastaxanthin production by the strain

2.1.4 KH2PO4的添加量對(duì)菌株產(chǎn)蝦青素的影響 由圖4可看出，當(dāng)KH2PO4添加量為0.2%～0.3%時(shí)，蝦青素的含量不斷增加，并達(dá)到最大值118.7mg/L，繼續(xù)增加KH2PO4添加量，蝦青素的含量逐漸降低。因此，確定KH2PO4最佳添加量為0.3%。

圖4 KH2PO4的添加量對(duì)菌種產(chǎn)蝦青素的影響Fig.4 Effect of KH2PO4addition amount on astaxanthin production by the strain

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素結(jié)果，采用Design-Expert軟件分別對(duì)KH2PO4、MgSO4·7H2O，酵母膏，可溶性淀粉進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

用Design-Expert軟件，對(duì)表2進(jìn)行多元回歸擬合，可以得到響應(yīng)值影響顯著的回歸方程為：12.85X12-8.07X22-14.69X32-20.89X42，對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，解得X1=0.32，X2=-0.4，X3=-0.36，X4=0.42即可換算得到：KH2PO40.4%，MgSO·47H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%，蝦青素理論產(chǎn)率達(dá)到155.3mg/L。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and corresponding results

對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢查、方差分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果：模型的一次項(xiàng)X4極顯著，X2顯著，其余不顯著，二次項(xiàng)X12、X32、X42極顯著，交互項(xiàng)都不顯著。表明各個(gè)影響因素與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

方差的F值為8.25，Pr＞F值為0.004＜0.001，說明用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系極顯著，即這種方法是可靠的。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9059說明擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知蝦青素產(chǎn)率為149.4mg/L，接近預(yù)測(cè)值155.3mg/L，說明響應(yīng)面法適用于對(duì)蝦青素菌種發(fā)酵工藝條件進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。根據(jù)中心復(fù)合設(shè)計(jì)結(jié)果做出三維響應(yīng)面（圖5～圖8）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model equation

圖5為MgSO4·7H2O和酵母膏對(duì)蝦青素產(chǎn)量的響應(yīng)曲面圖和其投影的等高線圖，等高線圖形狀近乎圓形，表明MgSO4·7H2O和酵母膏兩個(gè)自變量之間交互效應(yīng)較弱。圖6為可溶性淀粉和酵母膏對(duì)蝦青素產(chǎn)量的響應(yīng)曲面圖和其投影的等高線圖，等高線圖形狀近乎圓形，表明可溶性淀粉和酵母膏兩個(gè)自變量之間交互效應(yīng)較弱。圖7為KH2PO4和可溶性淀粉對(duì)蝦青素產(chǎn)量的響應(yīng)曲面圖和其投影的等高線圖，等高線圖形狀近乎圓形，表明MgSO4·7H2O和酵母膏兩個(gè)自變量之間交互效應(yīng)較弱。圖8為MgSO4·7H2O和酵母膏對(duì)蝦青素產(chǎn)量的響應(yīng)曲面圖和其投影的等高線圖 ，等 高 線 圖 形 狀 近 乎 圓 形 ，表 明 MgSO4·7H2O 和 可溶性淀粉兩個(gè)自變量之間交互效應(yīng)較弱。因此表明各個(gè)影響因素與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

圖5 MgSO4·7H2O和酵母膏對(duì)蝦青素產(chǎn)量量的影響Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O and yeast powder addition amount on astaxanthin produced by the strain

圖6 酵母膏和可溶性淀粉對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of starch and yeast powder addition amount on astaxanthin produced by the strain

圖7 KH2PO4和可溶性淀粉對(duì)蝦青素產(chǎn)量量的影響Fig.7 Effect of KH2PO4and starch addition amount on astaxanthin produced by the strain

圖8 MgSO4·7H2O和可溶性淀粉對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of starch and MgSO4·7H2O addition amount on astaxanthin produced by the strain

3 結(jié)論

利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert，通過二次回歸設(shè)計(jì)得到了提高蝦青素產(chǎn)量的CTD004菌株與KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵 母 膏0.3%，可 溶 性 淀 粉1.2%的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)蝦青素得率。在對(duì)影響蝦青素得率的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討后，得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為：KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O 0.08%，酵母膏0.3%，可溶性淀粉1.2%時(shí)，蝦青素的理論值為155.3mg/L，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為149.4mg/L。因此，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)蝦青素菌種發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

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Response surface optimization of fermentation medium for astaxanthin by pseudomonas

LIU Yan1，F(xiàn)ENG Yin1，MO Yan1，MIN Wei-hong2，MA Jing-xi1，*
（1.College of Biological and Food，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130600，China；2.Fermentation Engineering Laboratory，College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Response surface methodology was used to optimize fermentation medium for astaxanthin production by the strain.The highest astaxanthin yield of 149.4mg/L was achieved under the following conditions：KH2PO40.4% ，MgSO4·7H2O 0.08% ，yeast powder 0.3%and soluble starch 1.2%.In addition，the established regression model was found to had good effectiveness in predicting astaxanthin yield.

astaxanthin；pseudomonas；fermentation medium；response surface

TS202.3

A

1002-0306（2014）20-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.032

2014－03－12

劉艷（1981-），女，碩士研究生，講師，研究方向：微生物發(fā)酵。

* 通訊作者：馬景喜（1981-）男，碩士研究生，講師，研究方向：功能性食品。

吉林省教育廳項(xiàng)目（2010-515）。